基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接探討藏藥唐古特烏頭抗炎作用機(jī)制

柏 遠(yuǎn)，陳 曉，李 竣，史建勛，黃先菊

(1. 中南民族大學(xué)藥學(xué)院，湖北 武漢 430074；2. 湖北藥昇中藥科技有限公司，湖北 棗陽(yáng) 441200；3. 浙江醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校，浙江 寧波 315100)

藏藥唐古特烏頭Aconitumtanguticum(Maxim.)Stapf為藏藥珍稀藥材，藏藥名為榜嘎，主要分布在中國(guó)青海、甘肅、西藏等高海拔地區(qū)，是藏藥成方制劑中常用的藥材，在藏醫(yī)藥中已使用了數(shù)千年的歷史，深受各族人民的喜愛(ài)。本品性涼，味苦，具有清熱解毒，生肌收口，燥濕之功效。其用于多種藏藥成方制劑中，主治清熱解毒，主要用于肝熱、膽熱、肺熱、肝炎、肺炎、胃腸炎、流行性感冒、傳染病引起的發(fā)燒、食物中毒、蛇蝎咬傷以及黃水病[1]?，F(xiàn)代研究表明，榜嘎具有抗炎、抗病毒等藥理活性[2]。

榜嘎化學(xué)成分主要以生物堿類和黃酮苷化合物為主。從榜嘎中分離得到的生物堿成分主要分為二萜類和苯丙胺類生物堿。目前，二萜類生物堿被認(rèn)為是榜嘎發(fā)揮抗炎鎮(zhèn)痛的主要活性成分[3]。據(jù)報(bào)道，阿替新(Atisine)和異葉烏頭堿(Heteratisine)在榜嘎中的含量分別為0.084%和0.066%[4]；大麥芽堿含量為0.0238%[5]。唐古特烏頭在藏藥中應(yīng)用廣泛而且極為重要，在藏醫(yī)臨床應(yīng)用方面，唐古特烏頭同樣發(fā)揮了舉足輕重的作用，尤其是在冠狀病毒防治上。在疫情爆發(fā)之初，西藏、青海等傳承藏醫(yī)藥的省份就紛紛在防治方案中提到十二味翼首散、二十五味肺病膠囊、流感丸、二十五味主藥散等藏醫(yī)傳統(tǒng)藥物唐古特烏頭的成方制劑，其中十二味翼首散早在“非典”時(shí)期就被廣泛應(yīng)用，對(duì)于藏醫(yī)“年然”(意為疫病)引發(fā)的“炎癥風(fēng)暴”有著很好的防治作用，豐富了藏醫(yī)藥在治療冠狀病毒肺炎的應(yīng)用[6]。雖然唐古特烏頭在“炎癥風(fēng)暴”治療領(lǐng)域做出了重要的貢獻(xiàn)，但是目前仍缺乏其發(fā)揮治療作用時(shí)系統(tǒng)的作用機(jī)制，所以，系統(tǒng)深入探索唐古特烏頭抗炎作用機(jī)制顯得尤為重要。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是一門(mén)新興學(xué)科，涉及構(gòu)建疾病表型、基因和藥物的多層網(wǎng)絡(luò)[7]。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)有助于預(yù)測(cè)藥物靶點(diǎn)、作用方式和相關(guān)通路?？紤]到民族藥成分和功能的復(fù)雜性，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)被認(rèn)為是識(shí)別關(guān)鍵靶點(diǎn)和信號(hào)通路的有效方法[8]。因此，本研究通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，從系統(tǒng)、整體的角度將藥物與疾病相聯(lián)系，結(jié)合民族藥物成分靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)與相關(guān)疾病靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，從多個(gè)成分、靶點(diǎn)甚至多個(gè)通路預(yù)測(cè)民族藥物作用于相關(guān)疾病的成分靶點(diǎn)和潛在作用機(jī)制；運(yùn)用分子對(duì)接技術(shù)挖掘唐古特烏頭活性成分抗炎的特異性及可能性；并且通過(guò)體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對(duì)接預(yù)測(cè)結(jié)果。旨在系統(tǒng)闡述藏藥唐古特烏頭抗炎作用所涉及機(jī)制，為唐古特烏頭的臨床研究及潛在抗炎藥物的發(fā)掘提供參考。

1 材料與方法

1.1 唐古特烏頭的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究

1.1.1唐古特烏頭活性成分的靶點(diǎn)預(yù)測(cè) 通過(guò)文獻(xiàn)檢索、實(shí)驗(yàn)室前期研究等方法收集唐古特烏頭的主要單體化學(xué)成分。使用PubChem數(shù)據(jù)庫(kù)[9](https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)、SwissTarget Prediction平臺(tái)(http：//www.swisstargetprediction.ch/)尋找唐古特烏頭活性成分的相關(guān)靶點(diǎn)。

1.1.2唐古特烏頭抗炎的作用靶點(diǎn)預(yù)測(cè)及核心靶點(diǎn)篩選 使用GeneCards(https：//www.genecards.org/)、Omin(https：//www.omim.org/)以及PHARMGKB(https：//www.pharmgkb.org/)疾病靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫(kù)，以“anti-inflammatory”、“inflammation”為關(guān)鍵詞進(jìn)行檢索，并刪除重復(fù)的基因。將唐古特烏頭活性成分靶點(diǎn)和抗炎相關(guān)靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape Version 3.8.2軟件，兩者進(jìn)行對(duì)比取交集，得出共同靶點(diǎn)，即為唐古特烏頭抗炎的相關(guān)靶點(diǎn)。將共同靶點(diǎn)Degree參數(shù)值進(jìn)行排序，以高于中位數(shù)的2倍為條件，即得出共同靶點(diǎn)中的核心靶點(diǎn)。

1.1.3唐古特烏頭抗炎作用的靶標(biāo)蛋白之間的相互作用(protein protein interaction，PPI)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將收集到的共同靶點(diǎn)導(dǎo)入到STRING數(shù)據(jù)庫(kù)[10](https：//www.string-db.org/)，設(shè)置物種及最高置信度為合適參數(shù)，構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，通過(guò)Cytoscape Version 3. 8. 2軟件將唐古特烏頭的成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)圖進(jìn)行呈現(xiàn)。

1.1.4富集分析 將活性成分與疾病的交集基因在DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)(https：//david.ncifcrf.gov/)中進(jìn)行基因本體論(gene ontology，GO)功能和京都基因與基因組百科全書(shū)(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)分析[11]，通過(guò)GO富集獲得靶點(diǎn)基因在體內(nèi)可能涉及的細(xì)胞組分(cellular component，CC)、參與的分子功能(molecular function，MF)及其涉及到的生物學(xué)過(guò)程(biological process，BP)，從而綜合分析得到這些基因的生物學(xué)功能；通過(guò)KEGG通路富集靶點(diǎn)所涉及的信號(hào)通路，以P<0.05為篩選標(biāo)準(zhǔn)，分析唐古特烏頭抗炎的主要信號(hào)通路及生物過(guò)程。利用微生信平臺(tái)，對(duì)GO富集與KEGG富集結(jié)果進(jìn)行可視化呈現(xiàn)。

1.1.5成分靶點(diǎn)分子對(duì)接 以“1.3”項(xiàng)下篩選出的部分核心靶點(diǎn)為受體，通過(guò)PDB數(shù)據(jù)庫(kù)(https：//www1.rcsb.org/)查找受體的3D結(jié)構(gòu)文件[12]；以“1.1”項(xiàng)下收集到的唐古特烏頭化學(xué)成分中二萜類生物堿活性成分為配體，利用PubChem數(shù)據(jù)庫(kù)網(wǎng)站導(dǎo)出配體的3D結(jié)構(gòu)文件[9，13]；通過(guò)AutoDock Vina(1.1.2 版本)軟件進(jìn)行分子對(duì)接，并用PyMOL軟件將對(duì)接結(jié)果進(jìn)行可視化。

1.2 體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

1.2.1主要試劑與儀器 脂多糖(lipopoly saccharide，LPS)，美國(guó)Sigma公司；噻唑藍(lán) ([3- (4，5-Dimethylthiazol-2-yl) -2，5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide，MTT)，Biosharp公司；胎牛血清(FBS)，杭州天杭生物科技股份有限公司；DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基，Gibco公司；NO檢測(cè)試劑盒，碧云天生物有限公司；TRNzol Universal總RNA提取試劑盒，天根公司；ABScript Ⅱ RT Master Mix for qPCR和TB GreenTMPremix Ex TaqTM，武漢愛(ài)博泰克生物科技有限公司；熒光定量PCR儀(BD公司，美國(guó))，多功能酶標(biāo)儀(TECAN)。其它試劑均為分析純。

1.2.2唐古特烏頭醇提物的制備 取干燥的唐古特烏頭(標(biāo)本號(hào)：LQE-2019-066)地上部分15 kg，粉碎，過(guò)30號(hào)篩，用5倍量的體積分?jǐn)?shù)為0.97的乙醇常溫浸泡24 h，反復(fù)6次，過(guò)濾，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器回收溶劑，得唐古特烏頭醇提物(ATS)。

1.2.3唐古特烏頭醇提物(ATS)化學(xué)成分的鑒別 使用高效液相色譜技術(shù)(HPLC)對(duì)唐古特烏頭醇提物中部分化學(xué)成分進(jìn)行鑒別，精密稱取ATS 0.5 g，置于5 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻后即得0.1 kg·L-1的溶液；精密稱取2 mg苯甲酰異葉烏頭堿(6-Benzoylheteratisine)對(duì)照品和關(guān)附甲素(Guan-Fu Base A)對(duì)照品，分別置于10 mL容量瓶中，同時(shí)精密稱取20 mg異葉烏頭堿(Heteratisine)對(duì)照品置于2 mL容量瓶中，將上述對(duì)照品加甲醇溶解并定容，搖勻。臨用前，將已定容的樣品溶液和標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品溶液用0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，注入高效液相色譜儀。

1.2.4細(xì)胞培養(yǎng)與給藥濃度確定 RAW264.7小鼠巨噬細(xì)胞，購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)(CTCC)。用含有10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)RAW264.7細(xì)胞，37 ℃，5% CO2培養(yǎng)。將RAW264.7細(xì)胞以5×103個(gè)/孔的密度接種于96孔板，培養(yǎng)至細(xì)胞對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。分別以終濃度為3.125-200 mg·L-1ATS孵育細(xì)胞24 h，MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力，確定給藥濃度范圍。

1.2.5唐古特烏頭抗炎藥效評(píng)價(jià) 將RAW264.7細(xì)胞按每孔100 μL接種在96孔板中，分別加入0.01～5 mg·L-1的ATS孵育2 h，再加入LPS(1 mg·L-1)孵育24 h，另外設(shè)置空白對(duì)照組和模型組(LPS 1 mg·L-1)，每組6個(gè)復(fù)孔。細(xì)胞給藥結(jié)束后，每孔收集細(xì)胞上清液50 μL置于新的96孔板中，用Griess法試劑盒測(cè)定給藥組及模型組NO釋放量，并計(jì)算抑制率。

抑制率/%=(模型組OD-給藥組OD)/(模型組OD-空白組OD)×100%

1.2.6炎癥通路相關(guān)基因水平的檢測(cè) 采用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR方法，以GAPDH作為參照基因，檢測(cè)iNOS及相關(guān)通路基因的mRNA相對(duì)于內(nèi)參的表達(dá)水平。使用TRIzol試劑收集細(xì)胞樣本，提取總RNA。試劑盒逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，擴(kuò)增體系如下：Stage 1 DNA聚合酶95 ℃預(yù)熱變性，40 s；Stage 2 循環(huán)體系95 ℃，15 s，58 ℃ 1 min中循環(huán)40次。相關(guān)基因擴(kuò)增的引物序列如下：GAPDH：5′-ACCCAGA-AGACTGTGGATGG-3′(fw)，5′-TCAGCTCAGGGATGACCTTG-3′(rw)；JAK2：5′-TTGTGGTATTACGCCTGTGTATC-3′(fw)，5′-ATGCCTGGTTGACTCGTCTAT-3′(rw)；AKT1：5′-CTTTATTGGCTACAAGGAACGG-3′(fw)，5′-CAGTCTGAATGGCGGTGGT-3′(rw)；iNOS：5′-TGAGTTCCGAAGCAAGCCAA-3′(fw)；5′-AGACCTCAACAGAGCCCTCA-3′(rw)。

2 結(jié)果

2.1 唐古特烏頭主要活性成分及靶點(diǎn)篩選基于文獻(xiàn)檢索唐古特烏頭的化學(xué)成分并根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室前期研究獲得唐古特烏頭的主要活性成分17個(gè)。通過(guò)PubChem 數(shù)據(jù)庫(kù)、SwissTarget Prediction 平臺(tái)檢索預(yù)測(cè)唐古特烏頭活性成分的相關(guān)靶點(diǎn)，一共獲得450個(gè)預(yù)測(cè)靶點(diǎn)。唐古特烏頭主要活性成分信息見(jiàn)Tab 1。

Tab 1 Basic information of 17 compounds of Aconitum tanguticum

2.2 唐古特烏頭抗炎的核心靶點(diǎn)篩選及PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建基于GeneCards、Omin 以及PHARMGKB 數(shù)據(jù)庫(kù)共篩選出疾病相關(guān)基因靶點(diǎn)349 6個(gè)，將上述450個(gè)活性成分靶點(diǎn)與349 6個(gè)疾病靶點(diǎn)取交集得到284個(gè)共同靶點(diǎn)，將收集到的共同靶點(diǎn)導(dǎo)入到STRING 數(shù)據(jù)庫(kù)，獲取靶標(biāo)蛋白之間相互作用(PPI)數(shù)據(jù)，以degree參數(shù)值為篩選條件，篩選得到AKT1、JAK2、MAPK1、MAPK3、TNF、STAT3、SRC、EGFR 等37個(gè)核心靶點(diǎn)，使用Cytoscape Version 3. 8. 2 軟件進(jìn)行可視化，其中節(jié)點(diǎn)的大小及顏色的深淺變化代表Degree 值的大小，見(jiàn)Fig 1。這些基因有可能是唐古特烏頭發(fā)揮抗炎作用的潛在作用靶點(diǎn)。利用Cytoscape Version 3. 8. 2 軟件呈現(xiàn)出唐古特烏頭抗炎的“成分-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)，見(jiàn)Fig 2。

Fig 1 The PPI network map of target protein

Fig 2 Network of “ingredient-target-disease”

2.3 GO 分析和KEGG 通路富集分析將活性成分與疾病的共同靶基因?qū)氲紻AVID數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行富集分析，以P<0.05為條件，對(duì)共同靶基因進(jìn)行GO的CC、MF和BP分析，得到CC條目68個(gè)，MF條目129個(gè)，BP條目474個(gè)。選取所含靶點(diǎn)數(shù)目在前10個(gè)的CC和MF條目，前20個(gè)的BP條目，利用微生信平臺(tái)進(jìn)行結(jié)果呈現(xiàn)，見(jiàn)Fig 3。結(jié)果顯示，在細(xì)胞組分中，細(xì)胞質(zhì)膜、細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)、胞質(zhì)、細(xì)胞核占較大比例；分子功能主要涉及蛋白質(zhì)結(jié)合、ATP結(jié)合等功能；生物過(guò)程主要涉及參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、蛋白質(zhì)磷酸化、對(duì)藥物的反應(yīng)、RNA聚合酶Ⅱ啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控、炎癥反應(yīng)、凋亡過(guò)程的負(fù)調(diào)控、細(xì)胞增殖的正調(diào)控等生物學(xué)過(guò)程。同樣的，以P<0.05為條件，對(duì)共同靶基因進(jìn)行KEGG通路富集分析，得到相關(guān)通路108條，選取所含靶點(diǎn)數(shù)目在前15條的通路，利用微生信平臺(tái)進(jìn)行結(jié)果呈現(xiàn)，見(jiàn)Fig 4。結(jié)果顯示唐古特烏頭發(fā)揮抗炎作用可能與PI3K-Akt、Ras、MAPK、HIF-1等信號(hào)通路及一些癌癥信號(hào)通路有關(guān)。

Fig 3 GO function enrichment analysis

Fig 4 KEGG pathway enrichment analysis

2.4 分子對(duì)接結(jié)果利用AutoDock Vina(1.1.2版本)軟件預(yù)測(cè)配體與受體結(jié)合的Vina得分，一般認(rèn)為，Vina得分越低，表明受體和配體親和力越高，對(duì)接活性越大，發(fā)生作用的可能性越大。將配體和受體的3D結(jié)構(gòu)在AutoDock Vina中進(jìn)行分子對(duì)接，結(jié)果見(jiàn)Tab 2。唐古特烏頭活性成分與所對(duì)接的核心靶點(diǎn)均具有較高的親和力，通過(guò)KEGG通路富集分析預(yù)測(cè)的PI3K-Akt 信號(hào)通路中的關(guān)鍵靶點(diǎn)AKT1，JAK2也與唐古特烏頭關(guān)鍵藥效成分具有較大的對(duì)接活性。故選取AKT1，JAK2與部分活性成分的對(duì)接圖進(jìn)行展示，如Fig 5。

Tab 2 Vina score of core compounds with key target

Fig 5 Molecular docking of AKT1 and JAK2 with compounds

2.5 化學(xué)成分鑒別HPLC分析表明唐古特烏頭醇提物(ATS)中含有6-Benzoylheteratisine、Guan-Fu Base A、Heteratisine這3種單體成分，見(jiàn)Tab 3。

Tab 3 HPLC chromatograms of standards and ATS

2.6 體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

2.6.1唐古特烏頭對(duì)RAW264.7細(xì)胞增殖的影響 采用MTT法考察不同濃度唐古特烏頭醇提物(ATS)處理后RAW264.7細(xì)胞增殖活性的影響，見(jiàn)Fig 6。與正常對(duì)照組比較，ATS在給藥濃度為0～50 mg·L-1時(shí)對(duì)細(xì)胞增殖活性無(wú)明顯抑制作用。后續(xù)選用0.01～5 mg·L-1濃度范圍進(jìn)行藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)。

Fig 6 Effect of Aconitum tanguticum on cell viability of NC：normal control，**P<0.01 vs normal control

2.6.2唐古特烏頭對(duì)RAW264.7細(xì)胞NO釋放量及相關(guān)基因mRNA水平的影響 如Fig 7(A)所示，LPS作用于RAW264.7細(xì)胞，細(xì)胞上清液中NO的釋放量明顯升高，與正常對(duì)照組相比差異具有顯著性(P<0.01)，說(shuō)明已經(jīng)成功建立LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞的炎癥模型，與LPS組相比，ATS各濃度細(xì)胞上清液中的NO含量明顯降低(P<0.01、P<0.05)。如Fig 7(B)所示，在未加LPS刺激的正常組細(xì)胞中，iNOS mRNA 表達(dá)量較少。與正常組比較，LPS可以使iNOS mRNA水平明顯上調(diào)(P<0.01)，ATS(0.01、0.5 mg·L-1)可以不同程度的下調(diào)iNOS mRNA表達(dá)(與LPS組比較，P<0.01)。表明ATS具有較好的抗炎作用，這與網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)唐古特烏頭可以通過(guò)調(diào)節(jié)炎癥相關(guān)通路發(fā)揮抗炎作用的預(yù)測(cè)相一致。通過(guò)RT-PCR法檢測(cè)PI3K-Akt 信號(hào)通路中的關(guān)鍵靶點(diǎn)AKT1、JAK2基因的相對(duì)表達(dá)量，結(jié)果表明，與正常組相比，LPS組中的AKT1、JAK2表達(dá)均明顯上升(P<0.01)，在經(jīng)過(guò)ATS治療后，AKT1、JAK2表達(dá)均表現(xiàn)為不同程度的下降(P<0.01、P<0.05)，見(jiàn)Fig 7(C，D)。說(shuō)明唐古特烏頭可以通過(guò)調(diào)節(jié)PI3K-Akt信號(hào)通路進(jìn)而發(fā)揮抗炎作用，與網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)結(jié)果基本一致。

Fig 7 Effect of Aconitum tanguticum on LPS-induced AKT1，JAK2 mRNA levels in RAW264.7 cells NC：normal control，##P<0.01 vs normal control；*P<0.05，**P<0.01 vs LPS

3 討論

唐古特烏頭是民族地區(qū)的常用藥材，具有清熱解毒、祛風(fēng)止痛的功效。國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)唐古特烏頭化學(xué)成分進(jìn)行了大量的研究，現(xiàn)代研究表明，其提取物在抗病毒及抗腫瘤等方面顯示有較好的活性。Fan等[14]從甘青烏頭中分離出多種二萜生物堿，并對(duì)其中兩種化合物對(duì)H1N1誘導(dǎo)細(xì)胞病變的抑制作用進(jìn)行評(píng)估，結(jié)果表明這兩種化合物均表現(xiàn)出對(duì)病變的抑制作用；張春江等[15]等通過(guò)體外細(xì)胞培養(yǎng)和小鼠腦炎模型試驗(yàn)綜合評(píng)價(jià)了唐古特烏頭醇提物對(duì)單純皰疹病毒II型(HSV-2)的抑制作用，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明其可能是通過(guò)直接滅活病毒起到抗病毒的作用的；Li等[16]還從甘青烏頭地上部分首次分離得到Tangutidines A～C等3個(gè)生物堿，細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)顯示這3個(gè)生物堿均具有較低細(xì)胞毒性，這也與唐古特烏頭在藏醫(yī)藥認(rèn)為“白烏頭性涼無(wú)毒”的描述相一致；在唐古特烏頭中分離出的naviculine A被證明對(duì)人腸腺癌(LoVo)細(xì)胞具有抗增殖作用[17]，顯示有抗腫瘤的潛力；此外，除唐古特烏頭堿性化合物外，有研究者還評(píng)估了非生物堿成分的生物活性，并發(fā)現(xiàn)唐古特烏頭醇提物中酸性及中性部位具有良好的抗炎鎮(zhèn)痛活性[18]；據(jù)報(bào)道[19-20]，唐古特烏頭總生物堿也具有很好的體內(nèi)抗炎活性，但是其系統(tǒng)的抗炎機(jī)制卻鮮見(jiàn)報(bào)道。本研究通過(guò)應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)，分析唐古特烏頭抗炎作用靶點(diǎn)，構(gòu)建唐古特烏頭抗炎作用靶點(diǎn)的相互作用網(wǎng)絡(luò)，預(yù)測(cè)了其發(fā)揮抗炎作用的潛在核心靶點(diǎn)，富集分析抗炎作用相關(guān)的生物學(xué)過(guò)程和信號(hào)通路，并運(yùn)用分子對(duì)接技術(shù)和體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證唐古特烏頭抗炎作用機(jī)制，為唐古特烏頭的藏醫(yī)臨床研究及產(chǎn)品開(kāi)發(fā)提供參考依據(jù)。

炎癥反應(yīng)是許多病理?xiàng)l件的中心特征，是機(jī)體在不斷進(jìn)化過(guò)程中形成的一種防御反應(yīng)，也是促發(fā)多種疾病發(fā)展的主要病理過(guò)程。炎癥反應(yīng)前期階段的目的是應(yīng)對(duì)組織損傷和入侵的微生物[21-22]，活化的巨噬細(xì)胞通過(guò)產(chǎn)生細(xì)胞因子和其他促炎因子，從而介導(dǎo)大部分炎癥細(xì)胞和病理學(xué)過(guò)程，此時(shí)的炎癥反應(yīng)有利于消除外界刺激，并且促進(jìn)組織恢復(fù)其功能；但是隨著炎癥過(guò)程的持續(xù)，如反應(yīng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)或者反應(yīng)過(guò)度時(shí)，會(huì)觸發(fā)有害的免疫過(guò)程，其特征為不正常的產(chǎn)生促炎介質(zhì)，進(jìn)而促進(jìn)多種疾病的發(fā)展，例如常見(jiàn)的心血管疾病、敗血癥和感染性休克等[23]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)，得到了37個(gè)唐古特烏頭發(fā)揮抗炎作用的潛在核心靶點(diǎn)，如TNF、AKT1、MAPK1、MAPK3、JAK2、TNF、STAT3等，這些靶點(diǎn)多與機(jī)體的免疫、炎癥相關(guān)。NO是急性和慢性炎癥的重要介質(zhì)，LPS刺激RAW264.7細(xì)胞后，使得iNOS水平明顯升高，接著誘導(dǎo)NO的過(guò)剩產(chǎn)生，進(jìn)而刺激更多的炎癥信號(hào)，加劇炎癥反應(yīng)[24]。通過(guò)對(duì)284個(gè)共同靶點(diǎn)進(jìn)行GO、KEGG富集分析，最終得到多條與免疫炎癥反應(yīng)和癌癥有關(guān)的信號(hào)通路，主要有PI3K-Akt、Ras、Rap1、MAPK、HIF-1等。分子對(duì)接結(jié)果顯示，唐古特烏頭關(guān)鍵活性成分如6-Benzoylheteratisine、Guan-Fu Base A、Atisine等與PI3K-Akt 信號(hào)通路中的關(guān)鍵靶點(diǎn)AKT1、JAK2具有較高的對(duì)接活性，表明這幾種成分單體可能是發(fā)揮抗炎作用的主要化學(xué)成分。體外細(xì)胞炎癥模型進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，唐古特烏頭能夠抑制LPS所致RAW264.7細(xì)胞上清液中NO的釋放，并且減少iNOS的表達(dá)，表現(xiàn)出顯著的抗炎藥效。實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)表明，唐古特烏頭抗炎藥效與調(diào)節(jié)PI3K-Akt 信號(hào)通路密切相關(guān)。LPS刺激的RAW264.7細(xì)胞通過(guò)激活A(yù)KT1，刺激NF-κB釋放，并進(jìn)一步促進(jìn)炎癥因子的表達(dá)[25]。

綜上所述，本研究應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)，篩選出唐古特烏頭發(fā)揮抗炎作用的潛在核心靶點(diǎn)和可能的信號(hào)通路，并通過(guò)分子對(duì)接驗(yàn)證了活性成分與靶點(diǎn)之間有較好的親和力，且通過(guò)對(duì)接結(jié)果推測(cè)6-Benzoylheteratisine、Guan-Fu Base A、Atisine可能為唐古特烏頭發(fā)揮抗炎作用的關(guān)鍵單體。通過(guò)體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)初步驗(yàn)證了唐古特烏頭醇提物對(duì)LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞炎癥模型的治療作用及機(jī)制，證實(shí)其具有顯著的體外抗炎活性。研究結(jié)果有助于更好地推進(jìn)民族藥唐古特烏頭的開(kāi)發(fā)應(yīng)用。