響應(yīng)面法優(yōu)化米奶酒發(fā)酵條件研究

朱正軍，繆佳成，徐 爽，夏 燕，沈 艷，汪江波，徐 健*

（1.湖北工業(yè)大學(xué) 生物工程與食品學(xué)院 工業(yè)發(fā)酵省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心 湖北省工業(yè)微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 發(fā)酵工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢 430068；2.湖北琪譜檢測(cè)技術(shù)有限公司，湖北 武漢 430068；3.浙江興業(yè)集團(tuán)有限公司，浙江 舟山 316100）

奶酒是一種歷史悠久的發(fā)酵酒，主要流行于我國(guó)的蒙古族地區(qū)以及東歐和中亞部分地區(qū)。傳統(tǒng)奶酒，根據(jù)其所用發(fā)酵劑的形態(tài)、原料乳類型的不同可分為開菲爾（Kefir）和酸馬奶（Koumiss）兩大類[1]。奶酒傳統(tǒng)上所用的原料一般是馬奶，但由于馬奶產(chǎn)量較低的問題，目前也有大量用羊奶和牛奶制成的奶酒[2]。研究發(fā)現(xiàn)，奶酒富含蛋白質(zhì)、脂肪、乳糖、氨基酸、維生素和礦物質(zhì)，還擁有預(yù)防心血管疾病、調(diào)節(jié)消化道活動(dòng)、防止便秘、改善腎功能、降低血液膽固醇水平的功能[3]。由于這些有益的特點(diǎn)，奶酒如今在歐洲等地受到了越來越多的關(guān)注，然而，由于奶酒的風(fēng)味特殊、酸度過高等特點(diǎn)，奶酒并不易被大眾所接受，所以近來研究者們?yōu)榱藢?shí)現(xiàn)奶酒風(fēng)味和品質(zhì)的提升，嘗試向奶酒中添加桃花、葡萄汁等輔料，開發(fā)了諸多新型的奶酒[4-5]。

米酒是我國(guó)傳統(tǒng)的發(fā)酵飲料，其原料主要是糯米，通過蒸煮、接種米酒曲、糖化發(fā)酵等工序加工而成。米酒作為一種低酒精度飲料，因?yàn)槠淞己玫娘L(fēng)味深受我國(guó)消費(fèi)者的喜愛[6]。米酒具有很高的營(yíng)養(yǎng)保健功能，米酒中的蛋白質(zhì)主要以多肽和氨基酸的形式存在，具有抗菌、保護(hù)肝腎功能、降低血壓及血脂等功能，對(duì)人體生長(zhǎng)發(fā)育也起著重要的作用[7]。米酒還含有大量有機(jī)酸，如乙酸、檸檬酸、琥珀酸等，這些有機(jī)酸在促進(jìn)腸道消化吸收、緩解疲勞等保健功能方面有重大的意義[8]。除此之外，米酒中還含有豐富的維生素、無機(jī)鹽、酚類物質(zhì)、多肽、多糖和一些能夠促進(jìn)人體生長(zhǎng)發(fā)育、預(yù)防疾病的微量元素[9-10]。米酒在乳制品中的應(yīng)用由來已久，早在清朝時(shí)期，我國(guó)北方就有用糯米酒作為凝乳劑制作扣碗酪的傳統(tǒng)，扣碗酪又稱傳統(tǒng)中式奶酪，這種奶酪口感爽嫩，兼具米酒的酒香和牛乳的奶香[11]。

本研究以糯米和脫脂奶粉為原料，研制出一款將奶酒與米酒特點(diǎn)結(jié)合在一起的新型發(fā)酵酒，與傳統(tǒng)奶酒相比，其風(fēng)味更加豐滿協(xié)調(diào)，兼具奶香與米酒香且口感更加柔和，更加符合大眾口味，與傳統(tǒng)米酒相比，其蛋白質(zhì)、維生素等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)更加豐富。通過單因素試驗(yàn)考察各因素對(duì)米奶酒品質(zhì)的影響，另通過響應(yīng)面優(yōu)化其發(fā)酵條件，以期開發(fā)出一款口感豐富協(xié)調(diào)且兼具健康營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的新型發(fā)酵酒。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

糯米（珍珠糯米，質(zhì)量等級(jí)為一級(jí)）、脫脂奶粉：市售；乳酸菌發(fā)酵劑（含保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌）、釀酒活性干酵母、甜酒曲：安琪酵母股份有限公司；試驗(yàn)所用試劑購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

MJP-250恒溫培養(yǎng)箱：上海精宏設(shè)備有限公司；SWCJ-IB（標(biāo)準(zhǔn)型）單人單面超凈工作臺(tái)：中國(guó)蘇州智凈凈化設(shè)備有限公司；JJ6000電子天平：常熟市雙杰測(cè)試儀器廠；DK-8D 恒溫水浴鍋：常州諾基儀器有限公司；YXQ-LS-75立式壓力蒸汽滅菌鍋：上海博訊實(shí)驗(yàn)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；PHS-3C pH計(jì)：上海雷磁儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 米奶酒的制備流程及操作要點(diǎn)

糯米→蒸煮加曲發(fā)酵→米酒→稀釋→加入脫脂奶粉→滅菌→接種→發(fā)酵→滅菌→冷卻→成品

操作要點(diǎn)：

米酒的制備：挑選無霉?fàn)€糯米加水浸泡12 h后用清水洗凈、瀝水，常壓蒸煮20 min，用清水沖淋冷卻至米飯溫度28～32 ℃。拌入糯米質(zhì)量分?jǐn)?shù)6‰的甜酒曲，攪拌均勻后于30 ℃發(fā)酵2 d。發(fā)酵完成后用紗布濾出酒液，并在室溫條件下8 000 r/min離心5 min，取上清液85 ℃水浴20 min滅菌，4 ℃條件下保藏備用。

稀釋、調(diào)配、滅菌：將米酒與水按一定體積比混合、稀釋，并添加一定量的脫脂奶粉，攪拌至完全融化。在85 ℃水浴滅菌20 min，并迅速冷卻至室溫。

接種、發(fā)酵：將適量乳酸菌菌粉加入由脫脂奶粉制成的100 g/L液體脫脂乳培養(yǎng)基中，混勻后于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待培養(yǎng)基凝固后再以50 g/L的接種量于另一液體脫脂乳培養(yǎng)基中，如此反復(fù)傳代3～4次后，于4 ℃保藏備用；酵母菌活化：稱取原料質(zhì)量0.1%的活性干酵母溶于20 g/L的葡萄糖溶液中，38 ℃水浴20 min。將活化好的乳酸菌和酵母與冷卻至室溫的混合原料攪拌均勻，于30 ℃恒溫條件下發(fā)酵2.5 d。

滅菌、冷卻：發(fā)酵完成后38 ℃水浴20 min再次滅菌，冷卻至室溫即獲得米奶酒成品。

1.3.2 米奶酒發(fā)酵條件優(yōu)化單因素試驗(yàn)

以乳酸菌接種量6%，脫脂奶粉添加量7.5 g/100 mL，米酒添加量60%，發(fā)酵溫度30 ℃，酵母菌接種量0.1%為基礎(chǔ)條件，改變單一變量，分別考察不同乳酸菌接種量（2%、4%、6%、8%、10%），脫脂奶粉添加量（2.5 g/100 mL、5.0 g/100 mL、7.5g/100mL、10.0g/100mL、12.5g/100mL），米酒添加量（30%、40%、50%、60%、70%），發(fā)酵溫度（26 ℃、28 ℃、30 ℃、32 ℃、34 ℃）對(duì)米奶酒總酸、酒精度和感官評(píng)分的影響。

1.3.3 米奶酒發(fā)酵條件優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇脫脂奶粉添加量（A）、米酒添加量（B）和乳酸菌接種量（C）為3個(gè)影響因素，以米奶酒感官評(píng)分（Y）為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)3因素3水平響應(yīng)面試驗(yàn)，響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平見表1。

表1 米奶酒發(fā)酵條件優(yōu)化Box-Behnken試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken experiments for fermentation conditions optimization of rice-milk wine

1.3.4 測(cè)定方法

酒精度：參考GB 5009.225—2023《酒和食用酒精中乙醇濃度的測(cè)定》的酒精計(jì)法測(cè)定[12]；總糖、總酸和氨基酸態(tài)氮：參考GB/T 23546—2009《奶酒》的方法進(jìn)行[13]。

米奶酒的感官評(píng)價(jià)方法參照中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 23546—2009《奶酒》中發(fā)酵型奶酒的評(píng)價(jià)細(xì)則，并結(jié)合米奶酒的酒體特點(diǎn)經(jīng)過些許改動(dòng)后進(jìn)行，取約25 mL酒樣于潔凈干燥的品酒杯中進(jìn)行評(píng)價(jià)。評(píng)定小組由10人（男女各5人）組成，且皆具有酒體感官評(píng)價(jià)經(jīng)驗(yàn)。主要從色澤（10分）、氣味（30分）、滋味（40分）、典型性（20分）四個(gè)方面依次對(duì)成品進(jìn)行評(píng)分，總分為100分，米奶酒的感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見表2。

表2 米奶酒感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Table 2 Sensory evaluation standards of rice-milk wine

1.3.5 數(shù)據(jù)處理

本研究中所有試驗(yàn)和檢測(cè)均重復(fù)進(jìn)行3次，數(shù)值以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。采用IBM SPSS 25.0版統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性分析，P＜0.05認(rèn)為數(shù)值間存在顯著性差異。使用Origin 2021b軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)繪圖。使用Design Expert V13軟件進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)和數(shù)據(jù)處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 米奶酒發(fā)酵條件優(yōu)化單因素試驗(yàn)

2.1.1 乳酸菌接種量對(duì)米奶酒發(fā)酵的影響

由圖1可知，隨著乳酸菌接種量的增加，米奶酒的總酸升高，酒精度降低，感官評(píng)分呈先升高后降低的趨勢(shì)。乳酸菌接種量為8%時(shí)，米奶酒的感官評(píng)分最高，為82分。這可能是由于乳酸菌接種量的增大使得米奶酒發(fā)酵體系中乳酸菌活菌數(shù)上升，乳酸菌發(fā)酵過程中累積產(chǎn)酸量也不斷增加[14]。而發(fā)酵體系總酸含量過高以及酵母菌和乳酸菌的生存競(jìng)爭(zhēng)，可能會(huì)導(dǎo)致酵母的生長(zhǎng)發(fā)酵受到抑制，從而使成品的酒精度下降。乳酸菌發(fā)酵過快、產(chǎn)酸過多也會(huì)對(duì)感官評(píng)分產(chǎn)生影響，總酸過高會(huì)使成品產(chǎn)生苦澀味，導(dǎo)致成品品質(zhì)下降[15-16]。因此確定米奶酒乳酸菌最佳接種量為8%。

圖1 乳酸菌接種量對(duì)米奶酒品質(zhì)的影響Fig.1 Effect of Lactobacillus inoculum on the quality of rice-milk wine

2.1.2 米酒添加量對(duì)米奶酒發(fā)酵的影響

由圖2可知，隨著米酒添加量的增加，米奶酒的總酸略降低，酒精度及感官評(píng)分均呈先升高后降低的趨勢(shì)。米酒添加量為60%時(shí)，米奶酒的感官評(píng)分最高，為81.5分。米酒中含有大量的糖，測(cè)得試驗(yàn)制備米酒總糖含量為413.1 g/L，酒精度為1.12%vol，這些糖是米奶酒中酵母發(fā)酵產(chǎn)乙醇的主要碳源[17]。當(dāng)米酒添加量＞60%時(shí)，糖含量過高可能會(huì)抑制酵母菌的生長(zhǎng)使得酒精度下降[18]。因此確定米奶酒中最佳米酒添加量為60%。

2.1.3 脫脂奶粉添加量對(duì)米奶酒發(fā)酵的影響

由圖3可知，隨著脫脂奶粉添加量的增加，米奶酒的總酸降低，酒精度無顯著性變化，感官評(píng)分呈先升高后降低的趨勢(shì)。脫脂奶粉添加量為7.5 g/100 mL時(shí)，米奶酒的感官評(píng)分最高，為80分。這可能是由于隨著脫脂奶粉添加量的增加，發(fā)酵體系的水分活度降低，對(duì)乳酸菌的生長(zhǎng)產(chǎn)生抑制作用，而酵母菌對(duì)低水分活度的耐受性較強(qiáng)，對(duì)其生長(zhǎng)發(fā)酵影響較小[19]。當(dāng)脫脂奶粉添加量較低時(shí)，米奶酒的感官評(píng)分也較低，這時(shí)米奶酒的奶味較淡且酸味過強(qiáng)。而當(dāng)脫脂奶粉添加量過高時(shí)，酸味過低，口感單薄，且奶味掩蓋了酒香，使得米奶酒整體風(fēng)味不夠協(xié)調(diào)。因此確定米奶酒中脫脂奶粉最佳添加量為7.5 g/100 mL。

圖3 脫脂奶粉添加量對(duì)米奶酒品質(zhì)的影響Fig.3 Effect of skim milk powder addition on the quality of rice-milk wine

2.1.4 發(fā)酵溫度對(duì)米奶酒發(fā)酵的影響

由圖4可知，隨著發(fā)酵溫度的升高，米奶酒的總酸升高，酒精度的變化不顯著，感官評(píng)分呈先升高后降低的趨勢(shì)。發(fā)酵溫度為30 ℃時(shí)，米奶酒的感官評(píng)分最高，為81.2分。這可能是由于本試驗(yàn)所用的嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌的最適生長(zhǎng)溫度為40～45 ℃，溫度越高越適宜嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌的生長(zhǎng)發(fā)酵，米奶酒的乳酸累積量也越高；發(fā)酵溫度越低，米奶酒中乳酸菌的生長(zhǎng)發(fā)酵速率就越慢，乳酸積累量越低。但溫度過高又會(huì)加快酵母菌生長(zhǎng)增殖，菌體過早進(jìn)入衰亡期，不利于糖轉(zhuǎn)化為酒精，使得米奶酒的酒精度有所下降[20-21]。發(fā)酵溫度較低時(shí)乳酸菌發(fā)酵不充分，使得米奶酒酸味過低，感官評(píng)分下降?？偹徇^高時(shí)口感變澀，感官評(píng)分也降低。因此確定米奶酒的最佳發(fā)酵溫度為30 ℃。

圖4 發(fā)酵溫度對(duì)米奶酒品質(zhì)的影響Fig.4 Effect of fermentation temperature on the quality of rice-milk wine

2.2 米奶酒發(fā)酵條件優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)

米奶酒發(fā)酵條件優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表3，方差分析見表4。

表3 米奶酒發(fā)酵條件優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 3 Design and results of response surface methodology for fermentation conditions optimization of rice-milk wine

表4Table 4 Variance analysis of regression model

使用Design-Expert V13軟件對(duì)表3中數(shù)據(jù)進(jìn)行多元二次回歸擬合，得到以米奶酒感官評(píng)分（Y）為響應(yīng)值，對(duì)脫脂奶粉添加量（A）、米酒添加量（B）和乳酸菌接種量（C）的多元二次回歸方程模型：

由表4可知，失擬項(xiàng)P值0.235 0＞0.05，不顯著，模型的F值為251.83，P值＜0.000 1，極顯著，表明該模型的回歸效果極顯著，可用于對(duì)本試驗(yàn)中米奶酒的條件進(jìn)行優(yōu)化。同時(shí)根據(jù)P值和F值的大小可以判斷各因素對(duì)米奶酒感官評(píng)分的影響大小[22]，一次項(xiàng)A、B，交互項(xiàng)AB、BC，二次項(xiàng)B2、C2對(duì)米奶酒的感官評(píng)分均有極顯著影響（P＜0.01）。一次項(xiàng)C，二次項(xiàng)A2對(duì)米奶酒的感官評(píng)分均有顯著影響（P＜0.05）。交互項(xiàng)AC對(duì)米奶酒的感官評(píng)分無顯著影響（P＞0.05）。由F值可知，各因素對(duì)米奶酒感官評(píng)分影響順序由大到小為：米酒添加量（B）＞脫脂奶粉添加量（A）＞乳酸菌接種量（C）。

2.3 各因素響應(yīng)面交互作用分析

為更直觀的分析各因素之間的交互作用對(duì)米奶酒感官評(píng)分的影響，根據(jù)表3和表4的結(jié)果使用Design Expert V13繪制三維圖，結(jié)果見圖5。

圖5 各因素間交互作用對(duì)米奶酒感官評(píng)分影響的響應(yīng)曲面與等高線Fig.5 Response surface plots and contour lines of the interaction of various factors on sensory score of rice-milk wine

由圖5可知，響應(yīng)曲面坡度越陡，其等高線也就越接近于一個(gè)橢圓，這說明這兩個(gè)因素間對(duì)米奶酒的感官評(píng)分作用越顯著，反之若等高線呈圓形則表示兩因素交互作用不顯著[23-25]。從圖5A可以看出，脫脂奶粉添加量和米酒添加量的響應(yīng)面圖坡度最陡，等高線呈明顯的橢圓形，這表明這兩個(gè)因素的交互作用對(duì)米奶酒的感官評(píng)分的影響最顯著，隨著米酒添加量的增加，米奶酒的感官評(píng)分呈現(xiàn)先增長(zhǎng)后逐漸減少的趨勢(shì)，在米酒添加量為59%～67%時(shí)，米奶酒的感官評(píng)分較高。由圖5B可知，脫脂奶粉添加量和乳酸菌接種量的響應(yīng)面圖坡度較緩，這表示這兩個(gè)因素之間的交互作用對(duì)米奶酒的感官評(píng)分則沒有顯著的影響，而米酒添加量和乳酸菌接種量的等高線圖（圖5C）也呈一個(gè)橢圓，乳酸菌接種量固定不變，米奶酒的感官評(píng)分隨米酒添加量的增加，呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢(shì)；米酒添加量不變，米奶酒的感官評(píng)分隨乳酸菌接種量的增加先增大后明顯減小，兩因素對(duì)感官評(píng)分的影響呈顯著正交互作用，上述三維圖呈現(xiàn)結(jié)果與表4方差分析結(jié)果一致。

通過Design-Expert V13軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析后得到米奶酒的最佳發(fā)酵條件為：脫脂奶粉添加量8.92 g/100 mL、米酒添加量63.27%、乳酸菌接種量9.24%，此條件下米奶酒預(yù)測(cè)感官評(píng)分為81.8分。為了試驗(yàn)實(shí)際可操作性，將最佳條件參數(shù)調(diào)整為脫脂奶粉添加量9.0 g/100 mL、米酒添加量63.0%、乳酸菌接種量9.0%。按照調(diào)整后的條件進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，得到米奶酒感官評(píng)分實(shí)際值為82.3分，接近于預(yù)測(cè)值，證明模型擬合性好，表明結(jié)果有效。

2.4 產(chǎn)品質(zhì)量指標(biāo)

按照優(yōu)化后條件制出的米奶酒感官評(píng)分為82.3分，呈乳白微黃，色澤均勻，有光澤。味道奶香濃郁，兼具米酒香和發(fā)酵乳香，口感上奶香與酒味協(xié)調(diào)，酸甜協(xié)調(diào)，酒體豐滿，醇厚協(xié)調(diào)。由表5可知最佳條件下米奶酒酒精度為9.03%vol，總酸為5.07 g/L，總糖為82.10 g/L，氨基酸態(tài)氮為0.52 g/L，符合國(guó)標(biāo)GB/T 23546—2009《奶酒》對(duì)發(fā)酵型奶酒的理化要求。

表5 奶酒標(biāo)準(zhǔn)及米奶酒質(zhì)量指標(biāo)Table 5 National standard for milk wine and quality indexes of rice-milk wine

3 結(jié)論

本研究以糯米和脫脂奶粉為原料，使用乳酸菌和酵母菌作為發(fā)酵劑進(jìn)行米奶酒發(fā)酵。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上以感官評(píng)分為響應(yīng)值進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)對(duì)米奶酒的條件進(jìn)行優(yōu)化，得到米奶酒的最佳發(fā)酵條件為：脫脂奶粉添加量為9.0 g/100 mL、米酒添加量63.0%、乳酸菌接種量9.0%。在此條件下發(fā)酵出的米奶酒感官評(píng)分為82.3分，風(fēng)味豐滿協(xié)調(diào)，兼具發(fā)酵乳香與米酒香，是一款口感細(xì)膩柔和且兼具健康營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的新型發(fā)酵酒，為我國(guó)米酒的加工應(yīng)用和新型奶酒的研發(fā)提供了新的方向。