川法小曲白酒鑒別方法的研究

陳燕梅，羅 玥，王新惠，鐘慈平，黃 萍，易 鑫，何 媛，徐躍成*

（1.成都大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，四川 成都 610106；2.四川省食品檢驗(yàn)研究院，四川 成都 610100；3.國(guó)家市場(chǎng)監(jiān)管重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（白酒監(jiān)管技術(shù)），四川 成都 610100）

白酒是中國(guó)的國(guó)酒，在我國(guó)傳統(tǒng)文化和食品工業(yè)中有著舉足輕重的地位[1-2]。白酒釀造工藝獨(dú)特，按照生產(chǎn)工藝的不同分為固態(tài)法、液態(tài)法及固液法白酒、調(diào)香白酒。固態(tài)法白酒采用糧谷為原料、固態(tài)發(fā)酵、固態(tài)蒸餾的方式進(jìn)行，賦予了其豐富的風(fēng)味特征和較高的品質(zhì)[3]。川法小曲白酒是固態(tài)法白酒的代表之一，廣泛分布在云貴川渝等地，香味成分具有量比關(guān)系，風(fēng)格獨(dú)特[4]。固態(tài)法白酒的釀造工藝復(fù)雜，成本較高，而固液法白酒工藝較為簡(jiǎn)單，且品質(zhì)不如固態(tài)法白酒。因此存在部分商家為了牟利，將固液法白酒冒充傳統(tǒng)固態(tài)法白酒進(jìn)行銷售的行為。這不僅損害了消費(fèi)者和企業(yè)的切身利益，而且影響白酒市場(chǎng)的健康發(fā)展[5-6]。白酒中風(fēng)味物質(zhì)的含量和比例直接影響風(fēng)味特征，是決定白酒品質(zhì)的關(guān)鍵[7-8]。

隨著分析技術(shù)的發(fā)展，可獲得大量的數(shù)據(jù)，但數(shù)據(jù)之間的相關(guān)性高，處理起來(lái)比較困難[9]，這些冗余信息，對(duì)白酒的質(zhì)量判別的準(zhǔn)確性有一定的影響，因此需要利用多元統(tǒng)計(jì)分析方法對(duì)其中的有效信息進(jìn)行挖掘[10]。多元統(tǒng)計(jì)分析是一種處理數(shù)據(jù)的有效手段，已廣泛應(yīng)用于食品質(zhì)量判定[11-13]。目前在白酒質(zhì)量鑒別中常見(jiàn)的研究技術(shù)手段有色譜法[14]、質(zhì)譜法[15]、同位素鑒別法[16]等方法。其中氣相色譜（gas chromatography，GC）法作為常規(guī)分析方法，操作簡(jiǎn)單，成本較低，分析效率高，被廣泛應(yīng)用于白酒行業(yè)[8]。張曉婕等[17]利用氣相色譜和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）對(duì)兩種工藝醬香白酒中揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行了定性定量分析，結(jié)合香氣活性值和多元統(tǒng)計(jì)方法構(gòu)建鑒別模型并得出糠醛可能是造成兩種工藝差異的重要物質(zhì)。劉鴻鋼等[14]利用氣相色譜非靶向篩選11個(gè)變量結(jié)合主成分分（principal component analysis，PCA），分析了14批次白酒樣品，可明顯區(qū)分固態(tài)法白酒和液態(tài)法白酒。由于川法小曲白酒生產(chǎn)的規(guī)模化水平不高，相關(guān)研究較少，制約著其發(fā)展。隨著經(jīng)濟(jì)社會(huì)的發(fā)展，以質(zhì)量為導(dǎo)向、以品牌為基礎(chǔ)的價(jià)值時(shí)代和“振興川酒”口號(hào)的提出，鑒別固態(tài)法川法小曲白酒質(zhì)量勢(shì)在必行。因此，在對(duì)風(fēng)味成分進(jìn)行快速準(zhǔn)確地測(cè)定分析的基礎(chǔ)上，結(jié)合多元統(tǒng)計(jì)分析方法，能有效的提取酒類的關(guān)鍵差異化合物，提高酒類鑒別的可靠性和準(zhǔn)確性[18]。

該研究以川法小曲白酒為研究對(duì)象，采用氣相色譜直接進(jìn)樣法對(duì)風(fēng)味物質(zhì)定性定量分析，利用風(fēng)味物質(zhì)定量結(jié)果，結(jié)合PCA和正交偏最小二乘-判別分析（orthogonal partial least squares-discrimination analysis，OPLS-DA）的方法，分析川法小曲白酒和固液酒中風(fēng)味物質(zhì)間的差異，為企業(yè)酒質(zhì)的提升和白酒監(jiān)管提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

川法小曲白酒酒樣（固態(tài)法）21個(gè)（編號(hào)G1～G21）：由瀘州、眉山、南充、成都、江津等地酒企提供；以川法小曲白酒為基酒的酒樣（固液法）21個(gè)（編號(hào)GY22～GY42）：市售。

甲醇標(biāo)準(zhǔn)品：德國(guó)Dr.Ehrenstorfer Gmb H公司；乙酸正丁酯（色譜純）：貴州省計(jì)量測(cè)試院；正丙醇、仲丁醇、異丁醇、異戊醇、丁酸乙酯、乳酸乙酯標(biāo)準(zhǔn)品：上海麥克林生化科技有限公司；乙酸乙酯標(biāo)準(zhǔn)品：成都市諾爾施科技有限責(zé)任公司；乙酸、丁酸、己酸乙酯、己酸標(biāo)準(zhǔn)品：北京曼哈格生物科技有限公司；丙酸乙酯、戊醇、庚二酸二乙酯、辛二酸二乙酯、壬二酸二乙酯標(biāo)準(zhǔn)品：廣州佳途科技股份有限公司；β-苯乙醇標(biāo)準(zhǔn)品：阿拉丁試劑（上海）有限公司；無(wú)水乙醇（色譜級(jí)）：成都市科隆化學(xué)品有限公司。以上標(biāo)準(zhǔn)品均為色譜純。

1.2 儀器與設(shè)備

島津GC-2010Plus氣相色譜儀[配有氫火焰離子化檢測(cè)器（hydrogen flame ionization detector，F(xiàn)ID）]：島津（中國(guó)）有限公司；DB-624色譜柱（30 m×0.32 mm，1.80 μm）：安捷倫科技有限公司；XSE105型電子分析天平：梅特勒托利多科技（中國(guó)）有限公司；GenPure UV-TOC/UF×CAD plus型純水儀超純水系統(tǒng)：賽默飛世爾科技公司。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)品溶液制備

19種單標(biāo)溶液配制：準(zhǔn)確稱取各標(biāo)準(zhǔn)品于10 mL容量瓶中，用體積分?jǐn)?shù)60%的乙醇定容，配制成質(zhì)量濃度為1 000 mg/L的單標(biāo)溶液。

19種風(fēng)味物質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液配制：準(zhǔn)確稱19種風(fēng)味物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品于100 mL容量瓶中，用體積分?jǐn)?shù)為60%的乙醇稀釋至刻度，搖勻備用。

1.3.2 風(fēng)味物質(zhì)的檢測(cè)

樣品前處理：準(zhǔn)確移取樣品1 mL于1.5 mL進(jìn)樣小瓶中，加入10 μL內(nèi)標(biāo)使用液（乙酸正丁酯：1 7940 mg/L），混合均勻后直接進(jìn)行氣相色譜分析。

氣相色譜條件：色譜柱為DB-624色譜柱（30m×0.32mm，1.80 μm）。升溫程序?yàn)椋浩鹗紲囟?3 ℃，保持8.8 min，以10 ℃/min升至60 ℃保持2 min，以8 ℃/min升至100 ℃保持1.5 min，以10 ℃/min升至220 ℃保持1 min，以25 ℃/min升至250℃保持8min；載氣為氮?dú)猓∟2），載氣流速為1.0mL/min，分流比10∶1，進(jìn)樣量1.0μL，檢測(cè)器溫度280℃，進(jìn)樣口溫度250℃。

定性方法：以19種單標(biāo)溶液的保留時(shí)間為依據(jù)對(duì)19種風(fēng)味物質(zhì)的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行定性[19]。

定量方法：分別準(zhǔn)確吸取19種系列稀釋混合標(biāo)準(zhǔn)溶液于對(duì)應(yīng)1.5 mL進(jìn)樣小瓶中，用體積分?jǐn)?shù)60%的乙醇溶液定容至1 mL，分別加入10 μL內(nèi)標(biāo)溶液，混合均勻后直接進(jìn)行氣相色譜分析。以待測(cè)物與相應(yīng)內(nèi)標(biāo)物的峰面積比（y）為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度比（x）為橫坐標(biāo)，建立各風(fēng)味物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，采用內(nèi)標(biāo)法定量分析白酒中各風(fēng)味物質(zhì)含量。

1.3.3 方法學(xué)考察

內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制與檢出限、定量限測(cè)定：不同濃度混標(biāo)由低濃度到高濃度依次進(jìn)樣分析，以信噪比（S/N）=3時(shí)所對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)物的質(zhì)量濃度作為方法的檢出限（limit of detection，LOD），信噪比（S/N）=10時(shí)所對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)物的質(zhì)量濃度作為方法的定量限（limit of quantification，LOQ）[20]。

加標(biāo)回收率和精密度實(shí)驗(yàn)[21]：根據(jù)白酒中各種化合物含量高低，分別準(zhǔn)確稱取高、中、低三種質(zhì)量濃度的19種混合標(biāo)準(zhǔn)溶液于10 mL容量瓶中，用白酒樣品定容。每個(gè)質(zhì)量濃度平行測(cè)定6次，計(jì)算19種風(fēng)味物質(zhì)的平均加標(biāo)回收率和精密度試驗(yàn)結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）。

1.3.4 川法小曲白酒鑒別分析

兩種不同工藝白酒的定量結(jié)果導(dǎo)入SIMCA 14.1統(tǒng)計(jì)分析軟件建立數(shù)據(jù)模型，基于PCA與OPLS-DA判別兩種工藝白酒的差異性。

1.3.5 數(shù)據(jù)分析

每個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)均進(jìn)行3次平行試驗(yàn)。風(fēng)味物質(zhì)定量結(jié)果以平行試驗(yàn)后含量的算數(shù)平均值表示。使用軟件Excel 2019進(jìn)行數(shù)據(jù)整理，將處理的數(shù)據(jù)矩陣導(dǎo)入SIMCA14.1軟件，進(jìn)行主成分分析（PCA）、正交偏最小二乘判別分析（OPLS-DA）。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制、檢出限、定量限

各風(fēng)味物質(zhì)的保留時(shí)間、標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)（R2）及檢出限、定量限見(jiàn)表1。由表1可知，各風(fēng)味物質(zhì)的線性范圍為0.47～6 111.68 mg/L，標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程相關(guān)系數(shù)（R2）均大于0.998，線性關(guān)系良好，檢出限為1.31～109.83 mg/L，定量限為2.36～338.38 mg/L，說(shuō)明該方法靈敏度高，滿足白酒中風(fēng)味物質(zhì)分析方法要求。

表1 19種風(fēng)味物質(zhì)的保留時(shí)間、標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)、檢出限及定量限Table 1 Retention time, standard curve regression equation, linear range, correlation coefficient, detection limit and quantitative limit of 19 flavor substances

2.2 方法的加標(biāo)回收率與精密度試驗(yàn)

隨機(jī)抽取一個(gè)川法小曲白酒酒樣（G14）進(jìn)行加標(biāo)回收率和精密度試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可知，各物質(zhì)在高、中、低加標(biāo)濃度條件下的平均回收率為90.17%～112.57%，精密度試驗(yàn)結(jié)果的RSD值為0.09%～4.77%，說(shuō)明該方法的回收率較高，精密度良好，能滿足白酒中19種風(fēng)味物質(zhì)的檢測(cè)需求。

表2 白酒酒樣中19種風(fēng)味物質(zhì)的平均加標(biāo)回收率和精密度試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of average recovery rates and precision tests of 19 flavor substances in Baijiu samples

2.3 川法小曲酒鑒別分析

2.3.1 兩種不同工藝白酒中風(fēng)味物質(zhì)定性定量分析

利用氣相色譜直接進(jìn)樣法，對(duì)兩種工藝共42個(gè)白酒樣品中的風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行定性定量分析，隨機(jī)選取一款川法小曲酒和固液酒樣的氣相色譜圖進(jìn)行分析，結(jié)果見(jiàn)圖1。由圖1可知，兩種工藝白酒中共檢出16種風(fēng)味物質(zhì)，其中醇類8種，酯類5種，酸類3種，包括正丙醇、乙酸乙酯、乙酸等風(fēng)味物質(zhì)；且川法小曲白酒中檢出的風(fēng)味物質(zhì)的數(shù)量大于固液法白酒。

川法小曲白酒的風(fēng)味物質(zhì)含量具有以乙酸乙酯為主，高級(jí)醇含量較高的特點(diǎn)[4]。兩種酒樣中風(fēng)味物質(zhì)的定量結(jié)果見(jiàn)表3。由表3可知，川法小曲白酒中的乙酸乙酯（346.42～1 556.44 mg/L）、乳酸乙酯（61.22～1 509.78 mg/L）、異丁醇（217.1～509.86 mg/L）、異戊醇（379.51～1 091.06 mg/L）含量與楊建剛[22]報(bào)道的川法小曲白酒中的乙酸乙酯（417～2 088 mg/L）、乳酸乙酯（111.5～2 809 mg/L）、異丁醇（332.7～637.1 mg/L）、異戊醇（772.1～1 170.1 mg/L）質(zhì)量濃度相似。表明本研究建立的方法定量結(jié)果準(zhǔn)確可靠。醇類主要來(lái)源于發(fā)酵過(guò)程中微生物對(duì)原料中糖和氨基酸的分解代謝。對(duì)香氣起著重要的促進(jìn)作用，也是形成其他類型揮發(fā)性化合物的前體[2]。川法小曲白酒中高級(jí)醇如正丙醇（175.69～6 829.04 mg/L）含量相較于固液酒中的正丙醇（53.98～411.62 mg/L）含量更高，但需要將其控制在一定范圍之內(nèi)，以保持白酒的良好品質(zhì)[23]。酯類物質(zhì)也是白酒質(zhì)量鑒定的重要指標(biāo)，通過(guò)醇和酸的酯化反應(yīng)形成[24]，乙酸乙酯和乳酸乙酯是小曲酒中的主要香氣特征成分[25]，且川法小曲白酒中乙酸乙酯（346.42～1 556.44 mg/L）和乳酸乙酯（61.22～1 509.78 mg/L）的含量稍高于固液酒中乙酸乙酯（523.4～1 455.46 mg/L）、乳酸乙酯（65.78～773.65 mg/L）的含量。川法小曲白酒發(fā)酵時(shí)間較短，酸類物質(zhì)含量較高[4]，酸類化合物主要由微生物利用淀粉、脂肪、蛋白質(zhì)等有機(jī)物發(fā)生生化反應(yīng)生成[25]，對(duì)酒體的香氣有著重要的貢獻(xiàn)，川法小曲白酒中的乙酸（149.93～1 351.71 mg/L）、丁酸（0～532.02 mg/L）酸類物質(zhì)含量稍高于固液酒的乙酸（270.61～706.23 mg/L）、丁酸（0～44.09 mg/L）。表明釀造工藝的不同使兩種工藝白酒含量特征具有差異，且川法小曲白酒的含量特征可作為區(qū)別其他工藝白酒的標(biāo)識(shí)之一。

表3 酒樣中風(fēng)味物質(zhì)的定量結(jié)果Table 3 Quantitative results of flavor substances in Baijiu samples

酒樣中各類風(fēng)味物質(zhì)含量匯總結(jié)果見(jiàn)表4。由表4可知，川法小曲白酒酒樣中各類物質(zhì)的平均含量及其平均總量均高于固液法酒樣，其中醇類＞酯類＞酸類。川法小曲白酒酒樣中的醇類平均含量與平均總量之比高于固液法酒樣，但酯類、酸類相反，說(shuō)明兩種工藝白酒在風(fēng)味物質(zhì)含量及各類物質(zhì)與總量的比例具有差異。

2.3.2 多元統(tǒng)計(jì)分析

為進(jìn)一步發(fā)掘兩種工藝白酒的差異性，以風(fēng)味物質(zhì)含量作為因變量，不同工藝作為自變量，結(jié)合多元統(tǒng)計(jì)學(xué)方法對(duì)兩種酒樣進(jìn)行分析。

（1）主成分分析

對(duì)兩種工藝白酒風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行主成分分析，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 川法小曲白酒和固液法白酒風(fēng)味成分主成分分析得分圖Fig.2 Score plots of principal component analysis of flavor substances in Sichuan Xiaoqu Baijiu and Baijiu produced with solid-liquid fermentation

由圖2可知，兩種工藝酒樣能夠效地區(qū)分開(kāi)。因此采用PCA模型對(duì)川法小曲白酒和固液法白酒進(jìn)行區(qū)分鑒別是可行的。

（2）正交偏最小二乘-判別分析

在PCA的基礎(chǔ)上進(jìn)行OPLS-DA分析，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 川法小曲白酒和固液法白酒風(fēng)味成分正交偏最小二乘-判別分析得分圖（A）、置換檢驗(yàn)結(jié)果（B）及VIP值（C）Fig.3 Orthogonal partial least squares-discrimination analysis score plots (A), permutation test results (B) and VIP (C) of the flavor substances in Sichuan Xiaoqu Baijiu and Baijiu produced with solid-liquid fermentation

由圖3A可知，川法小曲白酒酒樣（G）和固液法酒樣（GY）分布于坐標(biāo)軸不同區(qū)域，得到較好分離，說(shuō)明兩種不同工藝酒樣存在差異性，可以實(shí)現(xiàn)兩種工藝酒樣樣品有效區(qū)分。本次分析中的自變量擬合指數(shù)（R2X）為0.843，因變量擬合指數(shù)（R2Y）為0.909，模型預(yù)測(cè)指數(shù)（Q2）為0.865，R2和Q2＞0.5表示模型擬合結(jié)果可接受[26]。由圖3B可知，經(jīng)過(guò)200次置換檢驗(yàn)，Q2回歸線與縱軸的相交點(diǎn)小于零，說(shuō)明模型不存在過(guò)擬合，表明OPLS-DA模型穩(wěn)定可靠，認(rèn)為該結(jié)果可用于川法小曲白酒的鑒別分析。對(duì)OPLS-DA聚類結(jié)果中2組數(shù)據(jù)的差異性進(jìn)行整體分析，得到變量投影重要性（variable importance in the projection，VIP）預(yù)測(cè)值，VIP≥1可認(rèn)為該變量為該判別模型的潛在差異物質(zhì)，且VIP值越大說(shuō)明該物質(zhì)在判別過(guò)程中的貢獻(xiàn)越大[17]。由圖3C可知，得出3個(gè)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的差異物質(zhì)分別為正丙醇、異戊醇、異丁醇（VIP值≥1），結(jié)果表明這3種成分可能是導(dǎo)致兩種工藝白酒差異的主要標(biāo)志物。此結(jié)果與前文中定性和定量分析中結(jié)果相似，川法小曲白酒中醇類物質(zhì)含量明顯高于固液法白酒。正丙醇、異戊醇、異丁醇在固態(tài)發(fā)酵中由微生物對(duì)原料中糖和氨基酸的分解代謝產(chǎn)生，而固液法工藝無(wú)法模擬出固態(tài)中這三種醇類的含量特點(diǎn)。

3 結(jié)論

本研究以川法小曲白酒和固液酒為對(duì)象，采用GC-FID結(jié)合內(nèi)標(biāo)法對(duì)酒樣中19種風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行定量分析。該方法操作簡(jiǎn)單，精密度及準(zhǔn)確度良好，適用于白酒中19種風(fēng)味物質(zhì)的同時(shí)檢測(cè)。定量結(jié)果顯示，川法小曲酒樣中各類物質(zhì)含量及總量均高于固液酒樣，且兩種工藝白酒的風(fēng)味物質(zhì)含量及各類物質(zhì)與總量的比例具有明顯差異，說(shuō)明白酒品質(zhì)與各物質(zhì)含量相關(guān)。采用OPLS-DA構(gòu)建了川法小曲酒與固液酒樣的鑒別模型，模型良好可以實(shí)現(xiàn)兩種工藝酒樣的鑒別。通過(guò)VIP值（≥1）確定種工藝白酒之間的顯著性差異化合物為：正丙醇、異戊醇、異丁醇。

本研究利用氣相色譜分析技術(shù)結(jié)合多元統(tǒng)計(jì)分析模型對(duì)川法小曲白酒和固液酒進(jìn)行鑒別，使兩種工藝酒樣的鑒別高效和客觀，并確定了對(duì)差異產(chǎn)生有較大貢獻(xiàn)的風(fēng)味物質(zhì)。川法小曲白酒和固液酒的準(zhǔn)確鑒別可為白酒的質(zhì)量控制提供一定技術(shù)參考。由于本研究所測(cè)的酒樣數(shù)量和風(fēng)味物質(zhì)種類有限，后期還需對(duì)大批量酒樣進(jìn)行分析驗(yàn)證并結(jié)合感官評(píng)定。使該方法能更有效、客觀地對(duì)白酒進(jìn)行分類和鑒定。