楊 豪,楊圓慧,李為蘭,資璐熙,徐檸檬,郭 磊*
(西南林業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,云南 昆明 650224)
美味牛肝菌(Boletus edulisBull.Fr.)是珍稀的肉質(zhì)大型真菌,在我國主要分布于西部地區(qū)[1-2]。美味牛肝菌兼具食藥用價值,含有蛋白質(zhì)、氨基酸、維生素等多種營養(yǎng)成分及多糖、多酚和黃酮等多種活性成分[3-5],具有抗氧化、增強免疫力、預(yù)防腫瘤細胞增殖、調(diào)節(jié)腸胃、促消化、清熱解毒、增強機體清除自由基的能力、抑制肥胖等多種生理功能[6-9]。美味牛肝菌的風(fēng)味成分主要由揮發(fā)性的呈香成分和非揮發(fā)性呈味成分組成。揮發(fā)性呈香成分主要包括醇、酮、酸、酯、醛、烴類化合物等,組成了美味牛肝菌的特征風(fēng)味,其中苯甲醛呈現(xiàn)出櫻桃和堅果氣味,己醛呈現(xiàn)出果香、花香、木香和葉香等[10-13]。目前,頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜(headspace solid phase microextraction-gas chromatographymass spectrometry,HS-SPME-GC-MS)已廣泛應(yīng)用于檢測果蔬中的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì),具有方便快捷、靈敏度高、選擇性與重復(fù)性好的特點[14-15]。非揮發(fā)性呈味成分主要包括呈味核苷酸、有機酸、可溶性糖等,其中呈味核苷酸和有機酸可增添口感層次,可溶性糖可產(chǎn)生甜味[16-17]。
我國美味牛肝菌資源豐富,固體風(fēng)味基料能夠較好地保持美味牛肝菌特有的天然風(fēng)味,提高人們對食品的接受度,也符合食品工業(yè)健康營養(yǎng)的要求[18-19]。因此,本研究以料液比、熬制溫度、熬制時間為自變量,以蛋白質(zhì)溶出率為響應(yīng)值,在單因素試驗基礎(chǔ)上,采用響應(yīng)面試驗優(yōu)化美味牛肝菌湯的最佳熬制工藝;以美味牛肝菌湯凍干粉為基料,采用HS-SPME/GC-MS分析其揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)組成,并采用均勻設(shè)計優(yōu)化美味牛肝菌湯風(fēng)味基料的配方,為美味牛肝菌湯及其固體風(fēng)味基料的工業(yè)化生產(chǎn)提供一定的理論基礎(chǔ)。
美味牛肝菌:2022年6月購自云南玉溪易門;牛血清蛋白、考馬斯亮藍G-250、氯化鈉(均為分析純):上海勵瑞生物技術(shù)有限公司;食鹽、白砂糖、味精、檸檬酸:市售。
FA1004型電子天平:上海精密科學(xué)儀器有限公司;DZF-6020型真空干燥箱:上海博迅實業(yè)有限公司;YB-250A型高速多功能粉碎機:永康市速鋒工貿(mào)有限公司;UV-VIS 300紫外分光光度計:美國賽默飛世爾科技有限公司;HH-2數(shù)顯電子恒溫水浴鍋:北京康光儀器有限公司;YTLG-12A型真空冷凍干燥機:上海葉拓科技有限公司;7890B氣質(zhì)聯(lián)用儀:美國Agilent公司;57328-U型50/30 μmDVB/CAR/PDMS固相微萃取頭:美國Supelco公司。
1.3.1 美味牛肝菌湯的熬制工藝流程
美味牛肝菌→清洗→晾干→切片→真空干燥→粉碎→熬煮→菌湯
操作要點[20]:挑選新鮮美味牛肝菌,洗凈后瀝干水分,切成厚度約為0.5 cm的片狀,70 ℃條件下真空干燥8 h,粉碎后過60目篩后備用。取美味牛肝菌粉1 g,按照料液比1∶70(g∶mL)加入去離子水,密封,70 ℃熬制55 min,待熬制試驗結(jié)束后,過濾去渣后得到濾液,即為美味牛肝菌湯。
1.3.2 美味牛肝菌湯熬制工藝優(yōu)化
(1)單因素試驗
設(shè)置基礎(chǔ)條件為料液比1∶70(g∶mL)、熬制溫度70 ℃、熬制時間55 min,探究不同料液比(1∶40、1∶50、1∶60、1∶70、1∶80、1∶90(g∶mL))、熬制溫度(40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃、90 ℃)、熬制時間(35 min、45 min、55 min、65 min、75 min、85 min)對美味牛肝菌湯蛋白質(zhì)溶出率的影響。
(2)響應(yīng)面試驗
在單因素試驗結(jié)果基礎(chǔ)上,以料液比(A)、熬制溫度(B)和熬制時間(C)為自變量,蛋白質(zhì)溶出率(Y1)為響應(yīng)值,使用Design-Expert 13軟件進行3因素3水平的響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計,試驗因素與水平見表1。
表1 美味牛肝菌湯熬制工藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface experiments for cooking process optimization of Boletus edulis soup
1.3.3 蛋白質(zhì)溶出率的計算
采用凱氏定氮法[21]對美味牛肝菌中的蛋白質(zhì)總含量進行測定。采用考馬斯亮藍法[22]對菌湯中的可溶性蛋白質(zhì)含量進行測定,計算蛋白質(zhì)溶出率,其計算公式如下:
式中:C1為菌湯中蛋白質(zhì)含量,mg/mL;V1為菌湯體積,mL;M為蛋白質(zhì)總含量,mg。
1.3.4 美味牛肝菌湯凍干粉揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)分析
將美味牛肝菌湯凍結(jié)放入真空冷凍干燥機內(nèi),干燥24 h得美味牛肝菌湯凍干粉。參考FENG T等[23]的HS-SPME-GCMS法略微修改,測定美味牛肝菌湯凍干粉揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)。
萃取頭老化:采用50/30 μm DVB/CAR/PDMS固相微萃取頭,初次使用時需在GC進樣口以250 ℃老化30 min,之后每次使用前均老化10 min。
HS-SPME條件:稱取美味牛肝菌凍干粉樣品0.500 g于20 mL頂空瓶中,在79 ℃條件下萃取28 min后,將老化好的萃取頭插入頂空瓶吸附23 min,然后迅速將萃取頭插入氣相色譜進樣口進行解吸。
GC條件:HP-5MS毛細管色譜柱(30 m×0.25 mm,0.25 μm),載氣為高純氦氣(He),流速1.0 mL/min,不分流模式進樣,進樣口溫度250 ℃。升溫程序為初始溫度40 ℃,保持5 min,以5 ℃/min升溫至260 ℃,保持2 min。
質(zhì)譜條件:電子電離(electronic ionization,EI)源,電子能量70 eV,傳輸線溫度250 ℃,離子源溫度230 ℃,四極桿溫度150 ℃,掃描方式為全掃描,30~400 m/z。
定性、定量分析:經(jīng)美國國家標準技術(shù)研究所(national institute of standards and technology,NIST)Library 14.0譜圖庫檢索,并結(jié)合相關(guān)文獻報道確定其成分,相對百分含量按峰面積歸一化法計算[24]。
1.3.5 美味牛肝菌湯固體風(fēng)味基料配方優(yōu)化均勻試驗
以美味牛肝菌凍干粉為基料,參考費英敏等[25]的試驗設(shè)計,以食鹽(X1)、白砂糖(X2)、味精(X3)、檸檬酸(X4)為輔料,以感官評分(Y2)為評價指標,采用Excel 2021設(shè)計U9(95)均勻試驗優(yōu)化固體風(fēng)味基料的配方,試驗因素與水平見表2。
表2 美味牛肝菌固體風(fēng)味基料配方優(yōu)化均勻試驗因素與水平Table 2 Factors and levels of uniform tests for formula optimization of Boletus edulis solid flavor base material
1.3.6 美味牛肝菌固體風(fēng)味基料的感官評價
以美味牛肝菌湯凍干粉為原料調(diào)配固體風(fēng)味基料,由10名(男性女性各5名)經(jīng)過專業(yè)培訓(xùn)的感官評價人員組成評價小組,從香味、滋味及色澤三個方面對其進行感官評價。在感官評價過程中,對樣品進行隨機編號,使感官評價人員進行獨立客觀的評價,具體感官評分標準見表3[26]。
表3 美味牛肝菌固體風(fēng)味基料感官評分標準Table 3 Sensory score standards of Boletus edulis solid flavor base material
1.3.7 數(shù)據(jù)分析
所有數(shù)據(jù)均平行測定3次,結(jié)果以“平均數(shù)±標準差”表示。試驗數(shù)據(jù)處理由Excel 2021完成,作圖由Origin 2017和Design-Expert 13完成,方差分析由SPSS 20.0完成。
2.1.1 料液比對美味牛肝菌湯蛋白質(zhì)溶出率的影響
料液比對美味牛肝菌湯蛋白質(zhì)溶出率的影響見圖1。由圖1可知,美味牛肝菌湯中蛋白質(zhì)溶出率隨料液比的增加呈現(xiàn)先急劇增加后趨于減小的趨勢,當料液比為1∶70時,蛋白質(zhì)溶出率達到最高,為18.11%。料液比越小,美味牛肝菌與溶劑混合越充分、均勻,溶質(zhì)分子更容易分散于溶劑中,有利于蛋白質(zhì)溶出,但原料中蛋白質(zhì)含量是一定的,存在溶解平衡,當料液比持續(xù)減小時蛋白質(zhì)溶出率不會進一步增加,反而會呈現(xiàn)降低的趨勢[27],故確定最佳料液比為1∶70(g∶mL)。
圖1 料液比對美味牛肝菌湯蛋白質(zhì)溶出率的影響Fig.1 Effect of solid and liquid ratio on the protein dissolution rate of Boletus edulis soup
2.1.2 熬制溫度對美味牛肝菌湯蛋白質(zhì)溶出率的影響
熬制溫度對美味牛肝菌湯蛋白質(zhì)溶出率的影響見圖2。由圖2可知,隨熬制溫度的升高,美味牛肝菌湯中的蛋白質(zhì)溶出率呈先增大后減小的趨勢,當熬制溫度為70 ℃時,蛋白質(zhì)溶出率達到最大,為18.34%,分析原因可能是由于高溫條件下蛋白質(zhì)會變性造成溶解度下降[28],故確定最佳熬制溫度為70 ℃。
2.1.3 熬制時間對美味牛肝菌湯蛋白質(zhì)溶出率的影響
熬制時間對美味牛肝菌湯蛋白質(zhì)溶出率的影響見圖3。由圖3可知,美味牛肝菌湯的蛋白質(zhì)溶出率隨著熬制時間的延長呈先增大后減小的趨勢,當熬制時間為45 min時,蛋白質(zhì)溶出率最大,達18.77%,此時菌湯中含氮化合物含量最高。熬制時間>45 min后,蛋白質(zhì)溶出率急劇下降,可能是蛋白質(zhì)在長時間熬制下發(fā)生水解反應(yīng),蛋白質(zhì)的水解速率大于溶出速率[29],導(dǎo)致蛋白質(zhì)溶出率降低,因此,確定最佳熬制時間為45 min。
圖3 熬制時間對美味牛肝菌湯蛋白質(zhì)溶出率的影響Fig.3 Effect of cooking time on the protein dissolution rate of Boletus edulis soup
2.2.1 響應(yīng)面回歸模型的建立及分析
在單因素試驗結(jié)果的基礎(chǔ)上,以料液比(A)、熬制溫度(B)和熬制時間(C)為自變量,蛋白質(zhì)溶出率(Y1)為響應(yīng)值,采用Design-Expert 13設(shè)計3因素3水平的響應(yīng)面優(yōu)化試驗,試驗設(shè)計及結(jié)果見表4,方差分析見表5。
表4 美味牛肝菌湯熬制工藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗設(shè)計與結(jié)果Table 4 Design and results of response surface tests for cookingprocess optimization of Boletus edulis soup
采用Design-Expert 13軟件對表4結(jié)果進行多元回歸擬合,得到回歸方程:Y1=20.58+1.02A-0.0375B+0.02C+0.645AB-0.035AC+0.26BC-2.05A2-1.7B2-0.745 5C2。
由表5可知,該模型顯著(P<0.05),失擬項不顯著(P>0.05),說明該模型具有較強的統(tǒng)計學(xué)意義。由P值可知,一次項A,二次項A2、B2、C2對蛋白質(zhì)溶出率的影響極顯著(P<0.01),交互項AB對蛋白溶出率影響顯著(P<0.05),其他項對蛋白質(zhì)溶出率影響不顯著(P>0.05)。由F值可知,各因素對美味牛肝菌湯蛋白質(zhì)溶出率影響的大小順序為料液比(A)>熬制溫度(B)>熬制時間(C)。
2.2.2 各因素間交互作用分析
采用Design-Expert 13軟件繪制料液比與熬制溫度間交互作用對蛋白質(zhì)溶出率影響的響應(yīng)面及等高線圖見圖4。
圖4 料液比與熬制溫度間交互作用對蛋白質(zhì)溶出率影響的響應(yīng)曲面及等高線Fig.4 Response surface plot and contour lines of effects of interaction between solid and liquid ratio and cooking temperature on protein dissolution rate
由圖4可知,料液比和熬制溫度間交互作用對美味牛肝菌湯蛋白質(zhì)溶出率影響的響應(yīng)面陡峭,等高線呈橢圓形,說明其對菌湯蛋白質(zhì)溶出率的影響顯著,與方差分析結(jié)果一致。
2.2.3 驗證試驗
采用Excel 2021對回歸方程進行求解,得美味牛肝菌湯熬制的最佳工藝條件為料液比1∶73.69(g∶mL)、熬制溫度68.76 ℃、熬制時間53.10 min,此條件下蛋白質(zhì)溶出率預(yù)測值為20.10%??紤]實際操作,將試驗條件調(diào)整為料液比1∶74(g∶mL)、熬制溫度70 ℃、熬制時間50 min,在此條件下蛋白質(zhì)溶出率實際值為20.12%,與理論值相差0.02%,說明該回歸模型與實際試驗過程匹配度高,可以有效地優(yōu)化美味牛肝菌的熬制工藝。
采用HS-SPME-GC-MS對美味牛肝菌湯凍干粉的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進行分析,結(jié)果見表6。
表6 美味牛肝菌湯凍干粉揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)GC-MS分析結(jié)果Table 6 Results of volatile flavor components of Boletus edulis soup lyophilized powder analyzed by GC-MS
由表6可知,從美味牛肝菌湯凍干粉中共檢測出29種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì),其中烴類4種、醇類1中、醛類4種、酮類5種、酸類1種、酯類2種、醚類1種、含硫化合物3種及含氮化合物8種。酮類化合物相對含量(31.66%)最高,其次為含氮化合物(26.46%)和酸類化合物(19.00%)。美味牛肝菌湯凍干粉中揮發(fā)性C8化合物和含硫化合物因含量豐富、識別閾值較低,且對食用菌的風(fēng)味品質(zhì)影響較大,被認為是食用菌中的特征揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)[30]。在檢測到的C8化合物中,苯乙醛是具有類似水果的香氣[31],相對含量為0.93%。含硫化合物主要有2-異丁基5-丙基噻吩(4.58%)、3-甲硫基丙醛(0.45%)和甲硫醇(0.36%)。吡嗪類化合物相對含量為1.67%,是羰基化合物與氨基化合物在一定條件下發(fā)生美拉德反應(yīng)的產(chǎn)物[32]。
以美味牛肝菌湯凍干粉為基料,食鹽(X1)、白砂糖(X2)、味精(X3)和檸檬酸(X4)為輔料,感官評分(Y2)為評價指標,通過均勻試驗U9(95)優(yōu)化配方,結(jié)果見表7,方差分析見表8。
表7 美味牛肝菌固體風(fēng)味基料配方優(yōu)化均勻試驗設(shè)計及結(jié)果Table 7 Design and results of uniform tests for formula optimization of Boletus edulis solid flavor base material
表8 均勻試驗結(jié)果的方差分析Table 8 Variance analysis of uniform tests results
采用Excel 2021對表7試驗結(jié)果進行線性回歸分析,得到食鹽(X1)、白砂糖(X2)、味精(X3)、檸檬酸(X4)對感官評分(Y2)的線性回歸方程:Y2=92.847+6.672X1-2.193X2+3.127X3-4.934X4。由表8可知,回歸模型極顯著(P<0.01),表明建立的回歸方程具有統(tǒng)計學(xué)意義。決定系數(shù)R2=0.996,調(diào)整決定系數(shù)R2Adj=0.986,說明該數(shù)學(xué)模型與試驗結(jié)果擬合較好[33]。根據(jù)t檢驗可知,影響固體風(fēng)味基料感官評價的因素主次順序為X1>X4>X2>X3。對回歸方程求解得到美味牛肝菌固體風(fēng)味基料的最優(yōu)配方為:食鹽4.5%、白砂糖3.0%、味精1.8%、檸檬酸0.1%,在此條件下預(yù)測得到的感官評分為93.13分。通過驗證試驗得固體風(fēng)味基料感官評分為93.22分,與理論值相差0.09,制備得到的固體風(fēng)味基料顏色成淺棕褐色,具有濃郁的美味牛肝菌風(fēng)味,表明所建立的模型與試驗結(jié)果具有較好的一致性,能夠?qū)腆w風(fēng)味基料配方進行優(yōu)化。
在單因素試驗基礎(chǔ)上,采用響應(yīng)面法優(yōu)化得到美味牛肝菌湯的最佳熬制工藝為料液比1∶74(mL∶g)、熬制溫度70 ℃、熬制時間50 min,在此條件下的蛋白質(zhì)溶出率達20.12%。通過HS-SPME/GC-MS鑒定美味牛肝菌湯凍干粉,共檢出29種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì),酮類化合物(31.66%)、含氮化合物(26.46%)和酸類(19%)是相對含量最高的三類。以菌湯凍干粉為基料,采用均勻設(shè)計研制出美味牛肝菌固體風(fēng)味基料的最佳配方為食鹽4.5%、白砂糖3.0%、味精1.8%、檸檬酸0.1%,制備得到的固體風(fēng)味基料顏色成淺棕褐色,具有濃郁的美味牛肝菌風(fēng)味,感官評分為93.22分。本研究結(jié)果為美味牛肝菌深加工及風(fēng)味調(diào)味料的研究奠定一定的理論基礎(chǔ),有著廣闊的市場發(fā)展前景。