益母草堿、黃精多糖、脫氧野尻霉素聯合用藥抗血栓和降血糖療效的評價

王子麗，許舒雯，邊金煥，趙 輝，龔祝南，

(1. 南京師范大學食品與制藥工程學院，江蘇 南京 210046；2. 安徽省科學技術研究院，安徽 合肥 230088；3. 南京師范大學生命科學學院，江蘇 南京 210046)

研究證實，糖尿病患者血漿中4項凝血纖溶指標含量明顯高于非糖尿病患者[1]，體內高胰島素血癥、高血糖、胰島素抵抗這些因素可以導致糖尿病患者的內皮細胞結構和功能比正常人更容易受到損傷[2-3]，使得糖尿病患者更容易誘發(fā)血栓形成[4]。血栓形成后可誘發(fā)并加重糖尿病的其他并發(fā)癥，因此，了解并針對糖尿病血栓并發(fā)癥的發(fā)病機制，采取適當的防治措施，可減緩糖尿病血栓并發(fā)癥的發(fā)展[5]，提高糖尿病患者的生存質量。目前，已知的抗血栓藥物不良反應較多[6]，中藥在血栓治療歷程中具有重要的地位[7]，活血化瘀是中醫(yī)抗血栓的黃金治則。益母草中活性成分益母草堿(leonurine，SCM)的活血化瘀功效，及其在抗糖尿病和血栓方面的治療效果，已經得到充分驗證[8-9]；黃精的主要成分黃精多糖(polygonatum polysaccharide，PSP)具有降血糖、調血脂的作用[10]；脫氧野尻霉素(deoxynojirimycin，DNJ)也已被證實可有效降低血糖[11]。這3者的聯合使用在治療Ⅱ型糖尿病和血栓方面的療效及其作用機制，是我們這項研究的主要目的。

斑馬魚擁有70%的人類同源基因，且含有凝血因子、血小板受體，對臨床應用的抗凝血和抗血栓藥物具有很好的反映，使其成為廣泛研究人類疾病的新型動物模型[12]。本文在建立糖尿病模型的基礎上，利用苯肼(phenyl hydrazine，PH)、花生四烯酸(arachidonic acid，AA)、普納替尼(ponatinib，PT)3種不同誘導劑建立不同機制的斑馬魚糖尿病合并血栓模型，研究SCM、PSP、DNJ聯合用藥抗血栓、降血糖的效果和作用機制，為下一步藥物開發(fā)提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物斑馬魚(AB系野生型)購自杭州環(huán)特生物科技股份有限公司(生產許可證號SCXK(浙)2021-0003)。

1.2 藥品與試劑SCM(批號AGW576)、PSP(批號20191113)、DNJ(批號F20245)由安徽省科學技術研究院提供。鏈脲佐菌素(streptozocin，STZ，批號20191022)購自廣州賽國生物科技有限公司；鹽酸二甲雙胍(metformin，Met，批號c10619732)購自上海麥克林生化科技有限公司；苯肼(批號G2030006)、花生四烯酸(批號A111764)、普納替尼(批號F1511088)、阿司匹林(aspirin，ASP，批號H2017089)、鄰聯茴香胺(批號C2009167)、無水醋酸鈉(批號2004091)購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；30%過氧化氫(批號ZCD150)購自廣州檢測科技有限公司；肌球蛋白輕鏈激酶亞型(myosin light chain kinase，Mlck1a)、蛋白激酶Cα(protein kinase C alpha，PKCα)、血管性血友病因子(von Willebrand factor，vWF)、β-actin(批號2313111474)引物購自生工生物工程(上海)股份有限公司；實時熒光定量聚合酶鏈反應(real-time quantitative polymerase chain reaction，qRT-PCR，批號7E531L1)試劑盒購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司；QuantiChromTMGlucose Assay Kit葡萄糖測試盒(批號DIGL-100)購自北京群曉科苑生物技術有限公司。

1.3 儀器恒溫光照培養(yǎng)箱(寧波東南儀器有限公司)；IM-9B型手動斑馬魚顯微注射泵(日本 Narishige公司)；酶標儀(美國BIO-TEK ELx808)；PCR儀(美國ABI 2720 Step One Plus)；超微量分光光度計(美國Nano drop，ND-1000)；qRT-PCR儀(瑞士Roche公司)；EVOS新型顯微鏡細胞成像系統(tǒng)(美國Life Technologies公司)。

1.4 方法

1.4.1藥物對斑馬魚早期發(fā)育毒性的影響 挑選受精24 h后發(fā)育正常的斑馬魚胚胎，每孔6顆放入24孔板，每個藥物設置6個濃度梯度，每個濃度設置3個平行復孔，另設一孔觀察毒性對于斑馬魚形態(tài)的影響?？瞻讓φ战M暴露在胚胎培養(yǎng)基中，實驗組暴露于不同濃度的Met+ASP、SCM、PSP、DNJ中。置于28 ℃恒溫光照培養(yǎng)箱中，統(tǒng)計并記錄暴露后24、48、72、96、120 h時斑馬魚胚胎死亡、孵化情況，在受精后6 d(days post fertilization，dpf)計算各藥物對斑馬魚半數致死濃度(lethal concentration 50 %，LC50)。4 dpf通過EVOS新型顯微鏡細胞成像系統(tǒng)觀察斑馬魚給藥后的形態(tài)變化。

1.4.2苯肼、花生四烯酸、普納替尼誘導三種糖尿病斑馬魚血栓模型的建立及藥物干預 選擇2 dpf的斑馬魚胚胎顯微注射構建Ⅱ型糖尿病模型[13 - 14]。用0.1 mol·L-1檸檬酸鈉緩沖液溶解鏈脲佐菌素配成200 mg·L-1溶液，把斑馬魚胚胎放置在瓊脂糖凝膠板的凹槽內，每尾斑馬魚幼魚注射的體積約是2 nL，注射完成的胚胎立即放回培養(yǎng)基，后放入培養(yǎng)箱，每隔8 h觀察，移除脫下的卵黃膜，培養(yǎng)至建立血栓模型。

3 dpf的斑馬魚血小板含量豐富，因此選擇3 dpf的斑馬魚用于PH、AA模型構建，5 dpf的斑馬魚內皮細胞生長完整，選擇5 dpf的斑馬魚用于PT模型構建。注射STZ后的健康斑馬魚胚胎，分別在3 dpf和5 dpf分到24孔板中，設置對照組(Control)、模型組(1 μmol·L-1PH處理制備PH model，80 μmol·L-1AA處理制備AA model，5 mg·L-1PT處理制備PT model)、陽性藥組(Met+ASP)、聯合藥物高、中、低濃度干預組，3個模型實驗各設6個實驗組，每組60～70尾。對照組用培養(yǎng)基培養(yǎng)，PH和AA的給藥組用對應濃度的藥液預處理6 h[15]，后將模型組替換為造模劑，給藥組替換為含造模劑與對應濃度藥液的培養(yǎng)液，在28 ℃恒溫培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)(PH 24 h，AA 1.5 h，PT 18 h)，取5尾用于尾靜脈和心臟紅細胞染色觀察，取30尾用于斑馬魚總RNA提取，25尾用于斑馬魚組織糖含量測定。

1.4.3鄰聯茴香胺染色 移除24孔板中培養(yǎng)液，吸取同體積的鄰聯茴香胺染色液3 mL，錫箔紙避光染色，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中，黑暗孵育10～15 min，取出微孔板，快速吸干染色液，用二甲基亞砜快速清洗3遍，將斑馬魚轉到新的24孔板中，加入等體積二甲基亞砜。吸出斑馬魚側位放置于載玻片上，置于顯微鏡下對心臟及尾靜脈觀察并拍照，用Image-Pro Plus統(tǒng)計斑馬魚心臟染色強度(staining intensity，SI)，進行定量分析。

抑制血栓率/%=[SI(藥物干預組)-SI(模型組)]/[SI(正常對照組)-SI(模型組)]×100 %。

1.4.4qRT-PCR檢測血栓相關基因mRNA表達 對照組、模型組、陽性藥組和聯合藥物高中低濃度干預組分別選取25尾斑馬魚幼魚，按照試劑盒說明書提取斑馬魚組織總RNA并合成cDNA，進行qRT-PCR分析，引物序列見Tab 1。

Tab 1 qRT-PCR primer sequences

1.4.5幼魚的組織糖含量測定 將斑馬魚吸取到離心管中，吸干培養(yǎng)液，加入200 μL磷酸鹽緩沖液充分研磨，12 000 r·min-1，4 ℃，離心10 min，按QuantiChromTMGlucose Assay Kit葡萄糖試劑盒方法進行測定。

2 結果

2.1 陽性藥物和各給藥組對斑馬魚死亡率的影響如Fig1所示，Met+ASP組隨著給藥濃度增加，死亡率增高(Fig 1A)；SCM與PSP毒性相當，當SCM濃度高于400 mg·L-1時，6 dpf斑馬魚死亡率接近100%，LC50值為317.4 mg·L-1(Fig 1B)；當PSP濃度達到400 mg·L-1時，6 dpf斑馬魚死亡率高于77.78%，LC50值為300.6 mg·L-1(Fig 1C)；DNJ的毒性相比較小，只有高濃度組達到100%，且1 g·L-1DNJ對斑馬魚的毒性非常小，在3 dpf時斑馬魚死亡率僅為5.56%，之后實驗周期內保持不變(Fig 1D)。

Fig 1 Effects of Met+ASP，SCM，PSP，DNJ on zebrafish mortalityA：Met+ASP; B：SCM：C：PSP; D：DNJ

2.2 陽性藥物和各給藥組對斑馬魚孵化率的影響孵化不僅是斑馬魚胚胎發(fā)育的重要階段，也是評估化學物質對魚類作用的一個主要毒理學重點。孵化是生理、生化和滲透機制共同作用的結果，斑馬魚胚胎一般從受精后48 h(hours post fertilization，hpf)開始孵化，大多數胚胎在72 hpf孵化，在96 hpf孵育幾乎完成。從圖中可以看出各種藥物在48 hpf孵化率在50%左右，隨著時間增長，孵化率增加。與空白組相比，無論暴露在哪種藥物中，高劑量給藥組的斑馬魚胚胎的孵化被延遲且孵化率達不到100 %，而較低劑量給藥組能夠促進胚胎孵化(Fig 2)。

Fig 2 Effects of Met+ASP，SCM，PSP，DNJ on hatching rate of embryos A：Met+ASP; B：SCM：C：PSP; D：DNJ.

2.3 陽性藥物和各給藥組對斑馬魚發(fā)育過程中形態(tài)變化的影響藥物對斑馬魚的毒性主要表現在卵黃囊水腫、脊柱和尾巴彎曲、心包水腫。Met+ASP隨著給藥濃度增高，卵黃囊腫變大(Fig 3A)；當SCM高于300 mg·L-1時，隨著濃度的增大斑馬魚卵黃囊水腫越來越明顯，且出現心包水腫、脊柱彎曲、色素沉著的現象(Fig 3B)；PSP低濃度組卵黃囊未見明顯變化，濃度高于320 mg·L-1時，明顯出現脊椎彎曲、卵黃囊腫等現象(Fig 3C)；低濃度DNJ對斑馬魚的毒性較小，僅有卵黃囊變黑現象，斑馬魚卵黃囊腫大、心包水腫在高濃度組時表現得明顯(Fig 3D)。

Fig 3 Effects of Met+ASP，SCM，PSP，DNJ on toxicity of juvenile zebrafishA：Met+ASP; B：SCM：C：PSP; D：DNJ.

綜合考慮死亡率、孵化率以及形態(tài)特征變化，確定陽性藥組(Met 200 mg·L-1+ASP 10 mg·L-1)以及聯合藥物高濃度組(SCM 150 mg·L-1，PSP 80 mg·L-1，DNJ 1 g·L-1)、中濃度組(SCM 75 mg·L-1，PSP 40 mg·L-11，DNJ 500 mg·L-1)、低濃度組(SCM 37.5 mg·L-1，PSP 20 mg·L-1，DNJ 250 mg·L-1)的給藥濃度。

2.4 聯合用藥對苯肼誘發(fā)糖尿病斑馬魚血栓模型的影響苯肼是強氧化劑，通過促進血小板黏附，造成血栓的形成。如Fig 4所示，與對照組比，PH模型組尾靜脈血栓明顯增加，心臟紅細胞染色強度較少(P<0.01)，說明建模成功。與PH模型組比，陽性藥(Met+ASP)干預后尾靜脈血栓減少明顯，心臟紅細胞染色強度明顯增加(P<0.01)，抑制血栓效率達68.38%；低濃度組尾靜脈血栓較多，心臟紅細胞染色強度較模型組增加(P<0.01)，抑制血栓率為19.46%；中濃度組尾靜脈形成量較模型組減少，心臟紅細胞染色強度增加(P<0.01)，抑制血栓率為32.23%；高濃度組尾靜脈形成量較模型組明顯減少，心臟紅細胞染色強度明顯增加(P<0.01)，抑制血栓效率達51.23%。各劑量組抑制血栓效率，表現出劑量相關性。

Fig 4 Venous thrombus and cardiac erythrocyte staining in zebrafish after drug intervention in phenylhydrazine model

2.5 聯合用藥對花生四烯酸誘發(fā)糖尿病斑馬魚血栓模型的影響花生四烯酸通過激活血小板聚集，調節(jié)血管收縮，造成血栓。如Fig 5所示，與對照組比，AA模型組尾靜脈血栓明顯增加，而心臟紅細胞染色強度明顯減少(P<0.01)，說明建模成功；與AA模型組比，陽性藥(Met+ASP)干預后明顯可見尾靜脈血栓減少，心臟紅細胞染色強度明顯增加(P<0.01)，抑制血栓效率達62.01%；低濃度組尾靜脈血栓較多，心臟紅細胞染色強度與模型組相比(P<0.01)，抑制血栓率為25.03%；中濃度組尾靜脈形成量較模型組相比減少不明顯，心臟紅細胞染色強度(P<0.01)，抑制血栓率為33.58%；高濃度組血栓尾靜脈形成量較模型組明顯減少，心臟紅細胞染色強度明顯增加(P<0.01)，抑制血栓效率達46.12%。各劑量組的抑制血栓效率，表現出劑量相關性。

Fig 5 Venous thrombus and cardiac erythrocyte staining in zebrafish after drug intervention in the arachidonic acid model

2.6 聯合用藥對普納替尼誘發(fā)糖尿病斑馬魚血栓模型的影響普納替尼通過調節(jié)某些通路表達誘導血栓形成。如Fig 6所示，與對照組比，PT模型組尾靜脈血栓增加非常明顯，而心臟紅細胞染色強度明顯減少(P<0.01)，說明建模成功；與PT模型組比，陽性藥(Met+ASP)干預后尾靜脈血栓減少明顯，僅有較少的血栓且被斑馬魚自身黑色素遮擋，心臟紅細胞染色強度明顯增加(P<0.01)，抑制血栓效率達69.36%；低濃度組尾靜脈血栓較多，心臟紅細胞染色強度(P=0.398)，抑制血栓率僅有5.38 %；中濃度組尾靜脈形成量較模型組雖然有減少，但不明顯，心臟紅細胞染色強度(P<0.01)，抑制血栓率為29.68%；高濃度組血栓尾靜脈形成量較模型組明顯減少，呈現不連續(xù)血流，心臟紅細胞染色強度明顯增加(P<0.01)，抑制血栓效率達48.50%。各劑量組的抑制血栓效率，表現出劑量相關性。

Fig 6 Venous thrombus and cardiac erythrocyte staining in zebrafish after drug intervention in ponatinib model

2.7 聯合用藥對斑馬魚體內血栓相關轉錄因子mRNA表達的影響Mlck1a基因能夠改變血小板形態(tài)和血栓的形成[16]，血管性血友病因子vWF可與膠原及血小板膜GPⅡb/Ⅲa結合，在血小板聚集、黏附過程中發(fā)揮重要作用[17]，PKCα已經被證實是血小板功能的重要正調節(jié)劑和體內體外血栓形成的關鍵調節(jié)因子[18]。如Fig 7所示，與對照組相比，模型組中Mlck1a、PKCα、vWF mRNA表達水平顯著升高；與模型組相比，聯合藥組基因表達明顯下降，且隨著給藥濃度遞增呈現降低的趨勢，因此聯合藥各個濃度都能下調PH、AA、PT誘導的Ⅱ型糖尿病合并血栓模型中Mlck1a、PKCα、vWF基因的表達量，且呈現劑量相關性。

Fig 7 Effect of compound drugs on expression of Mlck1a，PKCα and vWF genes in zebrafish PH model，AA model and PT model

2.8 聯合藥對斑馬魚組織糖含量的影響基于本實驗室前期工作，斑馬魚注射STZ后達到糖尿病狀態(tài)，且在我們實驗周期內，該模型較穩(wěn)定。如Fig 8所示，聯合藥3種濃度均可降低3種模型的組織糖含量，每個濃度之間降低組織糖含量的效果差距不大。

Fig 8 Effects of compound drugs on tissue glucose content in zebrafish PH model，AA model and PT model

3 討論

本文首先通過斑馬魚胚胎發(fā)育的毒性研究，確定聯合藥中各組分的安全給藥劑量，使用PH、AA、PT誘導方法建立3種斑馬魚Ⅱ型糖尿病合并血栓模型，可直觀的觀察血栓形成情況。

對3種模型進行藥物干預后，實驗顯示聯合藥可有效對抗斑馬魚的血栓形成，說明其可能通過抑制血小板聚集、影響花生四烯酸代謝途徑、保護血管內皮等方式，影響血栓的形成。此外，通過qRT-PCR檢測血栓相關基因Mlck1a、PKC、vWF mRNA的表達，顯示不同濃度的聯合藥都能不同程度的降低基因的表達，從而影響血小板的形成，進一步降低血栓產生的可能性。

由此可見，本研究通過建立和使用斑馬魚Ⅱ型糖尿病合并血栓模型，證實由SCM、PSP、DNJ組成的聯合藥物具有抗血栓、降血糖作用，且其抗血栓機制存在多靶點效應，為下一步藥物開發(fā)提供了理論依據。