肺肌成纖維細胞轉(zhuǎn)化的研究新進展

朱 媚，蔣小崗

(蘇州大學(xué)蘇州醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院藥理學(xué)系，江蘇 蘇州 215123)

特發(fā)性肺纖維化(idiopathic pulmonary fibrosis，IPF)，下文簡稱肺纖維化，是一種終末期的慢性進展性肺間質(zhì)疾病，病因不明。肺肌成纖維細胞是肺纖維化發(fā)展過程中的關(guān)鍵效應(yīng)細胞[1]。在肺纖維化過程中，肺肌成纖維細胞分泌促纖維化生長因子，進一步促進肺纖維化發(fā)展[2]；肺肌成纖維細胞合成細胞外基質(zhì)能力強，細胞外基質(zhì)大量沉積導(dǎo)致肺結(jié)構(gòu)重塑，肺泡功能喪失[3，4]。肺肌成纖維細胞由肺纖維化過程中的不同前體轉(zhuǎn)化而來。除常駐肺成纖維細胞可大量轉(zhuǎn)化為肺肌成纖維細胞外，肺肌成纖維細胞還可能由上皮細胞、內(nèi)皮細胞、脂肪成纖維細胞、骨髓來源的循環(huán)纖維細胞、周細胞，甚至是巨噬細胞轉(zhuǎn)化而來。這些細胞可被轉(zhuǎn)化生長因子(transforming growth factor β，TGF-β)等激活并誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化為肺肌成纖維細胞，促進肺纖維化發(fā)展。目前，治療肺纖維化的藥物——尼達尼布和吡非尼酮，正是通過干預(yù)肺肌成纖維細胞轉(zhuǎn)化發(fā)揮減緩肺纖維化的作用[5]。因此，探究肺肌成纖維細胞轉(zhuǎn)化機制是發(fā)現(xiàn)肺纖維化治療新靶點和藥物的重要基礎(chǔ)工作。本文將從機械轉(zhuǎn)導(dǎo)、代謝、氧化應(yīng)激、泛素化、細胞衰老等方面總結(jié)近5年關(guān)于肺肌成纖維細胞轉(zhuǎn)化的相關(guān)機制及藥物干預(yù)的研究進展。

1 機械傳導(dǎo)

基質(zhì)硬化是肺纖維化的顯著特征，也是肺纖維化的驅(qū)動因素，肺肌成纖維細胞和硬化的細胞外基質(zhì)之間的機械相互作用加劇肺纖維化發(fā)展[6]?；|(zhì)有生物活性，能與細胞通訊，細胞感知基質(zhì)力學(xué)性質(zhì)變化，激活下游生化信號通路。機械傳感器位于細胞膜上，常見的有整合素、機械敏感離子通道和G蛋白偶聯(lián)受體(G protein-coupled receptors，GPCRs)等。

整合素是參與細胞間和細胞基質(zhì)信號通路的跨膜受體，每個整合素通常由1種α亞單位和1種β亞單位非共價配對形成，至今已發(fā)現(xiàn)20多種不同異二聚體。整合素可調(diào)控關(guān)鍵促纖維化細胞因子TGF-β的釋放和激活，該過程主要涉及含αV的整合素。肺肌成纖維細胞是肺纖維化過程中的主要效應(yīng)細胞，表達多個含αV的整合素。因此，相當(dāng)長的一段時間內(nèi)αV整合素與肺肌成纖維細胞、肺纖維化的關(guān)系得到了更多關(guān)注。直到最近，Chen等[7]系統(tǒng)研究了α6整合素作為一種機械敏感的整合素亞單位介導(dǎo)基質(zhì)硬度，調(diào)節(jié)肺肌成纖維細胞侵襲及肺纖維化。α6整合素結(jié)合β1整合素介導(dǎo)MMP-2依賴性基膜中IV型膠原的細胞周蛋白水解，導(dǎo)致肺肌成纖維細胞侵襲。而特異敲除間質(zhì)細胞中的α6或者藥理阻斷基質(zhì)硬度調(diào)節(jié)的α6表達能明顯改善博來霉素誘導(dǎo)的實驗性小鼠肺纖維化。他們的研究首次證實，α6整合素是一種基質(zhì)硬度調(diào)節(jié)的機械敏感分子，可促進肺肌成纖維細胞侵襲介導(dǎo)實驗性肺纖維化。因此，靶向α6-整合素可為發(fā)現(xiàn)新的抗肺纖維化治療藥物提供新靶點。

機械敏感離子通道敏銳感知細胞膜周圍機械力環(huán)境，將其轉(zhuǎn)化為電化學(xué)信號，介導(dǎo)下游信號傳導(dǎo)。TRPV4(transient receptor potential vanilloid 4)作為一種非選擇性陽離子通道，被發(fā)現(xiàn)在肺纖維化患者的肺成纖維細胞中上調(diào)，而敲除TRPV4小鼠可明顯減輕博來霉素誘導(dǎo)的肺纖維化。Grove等[8]發(fā)現(xiàn)，TRPV4通過與磷脂酰肌醇3-激酶γ(PI3Kγ)相互作用促進人和小鼠肺肌成纖維細胞的轉(zhuǎn)化。在此過程中，TGF-β誘導(dǎo)TRPV4-PI3Kγ復(fù)合物向質(zhì)膜募集，并增加TRPV4和PI3Kγ活性。通過功能獲得或缺失的方法發(fā)現(xiàn)，TRPV4和PI3Kγ蛋白都是肺肌成纖維細胞轉(zhuǎn)分化所必需的。更重要的是，在缺乏PI3Kγ的細胞中表達各種突變形式的PI3Kγ催化亞單位(p110γ)，發(fā)現(xiàn)只有p110γ的非催化氨基末端結(jié)構(gòu)域是TGF-β誘導(dǎo)的TRPV4質(zhì)膜募集和肺肌成纖維細胞轉(zhuǎn)分化所必需。鑒于TRPV4和PI3Kγ都具有豐富的功能調(diào)節(jié)作用，通過靶向它們的相互作用或能提供一種肺纖維化治療新策略。

GPCRs是人類基因組中最大的細胞膜受體家族，是目前臨床藥物應(yīng)用最多的靶點，其相關(guān)抑制劑和激活劑均正被探索用于肺纖維化疾病的治療。但目前以GPCRs為靶點的候選藥物選擇性不夠，因此，發(fā)現(xiàn)在肺肌成纖維細胞上選擇性表達的GPCRs有可能提供一種靶向方法。最近，Tschumperlin實驗室發(fā)現(xiàn)，Gαs偶聯(lián)多巴胺受體D1(DRD1)選擇性在肺成纖維細胞中表達。DRD1激動可選擇性地抑制肺成纖維細胞中的Yes相關(guān)蛋白(Yes-associated protein，YAP)和轉(zhuǎn)錄共激活子(transcriptional co-activator with PDZ-binding motif，TAZ)功能，這正好解決了非選擇性抑制YAP/TAZ所致肺纖維化惡化的缺陷，將其功能從促纖維化轉(zhuǎn)變?yōu)楦纳品卫w維化。另一方面，芳香族L-氨基酸脫羧酶(DOPA脫羧酶，DDC)是負責(zé)多巴胺生物合成最后一步的酶，在特發(fā)性肺纖維化受試者的肺組織中表達減少，其表達水平與疾病嚴(yán)重程度呈負相關(guān)，與肺纖維化中多巴胺信號削弱內(nèi)源性保護作用一致。因此，靶向肺肌成纖維細胞DRD1靶點進而選擇性抑制肺肌成纖維細胞中的YAP/TAZ信號可為以GRCPs為靶點發(fā)現(xiàn)新型肺纖維化治療藥物提供一條獨特的途徑。

非肌性肌球蛋白重鏈9(non-muscle myosin heavy chain 9，，MYH9)基因編碼非肌性肌球蛋白ⅡA的重鏈，是機械傳導(dǎo)的重要信號分子。MYH9與肌動蛋白結(jié)合，水解ATP產(chǎn)生機械能，在胞質(zhì)流動、物質(zhì)運輸、肌肉收縮等多種生理活動中發(fā)揮重要的作用。cDNA芯片和蛋白組學(xué)數(shù)據(jù)顯示TGF-β刺激的肺成纖維細胞以及纖維化肺組織中MYH9表達明顯增加。Sun等[9]發(fā)現(xiàn)，在肺肌成纖維細胞轉(zhuǎn)化過程中，TGF-β1通過激活A(yù)LK5/Smad2/3信號而導(dǎo)致MYH9表達增加；MYH9敲低或MYH9抑制劑均能顯著阻抑TGF-β1誘導(dǎo)的肺肌成纖維細胞轉(zhuǎn)化。然而，開發(fā)以MYH9為靶點的抑制劑用于肺纖維化治療仍有較多的工作需要開展。其一，MYH9抑制劑是否可以改善體內(nèi)肺纖維化；其二，MYH9抑制劑是否會破壞肺泡上皮細胞、肺泡巨噬細胞的正常生理功能；其三，MYH9是廣泛分布的蛋白質(zhì)，其脫靶作用是否會產(chǎn)生嚴(yán)重不良反應(yīng)。這些問題的解決將可能為發(fā)現(xiàn)MYH9選擇性抑制劑治療肺纖維化提供有益的線索。

2 代謝

代謝失調(diào)與肺纖維化發(fā)展息息相關(guān)，如糖酵解增加，谷氨酰胺分解增加和脂質(zhì)生成減少，可能是肺成纖維細胞活化的重要驅(qū)動因素。

糖酵解不僅對能量供應(yīng)至關(guān)重要，對協(xié)調(diào)輔助生物合成途徑以提供細胞生長和分化所必需的元素也至關(guān)重要。在活化的肺成纖維細胞中，參與糖酵解的限速酶顯著上調(diào)。TGF-β通過加快線粒體生物發(fā)生和糖酵解促進肺成纖維細胞轉(zhuǎn)化[10]。缺氧誘導(dǎo)因子1-α(hypoxia-inducible factor 1-α，HIF-1α)是糖酵解酶表達的主要調(diào)節(jié)因子和在缺氧條件下驅(qū)動糖酵解的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，糖酵解增強導(dǎo)致琥珀酸增加，穩(wěn)定HIF-1α并促進肺肌成纖維細胞轉(zhuǎn)化。已有研究表明，HIF-1α激活與谷氨酰胺酶的調(diào)控密切相關(guān)。Bernard等[11]在此基礎(chǔ)上研究發(fā)現(xiàn)，在肺成纖維細胞中，TGF-β通過Smad3和p38MAPK途徑誘導(dǎo)谷氨酰胺酶(glutaminase，GLS)亞型GLS1的表達促進谷氨酰胺轉(zhuǎn)化為谷氨酸，從而促進肺肌成纖維細胞轉(zhuǎn)化，而抑制谷氨酰胺分解，減少細胞外谷氨酸，則可阻止TGF-β1誘導(dǎo)的肺肌成纖維細胞轉(zhuǎn)化。在肺肌成纖維細胞轉(zhuǎn)化后去除細胞外谷氨酸可降低HIF-1α表達，逆轉(zhuǎn)TGF-β1誘導(dǎo)的代謝重編程。因此，在肺肌成纖維細胞轉(zhuǎn)化中HIF-1α是有氧糖酵解和谷氨酰胺分解代謝中的重要調(diào)節(jié)因子，為調(diào)控代謝重編程逆轉(zhuǎn)肺肌成纖維細胞轉(zhuǎn)化奠定有益的基礎(chǔ)。

除了糖酵解與谷氨酰胺代謝與肺纖維化密切相關(guān)，脂質(zhì)生成減少也是代謝相關(guān)的調(diào)節(jié)因素之一。超長鏈脂肪酸延伸酶6(elongase of very long chain fatty acid，Elovl6)是一種催化脂肪酸延伸的限速酶，小鼠缺乏這種酶會導(dǎo)致肺泡壁自發(fā)性增厚，增加博來霉素誘導(dǎo)肺纖維化的易感性。增加脂質(zhì)生成可降低小鼠肺內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激并減輕纖維化重構(gòu)[12]，這是探究肺纖維化治療靶點的潛在方向。

代謝重編程過程中，能量代謝變化是最直接的表現(xiàn)，而能量調(diào)節(jié)因子正是最熟悉的腺苷酸激活蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)。在肺纖維化小鼠和肺纖維化患者的肺成纖維細胞中AMPK活性下降，而AMPK激活劑，如二甲雙胍，可下調(diào)Smad2/3的磷酸化和TGF-β誘導(dǎo)的下游基因表達水平，如結(jié)締組織生長因子和白細胞介素-6等，從而抑制肺纖維化[13-14]。AMPK不僅調(diào)節(jié)能量穩(wěn)態(tài)，還調(diào)節(jié)應(yīng)激反應(yīng)，AMPK激活抑制TGF-β誘導(dǎo)的尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶 4(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase 4，NOX4)表達。盡管目前研究表明，AMPK激活有助于緩解肺纖維化，但由于AMPK是多功能調(diào)節(jié)因子，脫靶效應(yīng)可能會影響AMPK激活劑治療效果，所以發(fā)現(xiàn)靶向肺成纖維細胞AMPK激活劑或許是肺纖維化治療更好的選擇。

3 氧化應(yīng)激

氧化應(yīng)激是機體高活性物質(zhì)的產(chǎn)生超出機體的清除能力，導(dǎo)致氧化/抗氧化失衡的一種狀態(tài)。生理范圍內(nèi)的活性氧(reactive oxygen species，ROS)在調(diào)節(jié)人體正常生理功能(如細胞凋亡、基因表達、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等)上有重要的作用。然而，當(dāng)ROS 持續(xù)高濃度存在時，機體發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，激活身體的修復(fù)和防御機制，損害肺組織，加速肺纖維化進展[15]。早在1987年就有研究發(fā)現(xiàn)，氧化應(yīng)激與特發(fā)性肺纖維化(IPF)的關(guān)系，Li等[16]從IPF患者的支氣管肺泡灌洗液中檢測到大量脂質(zhì)過氧化物。在肺中與氧化應(yīng)激調(diào)控相關(guān)的酶主要是NOX 家族。NAPDH氧化酶4(NOX4)誘導(dǎo)ROS產(chǎn)生在TGF-β誘導(dǎo)的肺肌成纖維細轉(zhuǎn)化過程中發(fā)揮重要作用。核因子E2相關(guān)因子2(NF-E2-related factor 2，Nrf2)是體內(nèi)抗氧化反應(yīng)元件的主要調(diào)節(jié)物。靶向Nrf2/谷胱甘肽信號可緩解肺纖維化，如丹參酮ⅡA(Tanshinone ⅡA，Tan ⅡA)通過激活Nrf2抑制細胞增殖，阻止肺肌成纖維細胞激活[17]。NOX4和Nrf2調(diào)控線粒體的生物發(fā)生和代謝，這可能是NOX4和Nrf2調(diào)節(jié)肺纖維化的機制之一。氧化應(yīng)激是目前肺纖維化藥物研究中的經(jīng)典藥物靶點，但抗氧化應(yīng)激藥物在臨床治療中效果并不理想，因此，發(fā)現(xiàn)未知的氧化應(yīng)激調(diào)控因子可能是解決目前問題的必須工作，這可能為尋找新的有效的氧化應(yīng)激調(diào)控藥物治療肺纖維化提供新的線索。

4 泛素化

泛素-蛋白酶體通路是調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)降解與功能的重要系統(tǒng)，參與細胞周期調(diào)控、細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細胞凋亡、抗原提呈等多種生理過程，有助于維持細胞穩(wěn)態(tài)。E3泛素連接酶和去泛素化酶(deubiquitination enzymes，DUBs)調(diào)控肺纖維化相關(guān)蛋白的泛素化降解，影響肺肌成纖維細胞轉(zhuǎn)化過程。在肺纖維化領(lǐng)域，關(guān)于Smads泛素化研究較多，E3泛素連接酶Smurf介導(dǎo)Smad2/3泛素蛋白酶體降解，從而抑制TGF-β誘導(dǎo)的肺肌成纖維細胞轉(zhuǎn)化，而tetratricopeptide repeat domain 3可促進Smurf的降解，增加Smad2/3表達從而逆轉(zhuǎn)這一過程[18]。更為有意義的是，Tsubouchi等[19]首次在阿奇霉素緩解肺纖維化作用中將泛素化調(diào)節(jié)與氧化應(yīng)激聯(lián)系起來。阿奇霉素能明顯抑制肺肌成纖維細胞轉(zhuǎn)化中NOX4表達水平，這與阿奇霉素可增加E3泛素連接酶STUB1而促進NOX4泛素化降解密切相關(guān)。除了E3泛素連接酶參與肺肌成纖維細胞轉(zhuǎn)化外，具有去泛素化作用的DUBs也是一類調(diào)控肺肌成纖維細胞轉(zhuǎn)化相關(guān)的重要因子[20]。以泛素-蛋白酶體系統(tǒng)為基礎(chǔ)的蛋白降解靶向嵌合體技術(shù)(proteolysis-targeting chimeras，PROTAC)是目前廣泛開展的藥物研發(fā)技術(shù)，但受限于用在PROTAC的泛素連接酶較少，因此，發(fā)現(xiàn)新的調(diào)控肺肌成纖維細胞轉(zhuǎn)化的泛素連接酶將為以新策略發(fā)現(xiàn)肺纖維化治療的藥物新靶點和候選藥物發(fā)現(xiàn)的基礎(chǔ)工作，同時，PROTAC技術(shù)應(yīng)充分考慮靶向性問題，減少脫靶的發(fā)生。

5 細胞衰老

細胞衰老是一種不可逆的細胞周期停滯狀態(tài)，伴有異常分泌細胞衰老相關(guān)因子的情況。然而，目前人們對細胞衰老是如何參與特發(fā)性肺纖維化的發(fā)展仍不清楚。已有研究表明，特發(fā)性肺纖維化患者肺臟組織中存在衰老的肺成纖維細胞。Alvarez等發(fā)現(xiàn)肺纖維化患者肺成纖維細胞發(fā)生衰老后，將產(chǎn)生凋亡抗性不易被清除，而其不斷分泌的細胞衰老相關(guān)的分泌表型因子可能促進肺肌成纖維細胞轉(zhuǎn)化，驅(qū)動肺纖維化進程。隨后，Bernard等[21]發(fā)現(xiàn)mTORC2激活誘導(dǎo)肺成纖維細胞衰老進而促進肺肌成纖維細胞轉(zhuǎn)化，反過來肺成纖維細胞衰老亦可激活mTORC2進而使肺肌成纖維細胞轉(zhuǎn)化增加，最終促進肺纖維化進程。

已有證據(jù)表明，清除衰老肺成纖維細胞可能是特發(fā)性肺纖維化潛在治療方法?；谶@一理念，Zhang等[22]篩選到羅紅霉素可能通過靶向清除衰老的肺成纖維細胞改善肺纖維化，他們研究發(fā)現(xiàn)，羅紅霉素通過誘導(dǎo)衰老肺成纖維細胞凋亡和抑制衰老相關(guān)分泌表型(SASP)因子的表達，進而減少肺成纖維細胞轉(zhuǎn)化，最終緩解肺纖維化。該研究進一步支持以細胞衰老為靶點治療特發(fā)性肺纖維化是一種有希望的方法的觀點。2022年，Ritzenthaler等[23]鑒定了一個新的調(diào)控肺成纖維細胞衰老促進肺肌成纖維細胞轉(zhuǎn)化的因子——Slc7a11，Slc7a11在老年細胞中的表達降低與衰老標(biāo)志物升高和促纖維化基因表達增加呈現(xiàn)負相關(guān)，并發(fā)現(xiàn)Slc7a11誘導(dǎo)劑能明顯改善肺肌成纖維細胞衰老。這些研究有利于從多角度發(fā)現(xiàn)肺纖維化新的治療藥物，加快肺纖維化藥物發(fā)現(xiàn)的進程。

6 總結(jié)與展望

肺肌成纖維細胞是肺纖維化發(fā)生過程中的關(guān)鍵效應(yīng)細胞，其活性決定組織是否會因為過度修復(fù)導(dǎo)致肺纖維化的發(fā)生。抑制肺成纖維細胞向肺肌成纖維細胞轉(zhuǎn)化是治療肺纖維化的有效措施，目前已有的治療肺纖維化的藥物尼達尼布和吡非尼酮也正是通過干預(yù)肺肌成纖維細胞轉(zhuǎn)化過程發(fā)揮治療效果。靶向肺肌成纖維細胞轉(zhuǎn)化也是篩選肺纖維化活性化合物的重要途徑[24-25]。

盡管肺成纖維細胞轉(zhuǎn)化的分子機制已有較好的研究進展，正如前文所述在機械轉(zhuǎn)導(dǎo)、代謝、氧化應(yīng)激、細胞衰老、泛素化等方面闡述了肺肌成纖維細胞轉(zhuǎn)化的過程，然而這些與肺肌成纖維細胞轉(zhuǎn)化的復(fù)雜調(diào)控過程相比，尚有很多工作有待開展。肺肌成纖維細胞轉(zhuǎn)化的機制研究也存在一些問題，比如肺肌成纖維細胞中基質(zhì)蛋白含量高，影響低豐度關(guān)鍵調(diào)控因子的發(fā)現(xiàn)；GRCRs、蛋白激酶等關(guān)鍵藥物靶點與肺成纖維細胞關(guān)系的研究仍遠不能滿足肺纖維化藥物發(fā)現(xiàn)的需要。最關(guān)鍵的是，如何調(diào)控肺肌成纖維細胞重編程，改善甚至逆轉(zhuǎn)肺成纖維細胞灶，在此基礎(chǔ)上，如何實現(xiàn)肺成纖維細胞、肺泡上皮細胞、肺泡毛細血管內(nèi)皮細胞、肺泡巨噬細胞等肺泡微環(huán)境的穩(wěn)態(tài)和平衡，這是實現(xiàn)最終治愈肺纖維化疾病的根本問題。因此，今后研究工作中，既要重點專注闡明肺肌成纖維細胞轉(zhuǎn)化的分子機制，也要關(guān)注肺成纖維細胞與其他類型細胞的相互作用。