滌痰蕩瘤湯調(diào)節(jié)ERK2/ETS1/MMP9通路抑制裸鼠胃癌移植瘤生長

孫 琪，王 華，郭 維

（1.寧夏醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，銀川 750004；2.寧夏少數(shù)民族醫(yī)藥現(xiàn)代化教育部重點實驗室，銀川 750004）

中國的胃癌發(fā)病率在全球占比約40%[1]。盡管近年來死亡率有降低趨勢[2]，但由于發(fā)病人數(shù)增加，胃癌依然是嚴重影響人民健康的惡性疾病。中藥治療胃癌能體現(xiàn)增效減毒，提高免疫力，改善患者生存質(zhì)量等優(yōu)勢作用。中醫(yī)理論提出胃的生理病理有兩個主要特點，即“脾胃為生痰之源”“六腑以通為用，以降為順”?；诖?，本文胃癌的核心病機為“痰濁阻滯，腑氣不通”，提出采用“化痰通腑法”治療胃癌。臨床中以“消痰散結(jié)方”為基礎(chǔ)結(jié)合個人經(jīng)驗擬定“滌痰蕩瘤湯”，該方由半夏、天南星、瓜蔞、酒大黃等藥物組成，有化痰散結(jié)、通腑降氣之功。臨床中運用該方治療胃癌取得較好效果，能明顯改善患者癥狀及生活質(zhì)量。

microRNA在胃癌發(fā)病過程中發(fā)揮了重要調(diào)控作用，在消化道腫瘤中microRNA-506-3p顯示低表達狀態(tài)，通過提高其表達可抑制腫瘤生長，對腫瘤防治有重要意義[3-4]。microRNA-506-3p可通過靶向調(diào)控胞外信號調(diào)節(jié)激酶2（ERK2）/E26轉(zhuǎn)錄因子1（ETS1）/基質(zhì)金屬蛋白酶9（MMP9）通路，進而調(diào)控腫瘤細胞的增殖和轉(zhuǎn)移[5]。上述這些研究結(jié)果提示microRNA-506-3p及其調(diào)控的ERK2/ETS1/MMP9信號通路可能是藥物作用的靶點。為深入闡明滌痰蕩瘤湯有效抑制胃癌細胞的增殖和遷移的作用機制，本文探討滌痰蕩瘤湯對人胃癌細胞裸鼠胃原位移植瘤的抑瘤作用及其對microRNA-506-3p和ERK2/ETS1/MMP9信號通路的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 主要試劑及藥物 滌痰蕩瘤湯藥物組成：清半夏15 g，天南星15 g，瓜蔞9 g，酒大黃3 g，浙貝10 g，生牡蠣30 g，全蝎6 g，地龍6 g，守宮6 g，海螵蛸15 g，甘草9 g。上方制成濃度為0.81 g·mL-1的水煎劑（該濃度由人與小鼠給藥劑量換算所得，前期預(yù)實驗中通過MKN45細胞胃癌原位移植瘤模型證明該濃度為最佳抑瘤濃度，因此本實驗所用中藥均采用此濃度，具體見表1。由寧夏醫(yī)科大學(xué)附屬回醫(yī)中醫(yī)醫(yī)院提供；注射用5-氟尿嘧啶（5-FU）（上海旭東海普藥業(yè)有限公司）。

microRNANA熒光定量試劑盒（SYBR Green）購自北京天根公司；ETS1 Antibody（66598-1-Ig）、MMP9 Antibody（10375-2-AP）、Anti-β-Actin Mouse Monoclonal Antibody（66009-1-Ig）購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；Erk2 Antibody（9108）購自德國CST公司；Goat anti-Mouse IgG Secondary Antibody HRP conjugated（L3032）、Goat anti-Rabbit IgG Secondary Antibody HRP conjugated（L3012）購自艾克索生物科技股份有限公司；ECL發(fā)光液（RPN2232）購自美國GE公司；全蛋白提取試劑盒、BCA蛋白含量檢測試劑盒購自南京凱基公司；蛋白Marker購自美國Thermo公司。

表1 不同濃度中藥的抑瘤率（±s）

表1 不同濃度中藥的抑瘤率（±s）

與空白組比較ΔP＜0.05；與低濃度組比較#P＜0.05；與中濃度組比較▲P＞0.05。

組別 中藥濃度/（g·mL-1） 瘤質(zhì)量/g抑瘤率/%空白組 0 4.86±0.22 —低濃度中藥組 0.41 3.17±0.15Δ 34.78中濃度中藥組 0.81 2.29±0.09Δ# 52.88高濃度中藥組 1.62 2.21±0.05Δ▲ 54.52

1.1.2 動物及細胞SPF級無胸腺BALB/C雄性裸鼠80只，體質(zhì)量（20±2）g，4～6周齡，在寧夏醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心SPF級條件下飼養(yǎng)［許可證號SCXK（京）2016-0006］。人胃癌細胞系MKN45、BCG823來自中國科學(xué)院上海生科院細胞資源中心。

1.2 模型制備及分組

對數(shù)期細胞配成為1×107cells/100μL細胞懸液接種于裸鼠皮下（0.2 mL/只），待瘤體長至直徑約1 cm時取出瘤塊切成1 mm3大小瘤塊移植于另一只裸鼠皮下，等長至1 cm時根據(jù)上述過程皮下反復(fù)傳代3次。裸鼠胃部接種術(shù)前禁食12 h，10%水合氯醛麻醉，皮膚消毒后切開暴露裸鼠胃部。劃開幽門近胃竇血管豐富區(qū)，看到出血后將腫瘤組織（1 mm3）蘸取OB吻合膠粘合接種于此并逐層關(guān)腹，造模48 h后對60只裸鼠隨機分組。因術(shù)后死亡，最終MKN45細胞動物入組數(shù)量為中藥組8只（化痰散結(jié)方0.4 mL/20 g，1次/日，IG），西藥組9只（5-FU 25 mg/kg，1次/2日，IP），空白組8只（生理鹽水0.4 mL/20 g，1次/日，IG），BCG823細胞動物數(shù)量為中藥組、西藥組、空白組各9只，連續(xù)給藥6周。

1.3 一般情況及腫瘤增殖、轉(zhuǎn)移計算

實驗前后分別稱取各組裸鼠體質(zhì)量，實驗過程中觀察裸鼠的活動度、飲食情況、精神狀態(tài)和腹部情況。停藥后將裸鼠處死，開腹觀察腫瘤生長情況并稱重。計算抑瘤率=［1-（實驗給藥組平均瘤重/模型對照組平均瘤重）］×100%。發(fā)現(xiàn)腹水、腹腔淋巴結(jié)腫大、面部腫塊或其他器官腫瘤病灶中任何一項均視為轉(zhuǎn)移，轉(zhuǎn)移率=（本組有轉(zhuǎn)移灶動物數(shù)量/本組動物總數(shù)量）×100%。

1.4 qPCR檢測

qPCR技 術(shù) 檢 測microRNA-506-3p、ETS1、ERK2、MMP9的mRNA基因表達，以β-actin和U6為內(nèi)參。qPCR反應(yīng)條件1×循環(huán)，95℃，15 min（起始模板變牲）；40×循環(huán)：94℃，20 s（PCR循環(huán)中模板變性）；60℃，34 s（退火延伸）。實驗所得相關(guān)數(shù)據(jù)，以2–ΔΔCT法進行分析。引物序列見表2。

表2 引物序列

1.5 Western blot檢測

Western blot技 術(shù) 檢 測ERK2、ETS1、MMP9蛋白表達。動物給藥結(jié)束后，Lysis Buffer緩沖液提取癌組織中蛋白質(zhì)，BCA蛋白濃度檢測試劑盒測定蛋白質(zhì)含量。將蛋白樣品加入8% SDSPAGE凝膠中分離蛋白質(zhì)，分離后將蛋白轉(zhuǎn)膜到PVDF膜上。轉(zhuǎn)膜成功后，室溫下將PVDF膜置于封閉液內(nèi)2 h；4℃下置于抗體孵育盒（盒中加入稀釋的一抗工作液）過夜。抗體工作液濃度為ERK2，1∶1000；TS1，1∶3000；MMP，1∶600，β-actin，1∶20000。孵育后用1×PBST洗脫3次，再用二抗孵育60 min，洗膜5次。把膜置于暗盒中，將A、B兩種發(fā)光劑等體積混勻并滴加于膜上，室溫反應(yīng)。WB爆光儀將蛋白條帶顯影。Image Lab軟件對條帶灰度值定量分析。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)采用Graphpad Prism 8.0軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，符合正態(tài)分布且方差齊性者采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t法檢驗。檢驗水準α=0.05。

2 實驗結(jié)果

2.1 一般情況觀察

實驗觀察顯示，MKN45空白組裸鼠飲食、活動度略差，反應(yīng)遲鈍，后期出現(xiàn)明顯消瘦、弓背、腹部膨隆，取材可見腹股溝及腸系膜等腹腔淋巴結(jié)腫大，部分動物出現(xiàn)腹水或面部腫物，轉(zhuǎn)移率63%（5/8）；中藥組裸鼠飲食、活動度尚可，腹部膨隆，轉(zhuǎn)移率38%（3/8）；西藥組裸鼠相繼出現(xiàn)食欲、活動度差，反應(yīng)遲鈍，腹部膨隆，轉(zhuǎn)移率22%（2/9）。BCG823空白組飲食、活動度略差，反應(yīng)略遲鈍，無腹水；中藥組活動度及飲食尚可，無腹水；西藥組活動度及飲食較差，反應(yīng)遲鈍，無腹水。實驗結(jié)束時測量體質(zhì)量，治療后MKN45及BCG823動物模型均顯示中藥組及西藥組與空白組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P均＜0.05），中藥組與西藥組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），動物體質(zhì)量由高到低依次是：中藥組＞空白組＞西藥組。與西藥組和空白組比較，中藥組裸鼠活動度、食欲及體質(zhì)量等一般情況較好，提示中藥能夠改善荷瘤鼠生活質(zhì)量。見表3。

表3 各組裸鼠治療前與治療后體質(zhì)量（±s，g）

表3 各組裸鼠治療前與治療后體質(zhì)量（±s，g）

治療后與空白組比較ΔP＜0.05；治療后與西藥組比較▲P＜0.05。

組別 治療前 治療后MKN45空白組 22.3±1.50 24.9±2.33 MKN45西藥組 21.8±1.05 21.3±2.47Δ MKN45中藥組 21.5±1.55 28.8±2.60Δ▲BCG823空白組 21.9±1.82 25.2±2.32 BCG823西藥組 21.6±1.84 22.8±2.29Δ BCG823中藥組 22.1±1.39 28.9±2.98Δ▲

2.2 抑瘤率

中藥組和西藥組移植瘤質(zhì)量與空白組相比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P均＜0.01）。中藥組與西藥組比較，移植瘤質(zhì)量差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。MKN45組西藥和中藥的抑瘤率分別為60.4%和45.1%，BCG823組西藥和中藥的抑瘤率分別為66.6%和51.1%。見表4。

表4 各組裸鼠移植瘤質(zhì)量、抑瘤率（±s）

表4 各組裸鼠移植瘤質(zhì)量、抑瘤率（±s）

與空白組比較ΔP＜0.01；與西藥組比較▲P＜0.05。

組別 瘤質(zhì)量/g 抑瘤率/%MKN45空白組 5.13±1.25 —MKN45西藥組 2.03±0.47Δ 60.4 MKN45中藥組 2.82±0.53Δ▲ 45.1 BCG823空白組 3.68±0.73 —BCG823西藥組 1.23±0.50Δ 66.6 BCG823中藥組 1.80±0.33Δ▲ 51.1

2.3 qPCR檢測

在MKN45、BCG823移植瘤中，與空白組比較，中藥組和西藥組microRNA-506-3p表達上調(diào)（P均＜0.01），ERK2、ETS1表達降低（P均＜0.01）；與西藥組比較，中藥組microRNA-506-3p表達降低（P均＜0.01），ERK2、ETS1表達升高（P均＜0.01）。在MKN45移植瘤中，三組MMP9的表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。在BCG823移植瘤中，MMP9表達西藥組和中藥組均低于空白組（P均＜0.01），西藥組低于中藥組（P＜0.01）。見表5、表6。

表5 MKN45組織中各組mRNA的表達水平（±s）

表5 MKN45組織中各組mRNA的表達水平（±s）

與空白組比較▲P＜0.01；與西藥組比較△P＜0.01。

組別 n中藥組 8西藥組 9空白組 8 microRNA-506-3p ERK2 ETS1 MMP9 1.26±0.10▲△ 1.13±0.21▲△ 1.22±0.22▲△ 1.08±0.22 1.82±0.24▲ 0.49±0.12▲ 0.52±0.15▲ 0.96±0.26 0.48±0.09 2.19±0.34 1.78±0.25 1.06±0.17

表6 BCG823組織中各組mRNA的表達水平（±s）

表6 BCG823組織中各組mRNA的表達水平（±s）

與空白組比較▲P＜0.01；與西藥組比較△P＜0.01。

組別 n中藥組 9西藥組 9空白組 9 microRNA-506-3p ERK2 ETS1 MMP9 1.53±0.14▲△ 0.82±0.08▲△ 0.82±.08▲△ 0.87±0.09▲△1.73±0.19▲ 0.59±0.13▲ 0.57±0.14▲ 0.59±0.16▲0.34±0.15 2.01±0.28 2.07±0.32 1.99±0.29

2.4 Western blot檢測

在MKN45、BCG823移植瘤中，與空白組比較，中藥組和西藥組ERK2、ETS1及MMP9表達降低（P均＜0.01），中藥組ERK2、ETS1及MMP9表達高于西藥組（P均＜0.01）。見表7、圖1、表8、圖2。

表7 MKN45組織中ERK2、ETS1、MMP9蛋白的相對表達量（±s）

表7 MKN45組織中ERK2、ETS1、MMP9蛋白的相對表達量（±s）

與空白組比較▲P＜0.01；與西藥組比較△P＜0.01。

組別 n中藥組 8西藥組 9空白組 8 ERK2 ETS1 MMP9 0.82±0.1▲△0.70±0.06▲△0.82±0.07▲△0.5±0.02▲0.42±0.03▲0.48±0.07▲1 1 1

圖1 MKN45組織中ETS1、ERK2、MMP9蛋白的表達

表8 BCG823組織中ERK2、ETS1、MMP9蛋白的相對表達量（±s）

表8 BCG823組織中ERK2、ETS1、MMP9蛋白的相對表達量（±s）

與空白組比較▲P＜0.01；與西藥組比較△P＜0.01。

組別 n中藥組9西藥組9空白組9 ERK2 ETS1 MMP9 0.86±0.06▲△0.67±0.04▲△0.63±0.05▲△0.40±0.04▲ 0.39±0.04▲ 0.44±0.03▲1 1 1

圖2 BCG823組織中ETS1、ERK2、MMP9蛋白的表達

3 討論

脾胃為生痰之源，脾胃系統(tǒng)疾病大多導(dǎo)致痰濕內(nèi)停的病理改變。有文獻[6]提出痰與胃癌發(fā)生有內(nèi)在聯(lián)系，治療應(yīng)從痰著手。在胃腸道腫瘤的治療中，化痰散結(jié)類中藥應(yīng)用較多[7]，還有文獻[8]提出痰濁的產(chǎn)生可以促進胃癌的復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移。可見“痰濕阻滯”與胃癌的發(fā)生和轉(zhuǎn)移有緊密聯(lián)系。

“六腑以通為用，以降為順”，胃為六腑之一。《素問·五臟別論》謂“六腑者，傳化物而不藏，故實而不能滿也”，強調(diào)六腑通降才能發(fā)揮正常功能，而通降失常將導(dǎo)致多種疾病。該理論在臨床中用于指導(dǎo)多種疾病的治療，特別是脾胃系統(tǒng)疾病中應(yīng)用較廣。前人根據(jù)該理論指導(dǎo)胃潰瘍、胃炎、胰腺炎、大腸癌等疾病的治療[9]。在胃癌的治療方面，相關(guān)研究[10-11]提出以通降腑氣法治療胃癌，取得較好療效?？梢姟案瓪獠煌ā币彩俏赴┌l(fā)病的病機之一。

本文基于“胃癌痰污染”[12]理論及“消痰散結(jié)方”[13]的臨床與實驗研究，提出“痰濁阻滯，腑氣不通”是胃癌的核心病機，并擬定“滌痰蕩瘤湯”治療胃癌。該方中半夏、天南星二味燥濕化痰，消痞散結(jié)，共為君藥，臨床廣泛用于胃腸道腫瘤的防治[7]。牡蠣、海螵蛸、浙貝、瓜蔞、大黃此五味藥為臣藥。牡蠣、海螵蛸、浙貝化痰軟堅，常被用于胃腸道腫瘤防治[7]。瓜蔞寬胸散結(jié)、清熱滌痰、潤燥滑腸，有抗胃癌、宮頸癌等作用[14]。大黃瀉下攻積、逐瘀通經(jīng)，有較好的抗腫瘤效果[15]。全蝎、地龍、守宮此三味助君藥以通絡(luò)散結(jié)消腫，共為佐藥，具有很好的抗癌作用[16-18]。諸藥合用共奏化痰散結(jié)，通腑降氣之功，充分體現(xiàn)胃癌“痰濁阻滯，腑氣不通”病機特點。此外，治療胃癌應(yīng)強調(diào)“寒熱平調(diào)”思想。課題組認為胃癌產(chǎn)生多因情志不遂、飲食不節(jié)或感受外邪所致，這些病理因素本身有寒有熱，發(fā)病初期邪盛為主，久病邪氣傷正加之失治、誤治損傷脾胃肝膽，形成正邪相戀、寒熱錯雜的狀態(tài)。有學(xué)者[19]研究胃癌前病變也發(fā)現(xiàn)寒熱錯雜是其病機特點，從疾病發(fā)展演變的角度間接論證了胃癌的寒熱錯雜屬性。“滌痰蕩瘤湯”治方充分體現(xiàn)寒熱共用特點，方中半夏、天南星、海螵蛸三者藥性屬溫，用量大而藥味少；瓜蔞、大黃、浙貝、地龍、守宮五者藥性偏寒，用量小而藥味多；全蝎性平，諸藥合用體現(xiàn)寒熱平調(diào)思想，此為該方的治方特點之一。

microRNA是19～23個核苷酸組成的一類小分子非編碼RNA，通過與靶基因信使RNA3'非翻譯區(qū)結(jié)合而抑制靶基因蛋白翻譯，發(fā)揮轉(zhuǎn)錄后基因調(diào)控的作用。許多microRNA通過調(diào)節(jié)特定靶基因表達參與胃癌的形成和進展[20-21]，有研究[22-23]顯示，熱療可通過上調(diào)miR-218抑制胃癌細胞遷移及提高胃癌細胞對順鉑的敏感性，這與張仲景“病痰飲者，當(dāng)以溫藥和之”的理論相吻合?？梢?，microRNA不僅可作為胃癌診斷的標志物，還可作為抗癌治療靶點及治療反應(yīng)的預(yù)測標志物，本課題以microRNA-506-3P及ERK2/ETS1/MMP9通路為靶點探索中藥的作用機理。有研究[5]顯示，microRNA-506-3p可通過介導(dǎo)ERK2/ETS1/MMP9通路而調(diào)節(jié)胃癌的增殖和轉(zhuǎn)移。MicroRNA-506-3P能抑制胃癌細胞增殖，對胃癌診斷、防治有重要意義[24]。ERK2及ETS1的mRNA的3＇UTR區(qū)均存在microRNA-506-3p的結(jié)合位點，提示microRNA-506-3p能作用于ERK2/ETS1信號軸。在胃癌進展過程中ERK2/ETS1信號軸可促進血管生成和腫瘤侵襲[25]。MMP9可誘導(dǎo)細胞外基質(zhì)降解而引起腫瘤轉(zhuǎn)移[26]，其編碼基因的啟動子區(qū)存在ETS1結(jié)合位點，提示ETS1可調(diào)控MMP9的表達?？梢奅RK2/ETS1/MMP9相關(guān)信號通路在腫瘤侵襲過程中有重要調(diào)控作用。

本課題組提出“痰濁阻滯，腑氣不通”是胃癌發(fā)生和發(fā)展的關(guān)鍵病機，而microRNA-506-3p可調(diào)控ERK2/ETS1/MMP9通路而調(diào)節(jié)胃癌進展，并假設(shè)“痰濁阻滯，腑氣不通”與microRNA-506-3p及ERK2/ETS1/MMP9信號通路有內(nèi)在聯(lián)系?；诖?，本課題從microRNA-506-3p及ERK2/ETS1/MMP9通路探索滌痰蕩瘤湯的抗癌機理。結(jié)果顯示，在MKE45和BCG823兩種移植瘤中滌痰蕩瘤湯都能提高胃癌組織中microRNA-506-3p表達量，降低ERK2和ETS1的基因及蛋白表達量。關(guān)于MMP9在基因和蛋白表達方面有所不同。在MKN45移植瘤中，三組基因表達差異均無統(tǒng)計學(xué)意義；而在蛋白表達方面，滌痰蕩瘤湯和5-FU都能減低MMP9表達，造成這種差異的原因可能是mRNA與蛋白質(zhì)的半衰期不同。mRNA比蛋白質(zhì)容易降解，在組織中存在時間較短，造成同一時間基因和蛋白表達的不一致。考慮到蛋白質(zhì)才是生命活動的執(zhí)行者，本實驗對結(jié)果的解釋以蛋白表達為準。研究結(jié)果還顯示，在腫瘤抑制方面，中藥抑瘤率較西藥低，但從動物一般情況及體質(zhì)量來看，中藥能明顯改善荷廇鼠的生存質(zhì)量，體現(xiàn)中藥副作用小的優(yōu)勢，值得深入發(fā)掘研究。綜上所述，滌痰蕩瘤湯能有效抑制胃癌增殖和轉(zhuǎn)移，其機理可能與提高microRNA-506-3p表達進而調(diào)控ERK2/ETS1/MMP9通路相關(guān)。MicroRNA與靶基因的對應(yīng)往往是相互一對多的關(guān)系，即一個microRNA調(diào)控多個靶基因，一個靶基因也可能受多個microRNA調(diào)控。因此，僅通過控制一種microRNA的表達來研究靶基因調(diào)控是遠遠不夠的，本方是否通過其他microRNA和通路起效有待進一步研究。