噬菌體納米抗體展示庫構(gòu)建中電轉(zhuǎn)化條件的優(yōu)化

李艷寧，李光琪，屈昱良，潘俊斐，楚元奎，張曉春，徐廣賢，3

（1.寧夏醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，銀川 750004；2.寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院兒科，銀川 750004；3.廣東醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院醫(yī)學(xué)檢驗系，東莞 523000）

納米抗體是存在于駱駝科體內(nèi)的一種天然缺失輕鏈的重鏈抗體（heavy chain variable area，VHH），具有分子量小、特異性高、易通過血腦屏障等眾多優(yōu)勢，有廣闊的應(yīng)用前景[1]。目前，納米抗體制備所采用的關(guān)鍵技術(shù)是噬菌體表面展示技術(shù)，其原理是通過對目標抗原反復(fù)的“吸附—洗脫—擴增”后，使得噬菌體抗體庫中能與靶分子特異結(jié)合的抗體得到高度富集[2]，一個庫容量大及多樣性好的噬菌體納米抗體庫是獲得特異性抗體的關(guān)鍵所在，特別是針對天然抗體庫而言至關(guān)重要。而影響抗體庫質(zhì)量的主要因素除了需要特異性好的PCR引物外，高轉(zhuǎn)化效率也是實現(xiàn)構(gòu)建有效噬菌體抗體庫的關(guān)鍵[3]。

目前，電轉(zhuǎn)化法是構(gòu)建抗體庫的最佳途徑，也是分子生物學(xué)中的常用技術(shù)，廣泛應(yīng)用于外源基因的表達、基因克隆及定位等研究[4]。該技術(shù)的主要原理是在瞬間強大電壓的作用下，溶液中細胞的細胞膜具有了一定的通透性，從而使帶電的外源物質(zhì)以類似電泳的方式進入細胞膜[5]。在不同實驗室環(huán)境的影響下，感受態(tài)細胞的制備以及轉(zhuǎn)化條件都有所不同，故轉(zhuǎn)化效率也存在差異，

因此，應(yīng)該根據(jù)實際情況，對電轉(zhuǎn)化條件進行優(yōu)化進而探索最佳轉(zhuǎn)化條件，提高轉(zhuǎn)化效率。影響電轉(zhuǎn)化效率的因素頗多，除了細菌的生長狀態(tài)及外源物質(zhì)的質(zhì)量外[6]，電壓影響細胞膜的穿透性或外源分子與細胞膜的融合[7]，T4 DNA連接酶也會降低轉(zhuǎn)化效率[8]。此外，電轉(zhuǎn)化結(jié)果受到眾多因素的綜合影響，實際上各個因素不是孤立存在的，而是相互聯(lián)系、相互作用的。為此，本研究旨在利用Bio-Rad公司的電轉(zhuǎn)化儀，對DNA電轉(zhuǎn)化條件進行優(yōu)化，得到最大轉(zhuǎn)化效率。據(jù)此，建立高質(zhì)量的天然噬菌體抗體基因庫，便于下一步的篩選。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要儀器、試劑與培養(yǎng)基0.2 cm電轉(zhuǎn)化杯、基因電穿孔儀及MyCycler PCR儀（Bio-Rad公司）；Nanodrop 2000、雙光束紫外可見分光光度計TU-1901（Thermo公司）；恒溫培養(yǎng)箱、臺式高速低溫離心機（力康公司）。限制性內(nèi)切酶Not I、Sif I及T4 DNA連接酶（NEB公司）；DNA回收試劑盒（TIANGEN公司）；2×YT培養(yǎng)基、SOC培養(yǎng)基，均按常規(guī)配方配制；其余試劑均為分析純。

1.1.2 菌株與質(zhì)粒 大腸桿菌TG1和噬菌體質(zhì)粒pCANTAB5e（4522 bp，Amp抗性）為本實驗室保存，駝源VHH DNA片段為本實驗室自行擴增，長約400 bp。

1.2 方法

1.2.1 目的片段與質(zhì)粒的酶切及連接 采用限制性內(nèi)切酶Not I、Sif I分別對VHH DNA片段及質(zhì)粒pCANTAB5e進行酶切，總體系30μL，條件為37℃反應(yīng)1 h，50℃反應(yīng)1 h，之后分別采用2%及1%的瓊脂糖凝膠電泳驗證，用DNA回收試劑盒回收酶切后目的片段，并在10μL連接體系中，噬菌體質(zhì)粒pCANTAB5e與駝源VHH片段按照摩爾比為3∶1的比例，用1μL的T4 DNA連接酶于4℃進行過夜連接，待測定濃度后保存于-20℃?zhèn)溆?，即本文中所述的外源DNA。

1.2.2 T4 DNA連接酶的去除 取出部分連接產(chǎn)物，采用乙醇沉淀法去除T4 DNA連接酶，具體步驟如下：取出連接產(chǎn)物，加入1/10體積3 M的NaAc（pH5.2），2.5倍體積預(yù)冷的無水乙醇，混勻后在-20℃靜置30～60 min。然后4℃，13000×g離心10 min，棄上清，用70%的乙醇洗滌沉淀1次，并將產(chǎn)物置于超凈工作臺中待乙醇充分揮發(fā)后，加入適量ddH2O以溶解沉淀并測定濃度后，于-20℃保存。

1.2.3 電感受態(tài)細胞的制備 從-80℃冰箱取出大腸桿菌TG1甘油菌，劃線接種于2×YT固體平板上于37℃培養(yǎng)10 h，挑取單個菌落接種于3 mL的2×YT液體培養(yǎng)基中，37℃，200 r·min-1振蕩培養(yǎng)過夜。次日，按1∶100比例將菌液放大培養(yǎng)于含200 mL的2×YT培養(yǎng)基的錐形瓶中，繼續(xù)于37℃培養(yǎng)一定時間，后將菌液收集在50 mL離心管中，于冰上靜置1 h，9000 r·min-1，4℃離心10 min，棄上清用相同體積提前預(yù)冷的去離子水重懸菌體沉淀，離心，重復(fù)一次。然后用提前預(yù)冷的10%的甘油重懸菌體并離心。用1 mL 10%的甘油（預(yù)冷的純水配制）混懸菌體沉淀，并分裝在提前預(yù)冷的1 mL EP管中，每管100μL，立即轉(zhuǎn)至-80℃冰箱保存，此即為TG1電感受態(tài)細胞。注意：所有步驟在超凈工作臺中進行。

1.2.4 電轉(zhuǎn)化 從-80℃冰箱中取出大腸桿菌處于不同生長時期時制備的感受態(tài)細胞。在冰上融化100μL的TG1感受態(tài)細胞，然后按照設(shè)定的不同條件，加入一定量的連接產(chǎn)物混勻并靜置5 min，接著轉(zhuǎn)入提前預(yù)冷的電轉(zhuǎn)化杯中，并設(shè)定電轉(zhuǎn)化條件進行電轉(zhuǎn)化，向電擊后的細胞中立即添加1 mL預(yù)熱的SOC培養(yǎng)基并轉(zhuǎn)至1mL離心管中，37℃，220 r·min-1振蕩培養(yǎng)1 h，然后取少量菌液倍比稀釋后涂布于含氨芐青霉素100μg·mL-1的SOC固體平板上，按照設(shè)定的不同培養(yǎng)溫度過夜培養(yǎng)，次日計數(shù)菌落個數(shù)并計算轉(zhuǎn)化效率，其中，轉(zhuǎn)化效率（CFU/μg DNA）=菌落數(shù)/DNA量（ng）×稀釋倍數(shù)×1000，每組實驗重復(fù)三次，取平均值。

2 結(jié)果

2.1 目的片段與質(zhì)粒的酶切

分別采用1%、2%的瓊脂糖凝膠電泳對酶切后的VHH片段及噬菌體質(zhì)粒pCANTAB5e進行驗證并回收目的片段，其中酶切結(jié)果見圖1。

圖1 目的片段與質(zhì)粒的酶切鑒定圖

2.2 細菌生長階段對轉(zhuǎn)化效率的影響

分別取OD600值為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0的TG1菌液制備100μL的感受態(tài)細胞，將加入1μg連接產(chǎn)物的感受態(tài)細胞在電轉(zhuǎn)化儀預(yù)設(shè)條件（電容25μF、電阻200Ω、電壓2.5 kV）下進行電轉(zhuǎn)化，結(jié)果見圖2。經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)，當細菌處于生長對數(shù)期（OD600值為0.4左右）時，達到最高轉(zhuǎn)化效率，隨著生長時間的延長，轉(zhuǎn)化效率明顯下降，這可能是因為當大腸桿菌處于對數(shù)生長期時，菌體的繁殖速度快，生命力旺盛，對電擊的損傷修復(fù)能力強，所以經(jīng)電擊后的細胞存活率相對較高。

圖2 細菌生長狀態(tài)對轉(zhuǎn)化效率的影響

2.3 電壓對轉(zhuǎn)化效率的影響

按照2.2中的實驗結(jié)果，當TG1菌液的OD600在0.4左右時制備感受態(tài)細胞，分別設(shè)置電壓為1.8、2.1、2.3、2.5 kV，將1μg的連接產(chǎn)物與100μL感受態(tài)細胞混合，在25μF電容、200Ω電阻下使用0.2 cm電轉(zhuǎn)化杯進行電轉(zhuǎn)化，當電壓在2.3 kV時獲得最大轉(zhuǎn)化效率。見圖3。

圖3 電壓對轉(zhuǎn)化效率的影響

2.4 連接產(chǎn)物質(zhì)量對電轉(zhuǎn)化效率的影響

為了比較不同質(zhì)量的外源基因?qū)Ω惺軕B(tài)細胞的電轉(zhuǎn)化效率是否存在影響，分別取質(zhì)量為0.3、0.5、0.7和1.0μg的連接產(chǎn)物電轉(zhuǎn)化至100μL感受態(tài)細胞中進行電轉(zhuǎn)，見圖4。可見，隨著連接產(chǎn)物質(zhì)量的增加，電轉(zhuǎn)化效率也逐漸提高，當連接產(chǎn)物的質(zhì)量大于0.7μg時，轉(zhuǎn)化效率并未得到提升。

圖4 連接產(chǎn)物質(zhì)量對電轉(zhuǎn)化效率的影響

2.5 T4 DNA連接酶對轉(zhuǎn)化效率的影響

依據(jù)本文2.2～2.4的研究結(jié)果，當TG1菌液的OD600在0.4左右時制備感受態(tài)細胞，將0.7μg經(jīng)T4 DNA連接酶去除前的連接產(chǎn)物及T4連接酶去除后的連接產(chǎn)物分別與100μL感受態(tài)細胞混合，在2.3 kV電壓、25μF電容、200Ω電阻下使用0.2 cm電轉(zhuǎn)化杯進行電轉(zhuǎn)化，結(jié)果見圖5。可見，經(jīng)乙醇沉淀法除去T4 DNA連接酶后，相比于T4 DNA連接酶去除前（2.2×107CFU/μg），轉(zhuǎn)化效率提升（7.9×107CFU/μg）。

圖5 T4 DNA連接酶去除前后對轉(zhuǎn)化效率的影響

2.6 電轉(zhuǎn)化后培養(yǎng)溫度對電轉(zhuǎn)化效率的影響

經(jīng)電轉(zhuǎn)化并孵育結(jié)束后的菌液取適量均勻涂布于含100μg·mL-1Amp的SOC固體平板上，并隨機分成兩組，一組置于37℃過夜培養(yǎng)，另一組于30℃過夜培養(yǎng)，次日對克隆數(shù)進行統(tǒng)計并計算轉(zhuǎn)化效率，發(fā)現(xiàn)兩組轉(zhuǎn)化效率無差異。見圖6。

圖6 電轉(zhuǎn)化后培養(yǎng)溫度對電轉(zhuǎn)化效率的影響

3 討論

構(gòu)建噬菌體納米抗體庫是基于特定抗原篩選相應(yīng)抗體的一個重要方法，相比于免疫庫，天然納米抗體庫避免了免疫動物的繁瑣過程，同時理論上可篩選出針對任何抗原的抗體。納米抗體庫的高庫容量是篩選抗體的基本保障，然而要成功構(gòu)建一個容量大的抗體庫，首要任務(wù)是提高轉(zhuǎn)化效率?？捎糜谵D(zhuǎn)化的方法很多，如氯化鈣法、Hanahan法和Inoue法，但這些方法操作復(fù)雜，轉(zhuǎn)化效率偏低，且結(jié)果重復(fù)性差[9]。電轉(zhuǎn)化技術(shù)是目前為止最為有效的轉(zhuǎn)化方法，轉(zhuǎn)化效率高，重復(fù)性好，結(jié)果穩(wěn)定[10]。該方法幾乎適用于所有細胞類型，但不同細胞系有不同的最佳電轉(zhuǎn)條件，不同實驗室轉(zhuǎn)化效率也有所區(qū)別，因而優(yōu)化電轉(zhuǎn)條件得到相對穩(wěn)定的標準化操作方法十分必要。

選用對數(shù)生長期的感受態(tài)細胞是提高電轉(zhuǎn)化效率的一個重要因素。實驗結(jié)果表明，當TG1菌處于對數(shù)生長早期，即OD600在0.4左右時，達到最高轉(zhuǎn)化效率，隨著細菌的老化，轉(zhuǎn)化效率有明顯的下降趨勢，所以制備電轉(zhuǎn)化用感受態(tài)細胞時，應(yīng)嚴格掌握菌液的OD600值，以保證較高的轉(zhuǎn)化效率。正如文獻[11]所述，處于對數(shù)生長期的細菌雖然對電擊敏感，死亡率較高，但存活的細菌中其轉(zhuǎn)化子數(shù)量較高。當細菌進入對數(shù)生長后期，雖然細胞存活率上升，但轉(zhuǎn)化效率逐漸下降，因此電轉(zhuǎn)化的細菌以培養(yǎng)到對數(shù)期較為合適。

電壓是決定電轉(zhuǎn)化效率的最主要原因。高電壓可瞬間擊穿細胞膜并形成能讓外源物質(zhì)進入的小孔，由于強電壓會對細胞造成極大的損傷，在此過程中一部分細胞會因此受損而死亡使得轉(zhuǎn)化率降低，并且死亡菌體會嚴重影響細菌的生存空間從而抑制細菌的生長[12]。因此，選擇合適的電壓是提高轉(zhuǎn)化效率并達到預(yù)期效果的關(guān)鍵。本實驗中設(shè)置電壓在1.8~2.5 kV進行電轉(zhuǎn)化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當電壓為2.3 kV時，電轉(zhuǎn)化效率最好，而電壓低于或高于2.3 kV時，轉(zhuǎn)化效率均不同程度降低。

電轉(zhuǎn)化時外源DNA含量對電轉(zhuǎn)化效率也具有很大的影響[13]。本實驗中，在100μL感受態(tài)細胞中分別加入0.3、0.5、0.7和1.0μg等不同含量的外源基因進行電轉(zhuǎn)化，當其含量在0.7μg時電轉(zhuǎn)化效率最高。此外，在一定范圍內(nèi)，電轉(zhuǎn)化效率與外源DNA的用量呈現(xiàn)正向發(fā)展趨勢，但當加入的外源DNA的量過多時，轉(zhuǎn)化效率將會下降，說明感受態(tài)細胞達到飽和狀態(tài)。

T4 DNA連接酶在一定程度上也會影響轉(zhuǎn)化效率。研究表明，T4 DNA連接酶以共價作用與DNA結(jié)合，同時具有拓撲異構(gòu)酶的活性，可打開超螺旋DNA的一條鏈，使其變成單切口環(huán)狀，然后進行連接修復(fù)。較小的質(zhì)粒容易進入細菌，而超螺旋DNA較單切口環(huán)狀DNA更易進入細菌，T4 DNA連接酶與DNA結(jié)合而形成的大分子復(fù)合物以及隨后的超螺旋DNA解旋成為單切口環(huán)狀很可能是T4 DNA連接酶導(dǎo)致電轉(zhuǎn)化效率降低的主要原因[14]，因此，在電轉(zhuǎn)化過程中，應(yīng)盡量去除T4 DNA連接酶。

電轉(zhuǎn)化技術(shù)應(yīng)用廣泛，目前對電轉(zhuǎn)化方面的探索也較多，有研究報道，感受態(tài)細胞的濃度、質(zhì)粒的大小及構(gòu)象也會影響電轉(zhuǎn)化效率[15]，因此，有必要對電轉(zhuǎn)化條件進行優(yōu)化。本實驗得出的最優(yōu)條件：在大腸桿菌TG1處于生長對數(shù)早期（OD600約為0.4）時制備電感受態(tài)細胞，連接產(chǎn)物用乙醇沉淀法去除T4 DNA連接酶后取0.7μg，在電壓2.3 kV、電容25μF、電阻200Ω的條件下采用0.2 cm的電擊杯對混合后的菌液進行電轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化效率都可以保證在107CFU/μg DNA左右，最高可達7.9×107CFU/μg DNA。雖然該轉(zhuǎn)化效率仍然偏低，但基本符合構(gòu)建噬菌體抗體庫的要求。另外，可通過多次電轉(zhuǎn)化從而得到更大的抗體庫庫容，為后續(xù)抗體的篩選奠定良好平臺。