兔血漿-APTT法測定水蛭抗凝血活性的劑量-效應曲線考察和測定方法確定研究

肖斯婷，胡宇馳，郭玉東，許華玉，楊文良，李 波

(1. 北京市藥品檢驗研究院、國家藥品監(jiān)督管理局創(chuàng)新藥物安全研究與評價重點實驗室、中藥成分分析與生物評價北京市重點實驗室，北京 102206; 2.國家藥典委員會，北京 100061; 3.中國食品藥品檢定研究院，北京 102629)

水蛭是收載入《中國藥典》的典型活血化瘀藥物，其功能主治為破血通經(jīng)、逐瘀消癥[1]。已有的研究證明，水蛭活性有抗凝血、抗血栓形成、抑制血小板聚集、改善血液流變學、促進纖溶等，抗凝血是其最顯著的藥理作用[2]。研究證實，水蛭有縮短活化部分凝血活酶時間(activated partial thromboplastin time,APTT)的作用,在整體動物實驗和離體實驗均具有規(guī)律的一致性[3-4]。測定水蛭加入血漿后APTT的延長情況，可能是量化測定水蛭抗凝血活性質(zhì)量控制的研究方向，命名為抗凝血活性測定法。

本文進行兔血漿-APTT法測定水蛭抗凝血活性的實驗方法設計研究，先進行劑量-效應曲線考察，統(tǒng)計分析后選擇測定方法的統(tǒng)計模型，并進行樣品的預測定，探索出可行的量化測定水蛭抗凝血活性的方法體系。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑螞蟥飲片，由北京康而福藥業(yè)有限公司提供3批，批號分別為：20171201、20171202、20171203，采用冰凍粉碎機粉碎成100目碎末。日本醫(yī)蛭藥材，由貴州信邦制藥股份有限公司提供4批，批號分別為：20171001、20171002、20170902、20170901。螞蟥對照藥材，批號：121061-201806，購自中國食品藥品檢定研究院。菲牛蛭對照藥材，批號：121754-201901，購自中國食品藥品檢定研究院。APTT試劑，由Instrumentation Laboratory Co儀器實驗公司生產(chǎn)，批號：N0394780。枸櫞酸鈉購自北京化學試劑公司。

1.2 儀器全自動血液凝固分析儀，ACLELTTE PRO，Instrumentation Laboratory Company。

1.3 動物與血漿日本大耳白家兔，購自北京隆安實驗動物養(yǎng)殖中心，動物許可證號：SCXK(京)2019-0006。家兔頸總動脈取血，3.2%枸櫞酸鈉1 ∶9抗凝，2 500 r·min-1離心15 min制備血漿，將多只(3只以上)兔血漿混勻，備用。

1.4 浸提液制備與APTT值測定精密稱取螞蟥藥材、日本醫(yī)蛭藥材以及螞蟥、菲牛蛭和土鱉蟲對照藥材，加0.9%氯化鈉注射液，4 ℃浸提30 min，5 000 r·min-1離心20 min，取0.1 mg·L-1上清液，再加0.9%氯化鈉注射液稀釋配制成不同濃度的浸提液，采用全自動血凝儀和家兔血漿，測定不同濃度浸提液的APTT值。反應體系：20 μL不同濃度水蛭浸提液，兔血漿50 μL，APTT試劑50 μL，混勻，37 ℃±0.5 ℃預溫180 s，每管再加入CaCl2試劑50 μL，測定凝結時間。

1.6 測定值方差齊性分析采用1批菲牛蛭對照藥材，配制成0、5、10、20、30、50 g·L-1，在同一臺血凝儀上分別測定6次APTT值，對APTT和對數(shù)轉換后的APTT進行方差齊性檢驗，分析在何種情況下測定值之間出現(xiàn)方差齊性。

1.7 測定體系的選擇根據(jù)劑量效應值曲線呈現(xiàn)直線的劑量范圍和測定值處理值，選擇測定值方差齊性的處理模式，按照專屬性好、精密度符合要求、實驗量少的原則確定最佳的實驗體系。

1.8 樣品預測定采用對照藥材作對照品，按照選定的測定體系，平行制備對照藥材和藥材樣品的浸提液，平行測定多劑量APTT值，按照預先編制的符合要求的統(tǒng)計軟件進行生物活性測定統(tǒng)計，觀察曲線的特征是否符合統(tǒng)計學要求，初步判定測定體系的適宜性。

2 結果

2.1 劑量效應曲線特征考察4批日本醫(yī)蛭和3批螞蟥藥材，不同濃度浸提液測定APTT數(shù)據(jù)列表如下。

日本醫(yī)蛭制備浸提液后，隨濃度的升高離體血漿的APTT值不斷延長，有明顯的量效關系。日本醫(yī)蛭的作用較強，有的批次在0.05 kg·L-1或0.08 kg·L-1即超出了全自動血凝儀測定上限299 s；同時，不同批次之間的作用強度有較大差異。

Tab 1 Concentration-APTT determination data of 2 batches of Japanese medical leeches extract

Tab 2 Concentration-APTT determination data of 2 batches of Japanese medical leeches extract

Tab 3 Concentration -APTT determination data of 2 batches of leech extract

螞蟥制備浸提液后，隨濃度的升高離體血漿的APTT值也不斷延長，有明顯的量效關系。但螞蟥的延長作用較日本醫(yī)蛭弱，且APTT延長到一定濃度后延長不明顯，說明螞蟥延長APTT值有一定的上限。 對上述7批樣品的測定數(shù)據(jù)進行作圖，以濃度為X軸(kg·L-1)，APTT值為Y軸(s)，結果見Fig 1。日本醫(yī)蛭和螞蟥的曲線有明顯不同，日本醫(yī)蛭能夠?qū)PTT值延長到超過儀器測定上限，而螞蟥的浸提液APTT延長到一定程度后會有平臺期。由Fig 1可見，日本醫(yī)蛭和螞蟥藥材的濃度-APTT，均不是直線，回歸相關性較差。

Fig 1 Concentration-APTT curve of leeches

對上述的7批藥材樣品的測定數(shù)據(jù)，以濃度為X軸(kg·L-1)，以APTT值的對數(shù)值為Y軸，結果見Fig 2?？梢?批日本醫(yī)蛭明顯成為一條直線，而螞蟥有反應平臺值，初步觀察并同通過曲線擬合，可見螞蟥0.025 kg·L-1前呈現(xiàn)直線關系，見Fig 3。以濃度對數(shù)為X軸(kg·L-1)，以APTT值為Y軸，結果見Fig 4?？梢?批日本醫(yī)蛭和螞蟥的曲線均不是直線，R2值小于0.9，兩者特征有明顯不同。以濃度的對數(shù)為X軸(kg·L-1)，以APTT值的對數(shù)為Y軸，結果見Fig 5。可見4批日本醫(yī)蛭數(shù)據(jù)接近直線，3批螞蟥的數(shù)據(jù)不是直線，而低劑量下曲線接近直線。

課題組歸納出一些具體的學生創(chuàng)新學習方法，如自主學習、問題學習、開放學習、案例學習、課題學習和網(wǎng)絡學習等方法[3]，增強學生探究和體驗的機會。

Fig 2 Concentration-APTT logarithmic curve of leeches

Fig 3 Concentration-APTT logarithmic curve of leeches (concentration 0～0.025 kg·L-1)

Fig 4 Log-APTT curve of concentration of leeches

Fig 5 Log-APTT log curve of concentration of leeches

采用螞蟥、菲牛蛭和土鱉蟲對照藥材進行一系列濃度的APTT值測定，繪制曲線，螞蟥對照藥材的曲線特征與3批螞蟥藥材相似，菲牛蛭對照藥材的曲線特征與4批日本醫(yī)蛭藥材樣品相似，濃度與APTT的對數(shù)作圖見Fig 6。由Fig 6可見，螞蟥對照藥材的濃度與APTT的對數(shù)在低劑量時呈現(xiàn)良好的線性關系，且直線通過空白對照。菲牛蛭對照藥材的濃度與APTT的對數(shù)呈現(xiàn)良好的線性關系，且直線基本通過空白對照。土鱉蟲對照藥材無延長APTT的作用。從曲線考察結果來看，日本醫(yī)蛭適合采用斜率比法進行效價測定，也可以采用量反應平行線法；而螞蟥在低劑量時，適合采用斜率法和量反應平行線法。

Fig 6 Logarithmic curve of concentration-APTT for leeches, Philippine cattle leeches and Trionyx sinensis

Fig 7 APTT logarithmic data points of different dosimetry

2.2 方差齊性分析結果將菲牛蛭對照藥材6個濃度浸提液分別測定6次APTT值列表，數(shù)據(jù)見Tab 4。對APTT值和對數(shù)轉換后的APTT值，用SPSS 17.0軟件進行方差齊性檢驗，結果可見對數(shù)APTT值各劑量的標準差未出現(xiàn)顯著性差異(P=0.888)，APTT值各劑量之間的方差存在顯著差異(P=0.002)，方差分析結果見Tab 5。

Tab 4 APTT data of phellodendrine leeches at different doses

Tab 5 Test results of homogeneity of variance of APTT data measured at different doses(Test of homogeneity of variances)

2.3 活性測定體系的確定綜合7批藥材樣品和螞蟥對照藥材、菲牛蛭對照藥材的量效關系曲線分析來看，在低劑量情況下，測定體系符合以下斜率比模型的特征： ① 在劑量較低的情況下，APTT值測定沒有達到平臺期，日本醫(yī)蛭和螞蟥藥材的濃度-APTT對數(shù)值呈直線，且直線最終相交于零濃度。② 經(jīng)方差齊性分析，APTT值經(jīng)對數(shù)轉換后，APTT測定值呈正態(tài)分布；不同劑量間生物反應的標準差不出現(xiàn)顯著性差異，說明主要影響因素是劑量的差異。③ 所有測定樣品的劑量范圍內(nèi)，至少有3個濃度的量-效關系滿足呈直線要求。因此，從數(shù)據(jù)來分析，可采用3劑量的斜率比法進行水蛭抗凝血活性的測定。

斜率比法進行統(tǒng)計分析時，實驗成立的條件應至少滿足以下3點：① 回歸分析應顯著，P值應小于0.05，表明APTT測定結果隨劑量出現(xiàn)顯著差異。② 截距差異應不顯著，P值應大于0.05，表明樣品和對照品的曲線相交點在0濃度。③ 非線性應不顯著，P值應大于0.05，表明樣品和對照品的線性特征一致。

2.4 樣品預測定結果采用螞蟥對照藥材做標準品，分別對3批螞蟥和4批日本醫(yī)蛭制備浸提液，稀釋成5、10、15 g·L-1濃度溶液，平行測定各劑量的APTT，將測定的APTT值輸入斜率比法計算模板，測定3批螞蟥和4批日本醫(yī)蛭相對于螞蟥對照藥效的相對效價，見Tab 6和Fig 8、9。

Tab 6 Statistics of slope ratio method for predicting anticoagulant activity of leeches

Fig 8 Anticoagulant activity data of leeches by slope ratio method

Fig 9 Anticoagulant activity data of leeches by slope ratio method

從預測定結果來看，以螞蟥對照藥材可以作為螞蟥的活性測定對照品來使用，實驗均成立。但不能用來測定日本醫(yī)蛭的抗凝血活性，實驗均不成立。

采用菲牛蛭對照藥材為標準品，同時與4批日本醫(yī)蛭制備浸提液，稀釋成5、10、15 g·L-1濃度溶液，采用斜率比法計算模板計算4批日本醫(yī)蛭相對于菲牛蛭對照藥材的相對效價。見Fig 10和Tab 7。

Tab 7 Prediction results of leech anticoagulant activity by slope ratio method

Fig 10 Anticoagulant activity data of leeches by slope ratio method

3 討論

自《中國藥典》2010年版收載中藥生物活性測定指導原則以來，采用生物活性測定進行中藥質(zhì)量控制越來越成為中藥研究者的共識，國家藥監(jiān)局藥品審評中心2020年發(fā)布了《中藥生物效應檢測研究技術指導原則(試行)》[5],中藥標準中收載體現(xiàn)其臨床治療效應的量化評價、整體評價也就成為了研究的熱點方向。國家藥典委員會也認為，通過研究代表藥物的生物活性測定方法，建立科學、合理的生物活性測定標準，可以提升我國中藥質(zhì)量控制的總體能力，尤其是臨床大量運用、具有我國傳統(tǒng)醫(yī)學特點、基礎研究非常深入的活血化瘀類藥物是重點方向和可行方向[6]。但國家藥典委員會同時也指出，生物檢定方法在如何確認和評價方法的適用性和準確性方面存在風險，應進行生物檢定方法的設計、開發(fā)及驗證的關鍵技術研究，適當時候制定指導原則[6]。水蛭在體內(nèi)和體外具有延長血漿APTT值的作用，體外延長APTT作用具有明顯的隨劑量增加而延長的作用，這是建立量化評價的生物活性質(zhì)控方法的最好基礎。課題組在2013年得到這個規(guī)律后，多年來都在嘗試遵循一種科學規(guī)范過程建立科學適宜的標準，本文就是中藥生物活性測定方法設計方面的一種探索。

3.1 生物活性測定方法建立的第一步是進行劑量-效應曲線的全面考察生物檢定方法的統(tǒng)計前提是不同劑量之間的生物效應值存在顯著差異、測定的效應值的決定性因素主要是劑量不同。劑量-效應曲線的全面考察需要了解的信息主要有3點：

一是曲線的極值(或者說范圍)的了解，所有的藥理效應都是S型或反S型的曲線,針對曲線需要了解的極值信息有：效應的最大值和最小值，高平臺期和低平臺期對應的劑量范圍，最高效應和最低效應的差值，接近最高平臺期和最低平臺期的劑量差距范圍，以及S型曲線是否對稱。二是劑量-效應曲線的最佳擬合方程。三是測定效應值的方差齊性檢驗，方差不齊的應通過數(shù)學轉換，包括對數(shù)轉換、倒數(shù)轉換等，找到計算出方差齊性的轉換方法。

本文采用螞蟥和水蛭多批次樣品，進行了多次不同劑量浸提液-APTT值的測定，對劑量-效應的曲線特征的3點信息都有了明確的了解。一是極值，對螞蟥來說存在APTT的平臺期，劑量不得太大，APTT值也不能太高，在螞蟥的極值范圍內(nèi)，日本醫(yī)蛭具有同樣的劑量-效應特點但沒有極值，說明方法設計應考慮螞蟥的APTT測定平臺期的影響，也最好有能夠區(qū)分螞蟥和日本醫(yī)蛭的統(tǒng)計方法。二是最佳擬合方程，本文嘗試了APTT值、APTT對數(shù)值、劑量值、劑量對數(shù)，組合起來為4種擬合方法，基本明確在較低劑量時APTT對數(shù)值與水蛭濃度(包括水蛭濃度為零)的直線關系顯著性最好。三是經(jīng)過多次測定的方差齊性分析表明，各劑量之間的APTT對數(shù)值誤差符合正態(tài)分布，APTT值各劑量之間的方差是不相同的，說明APTT對數(shù)值的影響因素才主要是水蛭的劑量。

劑量-效應曲線考察后，可以確定的有：Y值應該采用APTT對數(shù)值，APTT值測定注意平臺期，X值可以選擇劑量、或者劑量的對數(shù)。但是劑量取對數(shù)后，螞蟥因平臺期劑量范圍比較小，日本醫(yī)蛭在不同批次之間因活性差異平行性并不是很好，課題組一直嘗試采用量反應平行線法進行測定，當時一直認為采用廣泛使用的量反應平行線法是最可能的方法，未進行更多的曲線擬合，結果發(fā)現(xiàn)不同樣品之間時常出現(xiàn)方法學不成立，幾年的時間內(nèi)方法學研究都無法完整完成。當采用規(guī)范的方法進行多種曲線模擬的時候，發(fā)現(xiàn)APTT平臺期下最適宜的擬合曲線是劑量-APTT對數(shù)，采用量反應平行線不是最佳的方法，符合劑量-效應曲線特征的最佳方法可能是斜率比法。因此，本文研究過程也說明了生物檢定方法建立的過程中遵循科學規(guī)范的重要性。

3.2 生物檢定方法建立的第二步是確定劑量設計和誤差控制生物檢定法設計中有一個基本規(guī)律，在達到要求的準確度和精密度的前提下，應優(yōu)選劑量多、實驗量小的設計。斜率比法屬于量反應檢定法，常見的有具有空白對照的(1·k·k)法和沒有空白對照的(k·k)法。根據(jù)水蛭的劑量-效應關系曲線，本法可以在APTT延長到空白對照的2～3倍的劑量區(qū)間設置3劑量，因此選擇的實驗設計為(1·3·3)法，樣品和標準品設計3個劑量，高劑量一般在10～30 mg之間。依據(jù)斜率比法的統(tǒng)計原理，零劑量和3個劑量的4個數(shù)應成為等差數(shù)列。本文設計的(1·3·3)法，要求的可信限率(FL%)不得大于15%，每個劑量的實驗次數(shù)m值不小于2即可達到，也即試驗中配制6個濃度待測液，測定14個APTT值即可，測定工作效率精度均比較好。假設采用(2·2)法，因方法學成立統(tǒng)計和可信限率要求，實際需要的APTT測定次數(shù)可能更多；而采用(4·4)法，高劑量容易遇到平臺期導致方法學不成立；綜合來看，采用(1·3·3)是最佳方法。

生物檢定法是定量藥理學實驗，誤差控制的基本原則是要求實驗操作的平行性。例如，需要注意樣品配制、稀釋等實驗各個步驟對照品和供試品的平行性，盡量保證相同濃度的標準品和供試品稀釋液的測定時間接近。測定中建議使用空白、S1、S2、S3、T1、T2、T3，空白、T1、T2、T3、S1、S2、S3的順序進行測定，當各劑量反應個數(shù)比較多時，可重復推薦的順序。

劑量設計中還有一個考慮點，即方法最可能成立的劑量在哪個范圍。生物檢定方法的標準中，一般會推薦劑量，那就是因為在方法建立的研究過程中，已經(jīng)充分了解到劑量-效應曲線的特征，選擇出了測定最靈敏的劑量范圍，不使用推薦的劑量非常容易出現(xiàn)統(tǒng)計學不成立或誤差大，例如肝素活性的顯色法就推薦了劑量范圍[7]。本文研究發(fā)現(xiàn)，對照品的S1設置在5 g·L-1左右最適合，如果S1超過10 g·L-1則大劑量容易落在平臺期，方法學容易不通過。

3.3 生物檢定方法建立的第三步是確定進行預實驗或預測定，進一步發(fā)現(xiàn)方法的一些注意事項或方法特點在確定劑量設計和誤差控制后，應制定標準操作規(guī)程草案，然后按照草案選擇樣品進行實驗，可以更好觀察到方法的特點，進一步細化方法的注意事項。

本文研究過程中，進行曲線考察時注意到劑量-APTT對數(shù)的曲線是經(jīng)過0濃度的，初設方法是(1·3·3)法包括空白對照，希望通過空白對照的顯著性檢驗來減少實驗誤差。但在實際的樣品測定中，發(fā)現(xiàn)空白對照對測定值是沒有影響，而因為樣品是加入水蛭而對照中加入的是氯化鈉注射液，反而會出現(xiàn)空白的顯著性差異，因此在統(tǒng)計學要求中不再要求空白對照的顯著性不得出現(xiàn)差異，操作的誤差控制要求兩個空白對照不得出現(xiàn)顯著差異即可。

本文在進行樣品預測定過程中，還發(fā)現(xiàn)日本醫(yī)蛭采用螞蟥對照藥材來進行測定會出現(xiàn)截距的顯著差異而方法學不成立，說明本法能夠區(qū)分日本醫(yī)蛭和螞蟥是不同質(zhì)的，方法的專屬性好，進一步證明了斜率比法測定水蛭抗凝血活性是科學的。而采用菲牛蛭對照藥材做對照，測定日本醫(yī)蛭的抗凝血活性，4批樣品雖然活性差異較大但斜率比法的方法學統(tǒng)計均成立，說明日本醫(yī)蛭和螞蟥均可以采用斜率比法進行活性控制，只不過需要采用各自的對照藥材。

3.4 下一步的方法學研究實驗設計是生物活性測定成敗的關鍵所在[8]。本文的研究過程，說明了劑量-效應曲線應當遵循一定的規(guī)范進行充分考察，這也是找到最佳實驗設計的重要步驟。當然生物檢定方法種類非常多，本文敘述的過程在具體的實例中可能會有所不同。

在生物檢定方法基本建立之后，需要繼續(xù)遵循規(guī)范進行實驗室內(nèi)的方法學考察，包括專屬性、精密度、準確性等，對中藥生物活性測定方法來說，進行實驗室間的聯(lián)合驗證尤為關鍵，只有多家實驗室均能夠重現(xiàn)的方法，測定結果的精密度符合要求，才有可能成為在標準中實際運用的方法。