劉仕洋，孔祥聰，付彩霞，席 啦，郭 壯，2，王玉榮*

（1.湖北文理學(xué)院 湖北省食品配料工程技術(shù)研究中心，湖北 襄陽(yáng) 441053；2.湖北土老憨生態(tài)農(nóng)業(yè)科技股份有限公司，湖北 宜都 443302；3.湖北省發(fā)酵調(diào)味品工程技術(shù)研究中心，湖北 宜昌 443302）

生抽是中國(guó)傳統(tǒng)的發(fā)酵調(diào)味品，以大豆、小麥和食鹽等為主要原料，經(jīng)微生物發(fā)酵釀造制成[1]。FENG Y Z等[2]的研究表明生抽中含有多達(dá)300種揮發(fā)性物質(zhì)，且這些化合物對(duì)醬油的感官品質(zhì)較為重要。WANG S等[3]分析了日本醬油中揮發(fā)性化合物的種類，并評(píng)價(jià)醬油的感官等級(jí)，發(fā)現(xiàn)在解析出的64種揮發(fā)性化合物中，丙酮酸乙酯和3-羥基-2-丁酮等19種化合物與醬油感官品質(zhì)呈正相關(guān)，而4-乙基-2甲氧基苯酚和吡嗪等25種化合物的含量與醬油感官質(zhì)量呈負(fù)相關(guān)。由此可見(jiàn)，生抽的感官品質(zhì)與其蘊(yùn)含揮發(fā)性化合物的種類與含量密切相關(guān)。

市售醬油在貨架期內(nèi)偶爾會(huì)出現(xiàn)漲袋、胖聽(tīng)或漲瓶的現(xiàn)象，其顏色會(huì)變深且pH值會(huì)升高[4]，引起生抽漲袋的原因主要包括微生物產(chǎn)氣的生物原因、熱脹冷縮的物理原因和酸堿反應(yīng)的化學(xué)原因[5]，蔣雪薇等[6]研究發(fā)現(xiàn)，漲袋的醬油風(fēng)味會(huì)變寡變劣，徐一奇[7]研究表明變質(zhì)醬油中醬香成分明顯減少，出現(xiàn)明顯的酸餿味，其與醬油中總酸及雙乙酰含量的升高有一定關(guān)系。電子鼻技術(shù)具有操作便捷、準(zhǔn)確度高和檢測(cè)周期短等優(yōu)點(diǎn)[8]，氣相色譜-離子遷移譜（gas chromatography-ion mobility spectrometry，GC-IMS）技術(shù)具有靈敏度高、分析速度快和操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)[9]。相較于氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）技術(shù)，GC-IMS無(wú)需對(duì)樣品進(jìn)行處理且其具有更強(qiáng)的分離能力[10]。目前，關(guān)于漲袋生抽的研究主要集中在解析其變質(zhì)微生物的組成上[6]，而對(duì)于漲袋和正常生抽中風(fēng)味物質(zhì)比較分析的研究相對(duì)較少。由此可見(jiàn)，使用電子鼻和GC-IMS聯(lián)用技術(shù)比較分析漲袋和正常生抽中的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)具有較強(qiáng)的可行性。

某生抽生產(chǎn)廠家生產(chǎn)的兩個(gè)批次生抽在儲(chǔ)藏過(guò)程中出現(xiàn)了漲袋現(xiàn)象，本研究采集了2個(gè)漲袋生抽樣品，并以正常的生抽樣品作為對(duì)照，使用電子鼻和GC-IMS聯(lián)用技術(shù)對(duì)兩者揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的差異進(jìn)行了比較分析，以期為生抽漲袋問(wèn)題的解決提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

于2022年7月和8月，從某生抽生產(chǎn)廠家采集生抽樣品3份，其中2份樣品在儲(chǔ)藏過(guò)程中出現(xiàn)了漲袋現(xiàn)象，編號(hào)為J1和J2，同時(shí)采集正常生抽樣品1份，編號(hào)為CK，所有樣品的生產(chǎn)時(shí)間均為2022年5月。

1.2 儀器與設(shè)備

PEN3電子鼻：德國(guó)Airsense公司；FlavourSpecR氣相色譜-離子遷移譜聯(lián)用儀：德國(guó)G.A.S.公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 電子鼻對(duì)生抽的風(fēng)味評(píng)價(jià)

參照SHI J等[11]的方法，并稍作修改，取15 mL待測(cè)生抽于樣品瓶中，在室溫下靜置2 h后，使用電子鼻探頭進(jìn)行檢測(cè)，在60 s的測(cè)試時(shí)間中取已達(dá)平衡的49 s、50 s和51 s時(shí)測(cè)試數(shù)據(jù)的平均值作為檢測(cè)數(shù)據(jù)，取平均值，每個(gè)樣品平行檢測(cè)3次。

1.3.2 GC-IMS對(duì)生抽中揮發(fā)性化合物的解析

取1 mL樣品置于20 mL頂空瓶中，40 ℃平衡15 min后自動(dòng)頂空進(jìn)樣，頂空進(jìn)樣條件設(shè)置如下：進(jìn)樣體積為200 μL，進(jìn)樣針溫度為85 ℃，孵化轉(zhuǎn)速為500 r/min。GC和IMS條件均參照張振東等[12]的方法，最后通過(guò)美國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)研究所（national institute of standards and technology，NIST）和信息管理系統(tǒng)（information management system，IMS）數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)揮發(fā)性化合物進(jìn)行定性分析，通過(guò)峰面積歸一化法確定各物質(zhì)的相對(duì)含量。

1.3.3 相對(duì)氣味活度值計(jì)算

相對(duì)氣味活度值（relative odor activity value，ROAV）是評(píng)價(jià)樣品中各種揮發(fā)性化合物對(duì)于總體風(fēng)味的貢獻(xiàn)[13]，其中0.1≤ROAV≤1的化合物對(duì)于樣品的總體風(fēng)味有重要的貢獻(xiàn)，ROAV≥1的化合物是關(guān)鍵風(fēng)味化合物，ROAV的計(jì)算公式如下：

其中：Ci代表各揮發(fā)性化合物的相對(duì)含量，%；Ti代表各揮發(fā)性化合物相應(yīng)的感覺(jué)閾值，μg/L，Cmax代表對(duì)樣品總體風(fēng)味貢獻(xiàn)最大的揮發(fā)性化合物的相對(duì)含量，%；Tmax代表對(duì)樣品總體風(fēng)味貢獻(xiàn)最大的揮發(fā)性化合物相應(yīng)的感覺(jué)閾值，μg/L。

1.3.4 數(shù)據(jù)處理

使用方差分析對(duì)不同樣品間的差異性進(jìn)行分析；使用Origin 2018軟件繪制揮發(fā)性化合物的柱狀圖；使用SIMCA 14.1.0軟件進(jìn)行偏最小二乘-判別分析（partial least squaresdiscriminant analysis，PLS-DA）建模。

2 結(jié)果與分析

2.1 基于電子鼻技術(shù)漲袋和正常生抽揮發(fā)性風(fēng)味品質(zhì)的比較分析

本研究首先使用電子鼻對(duì)漲袋和正常生抽風(fēng)味品質(zhì)進(jìn)行了評(píng)價(jià)，PEN3電子鼻具有10個(gè)不同的金屬氧化物傳感器，但其中W1S、W2S、W5S和W6S傳感器分別對(duì)甲烷、乙醇、氮氧化物和氫氣敏感，故而本研究?jī)H用剩余6個(gè)傳感器對(duì)漲袋和正常生抽響應(yīng)值的差異性進(jìn)行了分析，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 電子鼻各傳感器對(duì)漲袋和正常生抽響應(yīng)值的比較分析Table 1 Comparative analysis of the response values of each sensor of electronic nose for the light soy sauce in expanded bag and normal bag

由表1可知，傳感器W1C、W3C和W5C對(duì)漲袋生抽的響應(yīng)值顯著偏低（P＜0.05），而傳感器W1W、W2W和W3S對(duì)漲袋生抽的響應(yīng)值顯著偏高（P＜0.05）。結(jié)合各傳感器的性能發(fā)現(xiàn)，生抽漲袋后芳香類物質(zhì)的含量明顯降低，而有機(jī)硫化物、萜類物質(zhì)和烷烴類物質(zhì)的含量明顯升高。

2.2 基于GC-IMS技術(shù)漲袋和正常生抽中揮發(fā)性化合物的比較分析

為了解析漲袋和正常生抽樣品的風(fēng)味差異，本研究使用GC-IMS技術(shù)對(duì)其揮發(fā)性化合物的組成進(jìn)行了比較分析，同時(shí)使用Reporter插件構(gòu)建了差異譜圖，正常生抽樣品的二維俯視圖以藍(lán)色為背景，其中漂移時(shí)間為1.0 ms處的紅色豎線代表反應(yīng)離子峰（reactive ion peak，RIP），RIP峰兩側(cè)的點(diǎn)均代表生抽樣品中存在的揮發(fā)性化合物，紅色越深，點(diǎn)越大，代表該化合物的濃度越高，相反，白色點(diǎn)越深越大，代表對(duì)應(yīng)物質(zhì)的濃度越低。為更清晰地比較漲袋和正常生抽樣品中揮發(fā)性化合物的差異，本研究將正常生抽的二維譜圖作為參比，用漲袋生抽樣譜圖減去參比，而后2個(gè)漲袋生抽樣品的差異譜圖以白色為背景，其中紅色代表該有化合物在漲袋生抽中濃度更高，藍(lán)色代表該化合物在正常生抽中濃度更高，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 漲袋和正常生抽揮發(fā)性化合物的差異譜圖Fig.1 Differential spectra of volatile compounds in the light soy sauce in expanded bag and normal bag

由圖1可知，生抽樣品中的揮發(fā)性組分在1 600 s內(nèi)完成分離，離子遷移時(shí)間處于0.10～1.75 ms之間，漲袋和正常生抽樣品的差異譜圖中紅色點(diǎn)的大小和分布均存在較為明顯的差異，故而可以推測(cè)生抽漲袋后揮發(fā)性化合物的組成和含量具有不同程度的變化。

為了進(jìn)一步解析生抽的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，本研究對(duì)漲袋和正常生抽樣品中的揮發(fā)性化合物進(jìn)行定性定量分析，發(fā)現(xiàn)鑒定出的30種化合物在所有樣品中均存在，共7類揮發(fā)性化合物，分別為醇類、酮類、酯類、酸類、醛類、含硫類和呋喃類物質(zhì)。統(tǒng)計(jì)不同樣品中各類揮發(fā)性化合物的相對(duì)含量，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 漲袋和正常生抽揮發(fā)性化合物類別的相對(duì)含量比較Fig.2 Comparison of the relative contents of volatile compound classes in the light soy sauce in expanded bag and normal bag

由圖2可知，醇類、酮類、酯類、酸類、醛類、含硫類和呋喃類物質(zhì)在漲袋生抽中累計(jì)平均相對(duì)含量分別為56.78%、13.21%、8.96%、6.23%、2.93%、0.52%和0.21%，在正常生抽中平均相對(duì)含量分別為55.72%、15.66%、7.43%、6.91%、5.25%、0.15%和0.07%。經(jīng)方差分析發(fā)現(xiàn)，漲袋和正常生抽樣品中上述物質(zhì)的累計(jì)平均含量差異均不顯著（P＞0.05）。楊曉璇等[14]同樣采用GC-IMS技術(shù)從散裝和品牌醬油中共檢測(cè)出72種揮發(fā)性組分，其中含量最高的分別是醛類、醇類、酮類和酯類，這與本研究結(jié)果類似，但其亦解析出本研究中未發(fā)現(xiàn)的醚類化合物，造成這種現(xiàn)象的原因可能是原料品質(zhì)、生產(chǎn)地區(qū)和制作方式等存在一定差異。

醛類物質(zhì)是醬油中產(chǎn)生麥芽和堅(jiān)果香味的主要成分，可在醇脫氫酶的作用下由醇轉(zhuǎn)化而成，或淀粉類物質(zhì)在酶解后生成的葡萄糖經(jīng)醛酸途徑產(chǎn)生[15]，其在漲袋和正常生抽樣品中平均相對(duì)含量分別為2.93%和5.25%，可見(jiàn)正常生抽可能具有較好的麥芽香和堅(jiān)果香氣。酯類物質(zhì)產(chǎn)生了醬油的基本香氣成分，可通過(guò)醇和酸的酯化形成，或通過(guò)以高級(jí)醇和乙酰輔酶A為底物經(jīng)醇乙酰轉(zhuǎn)移酶的生物合成產(chǎn)生[16]，其在漲袋和正常生抽樣品中累計(jì)平均相對(duì)含量分別為8.96%和7.43%。酮類物質(zhì)是醬油中產(chǎn)生麥芽香味的主要成分，可以通過(guò)脂質(zhì)氧化或Strecker反應(yīng)誘導(dǎo)氨基酸降解產(chǎn)生[17]，其在漲袋和正常生抽樣品中累計(jì)平均相對(duì)含量分別為13.21%和15.66%，可見(jiàn)正常生抽可能具有較好的麥芽香氣。二甲基硫是本研究中唯一被解析出的含硫化合物，其在漲袋和正常生抽樣品中平均相對(duì)含量分別為0.52%和0.15%，鄧岳等[18]使用頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用方法發(fā)現(xiàn)傳統(tǒng)工藝釀造醬油中亦含有該物質(zhì)，雖然在醬油中含量?jī)H為3%，但對(duì)風(fēng)味品質(zhì)形成的影響較大。作為呋喃環(huán)系最重要的衍生物，糠醛是本研究從生抽中檢測(cè)出的唯一呋喃類物質(zhì)，其在漲袋和正常生抽樣品中平均相對(duì)含量分別為0.21%和0.07%，MENG Q等[19]研究表明，糠醛具有較高的揮發(fā)性，是戊糖通過(guò)美拉德反應(yīng)的主要脫水產(chǎn)物，在制曲時(shí)對(duì)大豆和小麥的熱處理過(guò)程中形成。綜上所述，在漲袋生抽中醇類、酯類、二甲基硫和糠醛的累計(jì)含量更高可能是引起其味道刺鼻的主要原因，而正常生抽風(fēng)味相對(duì)溫和且具有較好的麥芽和堅(jiān)果香氣。

2.3 漲袋和正常生抽中關(guān)鍵揮發(fā)性成分的比較分析

由于樣品中揮發(fā)性化合物的相對(duì)含量與其總體風(fēng)味特征之間無(wú)直接的關(guān)系，故而本研究使用相對(duì)氣味活度值（ROAV）對(duì)漲袋和正常生抽的總體風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行了分析，在解析出的30種揮發(fā)性化合物中異戊醇和丁醇等11種化合物具有單體和二聚體兩種形態(tài)，本研究將一個(gè)物質(zhì)中單體和二聚體相對(duì)含量總和記為該物質(zhì)的相對(duì)含量值，并進(jìn)一步計(jì)算了各化合物在漲袋和正常生抽樣品中的ROAV值，ROAV＞0.1的揮發(fā)性化合物測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 漲袋和正常生抽樣品中ROAV＞0.1的揮發(fā)性化合物Table 2 Volatile compounds in the light soy sauce in expanded bag and normal bag (ROAV＞0.1)

由表2可知，乙酸乙酯在生抽中的閾值為5.00 μg/L，且其在漲袋生抽J2樣品中的相對(duì)含量最高，對(duì)生抽整體的風(fēng)味貢獻(xiàn)較大，因此本研究將J2樣品中乙酸乙酯的ROAV定義為100，從而得到生抽中所有解析出化合物的ROAV。經(jīng)統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，在3個(gè)樣品中共存在16種對(duì)生抽總體風(fēng)味具有較為重要貢獻(xiàn)的風(fēng)味化合物，包括4種醇類、5種酯類、3種醛類、3種酮類和1種含硫類。通常認(rèn)為0.1≤ROAV＜1的物質(zhì)是修飾樣品整體風(fēng)味的化合物，ROAV＞1的物質(zhì)是樣品中的關(guān)鍵風(fēng)味化合物，且ROAV越大代表該化合物在樣品的風(fēng)味品質(zhì)中貢獻(xiàn)越大[29]。因此，根據(jù)方差分析結(jié)果，在本研究解析出的10種關(guān)鍵風(fēng)味化合物（ROAV＞1）中，異戊醇、乙酸乙酯、乙酸異戊酯、乙酸-2-甲基丁酯、3-羥基-2-丁酮和二甲基硫6種化合物在漲袋生抽中含量顯著高于正常樣品（P＜0.05），可能是這些化合物的共同作用從而引起漲袋生抽的刺激性氣味；乙酸甲酯、2-甲基丁醛和丙酮等3種化合物在正常生抽中含量顯著高于漲袋樣品（P＜0.05），而2-甲基丙醛僅在J2漲袋生抽樣品中含量顯著高于正常樣品（P＜0.05），J1中顯著低于正常樣品（P＜0.05），故而無(wú)法明確生抽漲袋變質(zhì)對(duì)于2-甲基丙醛含量的影響。

2.4 漲袋和正常生抽中差異揮發(fā)性化合物分析

為了進(jìn)一步解析漲袋和正常生抽中具有顯著差異的揮發(fā)性化合物，本研究使用PLS-DA對(duì)解析出的30種化合物進(jìn)行了投影變量重要性（variable important in projection，VIP）分析，并繪制了差異揮發(fā)性化合物的熱圖，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 漲袋和正常生抽中差異揮發(fā)性化合物偏最小二乘回歸分析熱圖Fig.3 Heat map of partial least squares discriminant analysis of differential volatile compounds in expanded and normal light soy sauce

由圖3可知，漲袋和正常生抽中共存在11種差異揮發(fā)性化合物，包括異戊醇、3-羥基-2-丁酮、丙酮、乙酸乙酯、2-丁醇、乙醇、1-丙醇、異丁醇、2-丁酮、苯甲醛和乙酸，其VIP值分別為2.04、2.00、1.62、1.53、1.42、1.35、1.33、1.33、1.18、1.14和1.08。相較于正常生抽，漲袋生抽中異丁醇、1-丙醇、3-羥基-2-丁酮、異戊醇、乙酸乙酯和2-丁醇的含量相對(duì)偏高，而乙醇、丙酮、2-丁酮、苯甲醛和乙酸的含量相對(duì)偏低，故而可推測(cè)漲袋生抽風(fēng)味品質(zhì)變差可能與這些化合物含量的變化有關(guān)。

為了分析生抽樣品中差異揮發(fā)性化合物與其風(fēng)味品質(zhì)的相關(guān)性，本研究結(jié)合電子鼻數(shù)據(jù)繪制熱圖，結(jié)果見(jiàn)圖4。由圖4可知，丙酮和苯甲醛含量與W2W（對(duì)有機(jī)硫化物靈敏）和W3S（對(duì)烷烴靈敏）均呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05），2-丁酮含量與W1C（對(duì)芳香類物質(zhì)靈敏）和W5C（對(duì)烷烴、芳香類物質(zhì)靈敏）均呈顯著正相關(guān)（P＜0.05），與W3C（對(duì)氨氣、芳香類物質(zhì)靈敏）呈極顯著正相關(guān)（P＜0.001），與W1W（對(duì)有機(jī)硫化物、萜類物質(zhì)靈敏）呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05）。綜上所述，漲袋后生抽中腐敗微生物可能對(duì)丙酮、2-丁酮和苯甲醛等風(fēng)味化合物進(jìn)行了利用，這可能是引起漲袋生抽中芳香類物質(zhì)的含量明顯降低，而有機(jī)硫化物、萜類物質(zhì)和烷烴類物質(zhì)的含量明顯升高的一個(gè)重要原因。

3 結(jié)論

本研究采用電子鼻和GC-IMS技術(shù)對(duì)漲袋生抽樣品的風(fēng)味進(jìn)行了解析，電子鼻結(jié)果顯示，生抽漲袋后其風(fēng)味品質(zhì)明顯變差，主要表現(xiàn)出芳香類物質(zhì)含量降低及機(jī)硫化物、萜類物質(zhì)和烷烴類物質(zhì)含量的增加，而GC-IMS結(jié)果顯示生抽漲袋后異丁醇、1-丙醇、3-羥基-2-丁酮、異戊醇、乙酸乙酯和2-丁醇的含量相對(duì)增高，而乙醇、丙酮、2-丁酮、苯甲醛和乙酸的含量相對(duì)降低，相關(guān)性分析顯示，引起漲袋生抽風(fēng)味品質(zhì)變劣的主要原因可能與丙酮、苯甲醛和2-丁酮含量的降低相關(guān)。