葡萄籽原花青素低聚體抑制A1型星形膠質(zhì)細(xì)胞極化機(jī)制

王 青，楊智超，董藝薇，苑舒文，李彥青，宋麗娟，黃建軍，馬存根，3

(1. 山西中醫(yī)藥大學(xué)神經(jīng)生物學(xué)研究中心，國(guó)家中醫(yī)藥管理局益氣活血法治療多發(fā)性硬化重點(diǎn)研究室, 山西 晉中 030619；2. 國(guó)藥同煤總醫(yī)院神經(jīng)外科/山西省衛(wèi)健委神經(jīng)疾病防治研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山西 大同 037003；3. 山西大同大學(xué)腦科學(xué)研究所，山西 大同 037009)

中樞神經(jīng)炎性脫髓鞘疾病是一類以炎性反應(yīng)和廣泛原發(fā)性髓鞘脫失為主要特征的疾病。其中復(fù)發(fā)-緩解型的多發(fā)性硬化(multiple sclerosis，MS)、視神經(jīng)脊髓炎譜系疾病(neuromyelitis optica spectrum disorders，NMOSD)是我國(guó)最常見的脫髓鞘疾病，病程通常表現(xiàn)為復(fù)發(fā)-緩解交替進(jìn)行，多次發(fā)作造成神經(jīng)功能不可逆的損傷，是中青年非創(chuàng)傷性致殘的主要原因之一[1-2]。長(zhǎng)期以來(lái)，減少髓鞘的炎性免疫損傷是治療的重要靶點(diǎn)，但尚未取得理想的療效。

星形膠質(zhì)細(xì)胞(astrocytes，AS)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system，CNS)最豐富的膠質(zhì)細(xì)胞，以連續(xù)和基本不重疊的方式整齊有序地覆蓋整個(gè)CNS，可通過(guò)參與髓鞘形成、維護(hù)血腦屏障、調(diào)節(jié)突觸功能和調(diào)節(jié)能量代謝以維持CNS的穩(wěn)態(tài)。一旦中樞受損，AS迅速作出反應(yīng)，大量反應(yīng)性AS增生，并借由本身的功能和表型的轉(zhuǎn)化對(duì)周圍的神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生有益或有害的影響。如NMOSD、MS及其動(dòng)物模型-實(shí)驗(yàn)性變態(tài)反應(yīng)性腦脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE)和雙環(huán)己酮草酰二腙(cuprizone，CPZ)誘導(dǎo)的脫髓鞘模型中均存在著的數(shù)量眾多的反應(yīng)性AS[3-4]，可通過(guò)釋放多種抑制性因子如硫酸角質(zhì)素蛋白聚糖、少突膠質(zhì)細(xì)胞髓鞘蛋白和髓鞘相關(guān)蛋白，以及炎性因子如腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白介素-1α(interleukin-1α，IL-1α)和補(bǔ)體1q(complement 1q，C1q)等損傷神經(jīng)元和髓鞘細(xì)胞[3，5]。而靶向AS可明顯緩解髓鞘脫失，如Dalahmah等[6]發(fā)現(xiàn)半乳糖凝集素-3(galectin-3，Gal-3)可通過(guò)促進(jìn)AS的增殖和炎性反應(yīng)加重少突膠質(zhì)細(xì)胞的損傷。因此，隨著對(duì)反應(yīng)性AS功能及其作用機(jī)制的深入研究，它已逐漸成為保護(hù)和促進(jìn)髓鞘再生的一類重要潛在靶細(xì)胞。

葡萄籽原花青素低聚體(grape seed proanthocyanidins，GSPs)是最為安全有效的抗氧化劑之一，具有抗炎、抗惡性腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、抗衰老和神經(jīng)保護(hù)等藥理作用，被廣泛應(yīng)用于食品、化妝品、藥品和保健品等領(lǐng)域[7-9]。基于其優(yōu)良的抗炎作用，我們前期探索了GSPs對(duì)CPZ脫髓鞘小鼠的治療作用，發(fā)現(xiàn)GSPs可顯著緩解CPZ誘導(dǎo)的髓鞘脫失，減少中樞炎性因子的分泌[10]，同時(shí)誘導(dǎo)膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)陽(yáng)性的AS在病灶區(qū)的富集，說(shuō)明GSPs可能通過(guò)AS發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。因此，本研究以體外原代AS為研究對(duì)象，初步探討了GSPs靶向AS的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 原代星形膠質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)將新出生2-7 d的C57BL/6小鼠，用冰低溫麻醉2～10 min后，用75的乙醇對(duì)幼鼠的頭部和頸部進(jìn)行消毒后進(jìn)行斷頭處理。將大腦取出后，置于冰浴的高糖DMEM(Gibco，11995040)中，在體視顯微鏡下仔細(xì)剝離腦膜，用滅菌后的眼科剪將腦組織剪成1 mm3的碎片。將組織碎片置于0.25%胰蛋白酶EDTA溶液(Thermo Fisher Scientific)中，溫和搖動(dòng)培養(yǎng)10 min后，添加完全培養(yǎng)液中止胰蛋白酶反應(yīng)。完全培養(yǎng)液是含有10%胎牛血清的高糖DMEM。消化的組織以300×g×5 min離心，小心地去除上清液，并重懸于高糖DMEM中，通過(guò)40 μm的nylon膜將組織分離成單細(xì)胞懸液。獲得的單細(xì)胞懸液接種于T75培養(yǎng)瓶中，以獲得原代混合膠質(zhì)細(xì)胞。培養(yǎng)瓶提前用100 mg·L-1的多聚賴氨酸(分子量為15～30萬(wàn))包被后在4 ℃過(guò)夜，用PBS洗滌3次并在使用前干燥。原代混合膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)2 d后更換新鮮的完全培養(yǎng)液，此后每3 d更換1次培養(yǎng)液，通常7～11 d混合膠質(zhì)細(xì)胞會(huì)鋪滿培養(yǎng)瓶底。將長(zhǎng)滿的培養(yǎng)瓶放置于搖床以180 r·min-1的轉(zhuǎn)速搖動(dòng)24 h以去除小膠質(zhì)細(xì)胞(microglia，MG)。然后加入新鮮的AS培養(yǎng)基(ScienCell，1801)，并以240 r·min-1的轉(zhuǎn)速搖動(dòng)6 h以去除少突膠質(zhì)細(xì)胞前體細(xì)胞(oligodendrocyte progenitor cells，OPCs)。剩下的細(xì)胞在實(shí)驗(yàn)前差速貼壁30 min，進(jìn)一步純化AS。

1.2 免疫熒光染色法待細(xì)胞融合度達(dá)到80%左右時(shí)，移除培養(yǎng)液，PBS洗滌3次后，室溫4%多聚甲醛固定10 min，0.3%的TritonX-100通透10 min。牛血清白蛋白工作液室溫封閉后，加入抗GFAP抗體(CST，12389)，4 ℃孵育過(guò)夜。加入FITC標(biāo)記的二抗，避光室溫孵育1.5 h。DAPI避光孵育染核20 min，滴加抗熒光淬滅封片液(Thermo，P36970)，封片后使用熒光顯微鏡檢測(cè)(Leica，DM40008)。

1.3 細(xì)胞活力檢測(cè)實(shí)驗(yàn)原代AS進(jìn)行實(shí)驗(yàn)之前，免疫熒光法染色AS標(biāo)記物膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)進(jìn)行純度檢測(cè)，其陽(yáng)性率超過(guò)95%。將原代AS接種于96孔板，培養(yǎng)24 h后，分別用不同濃度(0、2.5、5、10、20、30和50 mg ·L-1)的GSPs孵育24 h。乳酸脫氫酶(LDH)法：將96孔板以300×g離心5 min，每孔吸取上清液置于另一平底96孔板，按照LDH檢測(cè)試劑盒(Solarbio，BC0685)說(shuō)明書檢測(cè)各組上清液中LDH的含量。MTT法：將MTT工作液(5 mg ·L-1)加到96孔板，每孔加入10 μL，在CO2培養(yǎng)箱里孵育4 h，棄去培養(yǎng)液，每孔加入100 μL的DMSO，溶解后在490 nm處檢測(cè)其光密度optical density(OD)值。

1.4 DPPH、ABTS自由基清除實(shí)驗(yàn)DPPH實(shí)驗(yàn)：分別將10 μL的空白提取液、陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品溶液和不同濃度的GSPs(0、2.5、5、10、20和30 mg·L-1)加入到190 μL的DPPH工作液中，室溫避光孵育30 min，在最大吸收峰515 nm處檢測(cè)吸光度(OD)值，計(jì)算清除率/%=(A空白-A測(cè)定)/A空白×100%。ABTS實(shí)驗(yàn)：空白組：將24 μL的ddH2O加入到180 μL的ABTS混合液中；GSPs組和陽(yáng)性對(duì)照組維生素C(Vitamin C，Vc)：分別將6 μL的陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品溶液和不同濃度的GSPs加入到180 μL的ABTS混合液和18 μl蒸餾水中，反應(yīng)10 min后，于最大吸收峰593 nm處測(cè)定吸光度值，計(jì)算清除率/%=(A空白-A測(cè)定)/A空白×100%。

1.5 A1型反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞模型的建立、藥物干預(yù)和細(xì)胞因子檢測(cè)原代AS用3 μg·L-1的IL-1α(PeproTech，315-01A)、30 μg·L-1的TNF-α(PeproTech，215-11A)和400 μg·L-1的C1q(MyBioSource，MBS143105)孵育24 h，建立A1型AS。30 μg·L-1的GSPs(購(gòu)自沐凡生物科技有限公司)加入上述的模型中，孵育24 h以干預(yù)AS的極化。實(shí)驗(yàn)分組為正常組(Nor)、A1型AS組(Model)和GSPs干預(yù)組(GSPs)。24 h后更換新鮮的AS培養(yǎng)液，收集上清采用ELISA法檢測(cè)相關(guān)的細(xì)胞因子。使用R&D公司的夾心ELISA試劑盒檢測(cè)TNF-α、IL-1α、IL-6、IL-17和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(Transforming growth factor-β，TGF-β)等細(xì)胞因子。使用凡科維公司ELISA試劑盒檢測(cè)睫狀神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(Ciliary neurotrophic factor，CNTF)、H2O2和ROS等因子。細(xì)胞因子單位為ng·L-1。

1.6 RT-PCR法PBS洗滌細(xì)胞2次后，收集各組的原代AS，使用RNAiso Plus+(TaKaRa，9108)從細(xì)胞中提取總RNA。將提取的總RNA用PrimeScriptTM1st Strand cDNA Synthesis Kit(TaKaRa，6110A)逆轉(zhuǎn)錄為第一鏈cDNA。使用TB Green? Premix Ex TaqTMROX plus(TaKaRa，RR42LR)和CFX96 Optics Module熒光定量PCR儀(Bio-Rad)進(jìn)行定量PCR擴(kuò)增。引物序列參考已經(jīng)發(fā)表的文獻(xiàn)，由上海BioTNT公司合成[11-12]。采用2-ΔΔCt法計(jì)算mRNA表達(dá)量。Tab 1是使用的引物序列。

Tab 1 Primers for RT-PCR

1.7 Western blot法移除培養(yǎng)液，用PBS洗滌細(xì)胞兩次以去除雜質(zhì)。然后將各組細(xì)胞用RIPA裂解液(Sigma，R0278)在冰上裂解1 h后，在 4 ℃、13 000 r·min-1離心20 min。在RIPA蛋白裂解液中添加混合的蛋白酶抑制劑(Thermo，87786)防止蛋白質(zhì)降解。蛋白質(zhì)濃度通過(guò)BCA蛋白質(zhì)測(cè)定法測(cè)定。通過(guò)SDS-PAGE分離等量的蛋白質(zhì)(30 μg)并半干轉(zhuǎn)到PVDF膜(Millipore，USA)。用5%脫脂奶粉封閉后，分別用抗C3d抗體(CST，97425)、抗c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)JNK抗體(ABcam，ab199380)、抗P-JNK抗體(ABcam，ab278616)和抗GAPDH(ABcam，ab9484)在4 ℃孵育過(guò)夜。TBST洗滌3次后，用種屬對(duì)應(yīng)的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗室溫孵育2 h。洗滌后，使用增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光(ECL)系統(tǒng)(GE Healthcare Life Sciences，USA)可視化蛋白條帶。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法各組數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差描述，采用GraphPad Prism 8.0軟件(GraphPad software，La Jolla，CA)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。單因素方差分析(ANOVA)后，兩兩比較采用Tukey′s post-hoc test，單一比較通過(guò)未配對(duì)t檢驗(yàn)評(píng)估。

2 結(jié)果

2.1 GSPs對(duì)原代星形膠質(zhì)細(xì)胞活力的影響不同濃度的GSPs干預(yù)24 h后，分別采用LDH法和MTT法檢測(cè)了藥物對(duì)原代AS毒性和細(xì)胞增殖的影響。結(jié)果表明低、中濃度的(2.5、5、10、20和30 mg ·L-1)GSPs對(duì)原代AS沒有細(xì)胞毒性，也不影響細(xì)胞的增殖，但高濃度(35、40和50 mg·L-1)對(duì)細(xì)胞有明顯的細(xì)胞毒性(Fig 1A)，且抑制細(xì)胞的增殖(Fig 1B)。這表明GSPs的給藥濃度在30 mg ·L-1之內(nèi)對(duì)原代AS的活力沒有影響，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)藥物濃度的確定提供了依據(jù)。

Fig 1 Low concentration of GSPs had no effect on viability of primary AS LDH assay and MTT assay were used to detect the toxicity of different concentrations of GSPs to primary AS. *P<0.05，**P<0.01 vs 0 mg·L-1

2.2 GSPs在體外氧自由基清除實(shí)驗(yàn)為了確定GSPs的最優(yōu)給藥濃度，檢測(cè)了GSPs的抗氧化作用，基于細(xì)胞活力實(shí)驗(yàn)結(jié)果，GSPs的最大給藥濃度為35 mg·L-1。與Vc組相比，GSPs在體外對(duì)DPPH和ABTS自由基具有強(qiáng)大的清除作用，且具有濃度依賴性，且在30 mg·L-1時(shí)清除率分別達(dá)到95%和92%(Fig 2)。因此，將GSPs的給藥濃度確定為30 mg·L-1。

Fig 2 GSPs had a strong scavenging effect on DPPH and ABTS free radicals in vitro in a concentration-dependent manner**P<0.01 vs Vc.

2.3 GSPs對(duì)原代AS極化的影響為了研究GSPs對(duì)AS極化的影響，從新生小鼠中提取分離原代AS，并使用免疫熒光法測(cè)定AS特異性標(biāo)記物GFAP。如Fig 3A所示，絕大多數(shù)細(xì)胞呈GFAP陽(yáng)性，顯綠色熒光。DAPI染核，胞核呈藍(lán)色，為總細(xì)胞數(shù)。用IL-1α、TNF-α和C1q孵育原代AS，發(fā)現(xiàn)A1型標(biāo)記C3d和C1q在基因水平明顯增加(Fig 3B)。進(jìn)一步對(duì)蛋白水平進(jìn)行了檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)與正常組相比，模型組C3d和C1q的表達(dá)明顯升高(Fig 3C、3D)，表明A1型AS模型成功建立。為了探索GSPs對(duì)AS極化作用，用30 mg·L-1的GSPs干預(yù)A1型AS的極化，發(fā)現(xiàn)藥物可顯著降低C3d和C1q的表達(dá)(Fig 4A、4B)，抑制其向A1型極化。

Fig 3 GSPs inhibited AS polarization to type A1

Fig 4 GSPs inhibited AS polarization to type A1

2.4 GSPs對(duì)A1型AS分泌的細(xì)胞因子的影響研究表明，A1型AS可通過(guò)分泌細(xì)胞因子發(fā)揮作用。因此，我們檢測(cè)了GSPs(30 mg·L-1)對(duì)其分泌的細(xì)胞因子的影響。發(fā)現(xiàn)GSPs明顯抑制促炎因子TNF-α、IL-1α和IL-6的分泌(Fig 5A)，減少氧化應(yīng)激因子H2O2的表達(dá)(Fig 5B)，促進(jìn)抑炎因子TGF-β和神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子CNTF(Fig 5C)的分泌。

Fig 5 GSPs inhibited secretion of inflammatory factors and promoted secretion of anti-inflammatory factors and neurotrophic factors

2.5 GSPs對(duì)A1型星形膠質(zhì)細(xì)胞JNK的影響研究表明，IL-1α、TNF-α和C1q激活的AS中JNK信號(hào)通路被激活，與AS的炎癥反應(yīng)有關(guān)，因此，接下來(lái)檢測(cè)了GSPs對(duì)JNK的影響，發(fā)現(xiàn)GSPs明顯下調(diào)了AS中JNK的磷酸化水平(Fig 6)。

Fig 6 Phosphorylation of JNK in AS inhibited by GSPs was determined by Western blot**P<0.01 vs Model.

3 討論

神經(jīng)炎性脫髓鞘疾病中，大量的反應(yīng)性AS增殖，雖然其作用機(jī)制尚不清楚，但Barres等[13]根據(jù)其表型和功能的變化，發(fā)現(xiàn)神經(jīng)炎癥和缺血誘導(dǎo)了兩種不同類型的反應(yīng)性AS，并將其命名為A1型和A2型。A1型AS大量存在于阿爾茨海默病、帕金森病、肌萎縮側(cè)索硬化癥和MS中[3，14]，并喪失了促進(jìn)神經(jīng)元存活、突觸重塑和吞噬的能力，同時(shí)分泌諸多神經(jīng)毒性因子損傷神經(jīng)元和髓鞘結(jié)構(gòu)。如在EAE模型中，A1型可以通過(guò)高表達(dá)乳糖神經(jīng)酰胺，促進(jìn)髓鞘脫失和加重中樞炎癥的效應(yīng)[5]。與之相反，A2型則上調(diào)了許多神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的表達(dá)，促進(jìn)CNS受損組織的恢復(fù)和修復(fù)。如A2型可分泌CXCL8、CXCL1和CXCL10等趨化因子募集OPCs至脫髓鞘部位、高表達(dá)基質(zhì)金屬蛋白酶-1(metalloproteinase-1，TIMP-1)和腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)促進(jìn)髓鞘再生[13，15]。因此，抑制A1型或誘導(dǎo)A2型反應(yīng)性AS可能對(duì)疾病產(chǎn)生有益的影響。本研究采用促炎因子C1q、TNF-α和IL-1α誘導(dǎo)高表達(dá)C3d的A1型AS，而GSPs可明顯抑制C3d的表達(dá)，表明GSPs可能通過(guò)抑制A1型AS緩解髓鞘脫失。

研究發(fā)現(xiàn)，屬于絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)的JNK信號(hào)通路，可以參與AS的激活[16]。我們的實(shí)驗(yàn)證明了C1q、TNF-α和IL-1α誘導(dǎo)的A1型AS中存在JNK磷酸化的明顯增加，提示JNK信號(hào)通路的活化可能與AS的極化有關(guān)。而GSPs是原花青素低聚體的混合物，包括兒茶素、表兒茶素和原花青素B2等有效成分，采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法預(yù)測(cè)其作用靶點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)GSPs抑制中樞神經(jīng)氧化應(yīng)激和炎性因子的機(jī)制可能與JNK的磷酸化有關(guān)[17]。本研究發(fā)現(xiàn)GSPs能夠降低A1型AS中JNK的磷酸化，抑制AS向A1型極化，說(shuō)明減少JNK的磷酸化GSPs影響AS極化的靶點(diǎn)，為進(jìn)一步研究GSPs的作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

反應(yīng)性AS的表型是動(dòng)態(tài)變化的，其極化趨勢(shì)主要取決于微環(huán)境的不同刺激。如Barres等報(bào)道異?；罨腗G可通過(guò)分泌C1q、TNF-α和IL-1α作用于AS，并誘導(dǎo)其向A1型極化。A1型AS通過(guò)分泌IL-1α、TNF-α、IL-6、IL-17和C1q等促炎因子及H2O2和ROS等氧化應(yīng)激因子攻擊和損傷神經(jīng)組織的同時(shí)，還可以反作用于A1型AS加重和促進(jìn)繼發(fā)性炎癥反應(yīng)。如IL-17與其受體結(jié)合，可激活A(yù)S下游的核因子(nuclear factor κB，NF-κB)，導(dǎo)致促炎因子的產(chǎn)生。而抗炎因子如IL-4、IL-10和TGF-β等，可以逆轉(zhuǎn)A1型AS，激活A(yù)S的神經(jīng)保護(hù)作用，誘導(dǎo)其向A2型極化[18]。如TGF-β信號(hào)能介導(dǎo)NF-κB的抑制，從而緩解中風(fēng)后的神經(jīng)炎癥。因此，有目的性地改變反應(yīng)性AS的微環(huán)境，有利于獲得具有神經(jīng)保護(hù)作用的表型。為了研究GSPs抑制A1型AS極化的作用機(jī)制，我們進(jìn)一步檢測(cè)了體系中相關(guān)的炎性因子、氧化應(yīng)激因子、抗炎因子和神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子。結(jié)果表明，GSPs可以明顯減少IL-1α、TNF-α、IL-6、IL-17和C1q的分泌，抑制H2O2的表達(dá)，同時(shí)提高TGF-β和CNTF的水平，說(shuō)明GSPs抑制AS向A1型極化與其能改善促炎微環(huán)境密切相關(guān)。但本次實(shí)驗(yàn)僅在體外探索了GSPs對(duì)AS的直接作用，由于在機(jī)體內(nèi)AS的極化是由多種因素共同決定的，所以我們將進(jìn)一步研究GSPs是否可以通過(guò)影響其它細(xì)胞產(chǎn)生效應(yīng)。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)GSPs可明顯抑制AS向A1型極化，作用機(jī)制與其顯著抑制JNK的磷酸化有關(guān)。此外，GSPs還能減少炎性因子和氫自由基的產(chǎn)生，促進(jìn)抗炎因子和神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的分泌，進(jìn)而改善炎癥微環(huán)境，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。