基于術(shù)中快速分子病理檢測的腦膠質(zhì)瘤手術(shù)策略研究進展

熊章 羅宸 吳帥 吳勁松

根據(jù)2021版《WHO中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤分類》(WHO CNS5)[1]，成人彌漫性腦膠質(zhì)瘤主要分為：星形細胞瘤，IDH突變型；少突膠質(zhì)瘤，異檸檬酸脫氫酶(IDH)突變和1p/19q共缺失；膠質(zhì)母細胞瘤，IDH野生型。研究表明，最大程度的安全切除可以改善膠質(zhì)瘤病人術(shù)后癥狀、生活質(zhì)量、無進展生存期(PFS)和總生存期(OS)[2-3]。目前，術(shù)中的主要干預技術(shù)一方面是針對腫瘤組織邊界的研究，力求探明腫瘤組織浸潤邊界，以期做到腫瘤的全切，如術(shù)中導航、術(shù)中磁共振、術(shù)中熒光顯影、術(shù)中超聲等；另一方面是對腦功能區(qū)識別的研究，以避免術(shù)中對腦功能區(qū)的損傷，做到安全切除腫瘤，如神經(jīng)電生理刺激、術(shù)中喚醒等。這些技術(shù)的單獨應(yīng)用或組合使用可提高膠質(zhì)瘤病人的PFS和OS[4]。分子病理在腦膠質(zhì)瘤診療中的地位愈發(fā)重要。研究發(fā)現(xiàn)，手術(shù)切除程度對不同分子亞型的腦膠質(zhì)瘤病人的預后影響并不相同。腦膠質(zhì)瘤分子病理術(shù)中快速檢測技術(shù)逐漸成熟，既往有多項研究對此進行了相關(guān)探索。本文重點探討手術(shù)切除程度對不同分子亞型成人彌漫性腦膠質(zhì)瘤預后的影響，總結(jié)腦膠質(zhì)瘤術(shù)中快速分子病理檢測的研究進展。

腦膠質(zhì)瘤分子病理對手術(shù)的指導意義

腦膠質(zhì)瘤的彌漫性生長意味著外科醫(yī)生很難完全切除腫瘤，膠質(zhì)瘤的切除范圍(extent of resection，EOR)也一直是神經(jīng)外科領(lǐng)域的研究熱點。Smith等[5]研究低級別膠質(zhì)瘤的EOR時發(fā)現(xiàn)，EOR大于90%的病人會有相對較好的5年OS(97%)、5年P(guān)FS(75%)、8年OS(91%)和8年P(guān)FS(43%)。他們還發(fā)現(xiàn)，當EOR閾值在80%以上時，低級別膠質(zhì)瘤病人的OS會隨著EOR的提升而提高。在精準醫(yī)療時代，針對不同分子亞型的腦膠質(zhì)瘤病人進行個體化治療是未來的趨勢。WHO CNS5對不同分子亞型(如IDH突變、1p/19q共缺失、TERT啟動子突變等)給出了比較明確的診斷分類，不同診斷分類的膠質(zhì)瘤對應(yīng)不同的術(shù)后輔助治療策略及預后預期，而其對膠質(zhì)瘤手術(shù)的指導尚不明確。神經(jīng)外科醫(yī)生在術(shù)中實時了解腫瘤的分子病理，及時調(diào)整手術(shù)策略，并在最大化腫瘤切除與最小化功能損傷之間取得平衡。研究發(fā)現(xiàn)，膠質(zhì)瘤病人IDH突變率為46%，TERT啟動子的突變率為45%，包含IDH和(或)TERT的突變率達到了91%[6]。我們以IDH和TERT突變狀態(tài)為線索，結(jié)合WHO CNS5，對不同分子亞型病人預后與手術(shù)切除程度的相關(guān)性進行總結(jié)。

一、IDH突變型(IDHmut)+TERT突變型(TERTmut)

有研究發(fā)現(xiàn)，成人膠質(zhì)瘤中IDH和TERT的雙突變幾乎與1p/19q共缺失是一致的[7]，我們認為，IDHmut+TERTmut的分子分型是少突細胞膠質(zhì)瘤。

Hou等[8]利用中國膠質(zhì)瘤基因組圖譜數(shù)據(jù)庫(Chinese Glioma Genome Atlas database,CCGA)對449例膠質(zhì)瘤病人的臨床及病理信息分析發(fā)現(xiàn)，對于KPS>80，年齡>45歲的少突細胞膠質(zhì)瘤病人，與次全切(subtotal resection,STR)相比，腫瘤的完全切除(gross total resection,GTR)不能使病人更加受益。也就是說，對于該分子分型的膠質(zhì)瘤在手術(shù)切除時不必太過激進，少許殘留不會影響病人預后。這可能是由于少突膠質(zhì)細胞瘤呈惰性生長，且對常規(guī)術(shù)后輔助治療(放療及替莫唑胺化療)較為敏感，即使不能完全切除腫瘤，病人仍可存活較長時間。該團隊還提出對于這些腫瘤應(yīng)該進行“有效的安全切除”，即在保留功能的前提下最大化切除腫瘤。Delevl等[9]研究發(fā)現(xiàn)，少突膠質(zhì)細胞瘤的腫瘤是否完全切除(GRT)對病人的總體生存影響不大。因此，結(jié)合Berger教授對低級別膠質(zhì)瘤的研究，對于分子分型為IDHmut+TERTmut的膠質(zhì)瘤，可在保留功能前提下有效切除(EOR>80%)。

二、IDH突變型(IDHmut)+TERT野生型(TERTwt)

依據(jù)最新的膠質(zhì)瘤分類指南WHO CNS5，IDHmut膠質(zhì)瘤應(yīng)診斷為：星形細胞瘤，IDH突變型，組織學等級分為2～4級，其中以低級別膠質(zhì)瘤為主。低級別星形細胞瘤是一種生長相對緩慢的浸潤性腦腫瘤，指南推薦低級別膠質(zhì)瘤的影像學切除邊界則為T2WI/FLAIR的高信號區(qū)域[10]。Wijnenga等[11]研究發(fā)現(xiàn)，對于低級別IDHmut星形細胞瘤(WHO 2級)，任何術(shù)后殘留都會影響生存預后，甚至需要在確保安全的情況下進行二次手術(shù)，切除殘余腫瘤，以達到GTR的目的。Hou等[8]研究指出，對于低級別星形細胞瘤(IDHmut)，提升EOR可改善病人的預后。另外，對于2021版指南中高級別IDHmut星形細胞瘤(WHO 3～4級)，即2016版《WHO中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤分類標準》(2016 CNS WHO)分類中IDH突變的間變星形細胞瘤和膠質(zhì)母細胞瘤，并不是所有腫瘤在術(shù)前影像上都有T1WI增強序列的強化灶，關(guān)于切除范圍的研究較少。Beiko等[12]發(fā)現(xiàn)，對有強化灶的病人進行影像學邊界(強化灶)切除，可改善生存預后，而強化灶以外的切除尚有爭議。對于無強化灶的病人，切除范圍對預后的影響需要進一步研究?？傮w而言，這部分病人應(yīng)盡可能做到影像學邊界全切。

三、IDH野生型(IDHwt)+TERT突變型(TERTmut)

依據(jù)最新的膠質(zhì)瘤分類指南WHO CNS5，該類型突變應(yīng)診斷為膠質(zhì)母細胞瘤，IDH野生型，WHO 4級，預后較差。目前，高級別膠質(zhì)瘤手術(shù)切除的共識是：按照其影像學邊界，即磁共振T1WI的增強區(qū)進行切除[13]。膠質(zhì)母細胞瘤具有很強的浸潤性，腫瘤細胞常出現(xiàn)在增強區(qū)域之外的瘤周區(qū)，即T2WI/FLAIR的高信號區(qū)(非增強區(qū))。2020年發(fā)表在JAMA Oncology上一項多中心回顧性研究提出，對于膠質(zhì)母細胞瘤，同時切除高級別膠質(zhì)瘤的增強區(qū)和非增強區(qū)可明顯改善年齡<65歲病人的預后，對于65歲以上的病人，擴大切除非增強區(qū)可能獲益不明顯[14]。相比于影像學邊界的GTR，擴大切除非增強區(qū)可明顯提高膠質(zhì)母細胞瘤病人生存時間。目前的觀點基本支持對非增強進行擴大切除，但對于應(yīng)達到怎樣的切除閾值對病人預后獲益最顯著仍有爭議。對于少部分IDHwt+TERTmut分子分型的膠質(zhì)瘤，組織病理表現(xiàn)為較低級別膠質(zhì)瘤，影像學上并無T1WI增強區(qū)，有關(guān)手術(shù)切除范圍的研究較少。我們團隊的一項回顧性研究發(fā)現(xiàn)，對于此類型的膠質(zhì)瘤，基于T2WI/FLAIR高信號區(qū)的最大化安全切除可使病人明顯受益[15]。

四、IDH野生型(IDHwt)+TERT野生型(TERTwt)

對于分子分型為IDHwt+TERTwt的膠質(zhì)瘤，如果其組織病理為高級別膠質(zhì)瘤(合并微血管增生/壞死等惡性特征)，則可診斷為膠質(zhì)母細胞瘤(符合2016 CNS WHO分類標準和WHO CNS5分類標準)或兒童彌漫性高級別膠質(zhì)瘤(主要分子特征為組蛋白H3改變，包括H3 K27改變及H3 G34突變，以及其他分子改變)。膠質(zhì)母細胞瘤手術(shù)切除范圍的研究如前文所述，建議進行增強區(qū)+T2/FLAIR高信號區(qū)(非增強區(qū))切除的手術(shù)策略。而兒童彌漫性高級別膠質(zhì)瘤多數(shù)侵犯功能區(qū)或中線部位，手術(shù)完全切除難度大，研究發(fā)現(xiàn)，只有對腫瘤的GTR才會有明顯的生存獲益[16]，而STR與活檢相比則無明顯的生存差異。這就要求在術(shù)前對腫瘤類型及切除程度有所判斷，或者通過活檢取樣，對相關(guān)分子指標進行術(shù)中檢測，術(shù)中明確其病理診斷，再決定是否進行GTR或手術(shù)以外其他輔助治療。因此，對于兒童高級別膠質(zhì)瘤的相關(guān)手術(shù)策略研究，可能還需要更為可靠的術(shù)中分子檢測技術(shù)的支持。

IDHwt+TERTwt分子分型中組織病理為低級別的膠質(zhì)瘤，準確的分子病理診斷需要結(jié)合相關(guān)分子的測序結(jié)果，其中少數(shù)具有特定分子特征：TERT啟動子突變(TERTmut，該分子分型前文已闡述)、EGFR 基因擴增或7號染色體擴增/10號染色體缺失三者之一，納入膠質(zhì)母細胞瘤的診斷，暫無與EOR相關(guān)的詳細分子分層研究，可依據(jù)指南進行T2/FLAIR高信號區(qū)(影像學邊界)切除的手術(shù)策略。其余主要考慮診斷為兒童彌漫性低級別膠質(zhì)瘤，包括彌漫性星形細胞瘤，伴MYB/MYBL1改變、血管中心型膠質(zhì)瘤及彌漫性低級別膠質(zhì)瘤，伴MAPK信號通路改變等。對所有IDHwt的低級別膠質(zhì)瘤的研究發(fā)現(xiàn)，提升T2WI/FLAIR高信號區(qū)(影像學邊界)的切除率可改善生存預后[15,17]。在后續(xù)的研究中我們會更多關(guān)注不同分子分型與手術(shù)切除范圍對病人預后獲益的影響。另外，局限性星形細胞瘤的分子分型也為IDHwt+TERTwt，包括毛細胞型星形細胞瘤、多形性黃色細胞瘤等，影像學可表現(xiàn)為強化灶，如果術(shù)中檢測出它們具有的特定分子特征(如BRAF、NF1、ATRX等突變)，可幫助明確診斷，進行影像學邊界切除即可達到很好的治療效果[18]。

腦膠質(zhì)瘤術(shù)中快速分子病理檢測的研究進展

WHO CNS5對腦脊髓腫瘤分類進行了第六次修訂，引入了更加豐富的分子分型，以及更加完善的與組織學類型相結(jié)合的整合病理診斷與分級。臨床常見的膠質(zhì)瘤病理類型有：星形細胞瘤，IDH突變型(IDH1，IDH2，ATRX，TP53，CDKN2A/B)；少突膠質(zhì)瘤，IDH突變+1p/19q共缺失(IDH1，IDH2，1p/19q，TERT，CIC，F(xiàn)UBP1，NOTCH1)；膠質(zhì)母細胞瘤，IDH野生型(IDH野生型，TERT，7/10染色體改變，EGFR)等。不同分型意味著不同的治療策略和預后，所以提供實時的分子突變信息，將允許外科醫(yī)生根據(jù)每個病人的基因圖譜調(diào)整手術(shù)策略。在大多數(shù)神經(jīng)病理學實驗室中，1p/19q共缺失是通過熒光原位雜交(FISH)檢測，IDH突變(IDH1 R132H)則通過免疫組化(IHC)方法進行檢測。其他更詳細和精確的分子突變信息將會根據(jù)病人需求進一步進行基因測序分析。然而，基于下一代測序技術(shù)(NGS)的基因檢測不僅價格較高，而且檢測周期較長(5～14天)，無法應(yīng)用于術(shù)中檢測。隨著神經(jīng)外科的發(fā)展，人工智能的融合，研究人員開發(fā)了基于MRI的影像組學技術(shù)，可用于術(shù)前無創(chuàng)預測IDH突變狀態(tài)。然而大部分影像組學模型尚缺乏外部驗證集，不能很好解釋模型構(gòu)建原理，影響了臨床的應(yīng)用和轉(zhuǎn)化。與此同時，科學家們也在嘗試對組織標本的術(shù)中檢測技術(shù)。下文總結(jié)了近年來膠質(zhì)瘤術(shù)中分子檢測技術(shù)的研究進展。

一、直接分子檢測技術(shù)

基因測序技術(shù)正在快速發(fā)展，分子檢測已經(jīng)從選擇性使用標準PCR發(fā)展到常規(guī)使用實時定量PCR(Real Time-PCR)，再到最近的下一代測序或高通量測序。在整個演變過程中，桑格(Sanger)DNA測序一直是測定核酸序列的金標準，但每次反應(yīng)只能檢測少量的序列，且對檢測標本要求較高(目標序列含量不少于20%)。NGS則可在大規(guī)模并行高通量測序時單次進行數(shù)百萬到數(shù)十億個的測序反應(yīng)，明顯縮短了檢測時間和成本，增加了輸出的序列，對科學研究和臨床實踐有重要意義。然而這些技術(shù)仍然耗時較長，操作復雜，只能用于對術(shù)后標本的檢測。我們在臨床實踐中，主要是想通過術(shù)中檢測獲取少數(shù)已知關(guān)鍵分子的突變狀態(tài)(如IDH、TERT等)。為此，科學家開發(fā)了一系列點突變檢測的技術(shù)，使術(shù)中分子檢測成為可能。

1.IDH1和IDH2的突變主要為4號外顯子132密碼子和172密碼子的改變。有多種方法可檢測這些突變，包括焦磷酸測序、免疫組化、低溫變性共擴增PCR(CO-amplification at Lower Denaturation temperature PCR， COLD-PCR)等。單個核苷酸位點的突變會使雙鏈DNA溶解的溫度發(fā)生改變，COLD-PCR利用這一特征[19]，在PCR過程中通過精確控制溫度，使突變頻率很低的目的片段呈指數(shù)級擴增?？茖W家對COLD-PCR繼續(xù)優(yōu)化，將擴增產(chǎn)物進行熒光溶解曲線分析(FMCA)，實現(xiàn)了快速、靈敏、特異的術(shù)中檢測IDH1和IDH2突變。該技術(shù)靈敏度高特異性好，即使突變頻率低至2.5%也能準確進行檢測，從取下標本到得出突變結(jié)果僅耗時約60分鐘，結(jié)果準確可靠。該技術(shù)的難點在于對不同突變片段臨界溫度的確定，暫且只能進行IDH1和IDH2的突變檢測，大規(guī)模的臨床應(yīng)用也尚缺乏可靠的前瞻性研究證據(jù)。

2.實驗室常用的DNA提取步驟一般都需要裂解、反復多次離心和洗滌，操作比較耗時費力。科學家建立了一種簡單的DNA提取方法[20]，僅需將少許膠質(zhì)瘤標本用Tris-EDTA緩沖液在95 ℃條件下孵育5分鐘，收集上清即可。作者進一步整合已開發(fā)的IDH熒光探針(all-in-one)，進行了后續(xù)的測序檢測，整體流程需要90～100分鐘，在保證檢測結(jié)果準確性的同時大大提升了檢測效率，可用于術(shù)中的分子檢測。該技術(shù)可檢測腫瘤細胞含量高于10%的組織，目前只能檢測IDH突變狀態(tài)，其他分子指標有待進一步開發(fā)。

3.擴增阻滯突變系統(tǒng)(Amplification Refractory Mutation System-PCR，ARMS-PCR)是基于PCR技術(shù)建立的用于檢測已知點突變的方法[21]。其原理是在PCR過程中引入2條引物，使其3'端堿基分別與突變和野生型模板堿基互補，隨著DNA鏈的延申就可以將突變狀態(tài)檢測出來。但在實際過程中單個錯配堿基有時也可以進行DNA鏈的延伸，造成假陽性。Timucin等提出了包含3個錯配堿基的系統(tǒng)(3m-ARMS)，即在野生型引物3'端加入3個錯配堿基，明顯減弱非特異性延伸，總耗時1個小時，操作方便，非常適合術(shù)中使用。該技術(shù)對于引物設(shè)計要求較高，目前只能進行IDH1/2的檢測。

4.鎖核酸(Locked Nucleic Acid，LNA)是一種特殊的核酸衍生物，可與相應(yīng)DNA單鏈片段互補結(jié)合形成雜交體。相比與普通雙鏈DNA，雜交體具有更高的溶解溫度(Tm)?；谠撛?，閻海教授團隊將LNA技術(shù)用于分子檢測的qPCR中開發(fā)了GliomaDx技術(shù)[22]，可明顯增強突變位點與引物的特異性結(jié)合，促進突變片段的指數(shù)擴增，從而提高了目的基因的檢測效率。GliomaDx技術(shù)的敏感性是Sanger測序的200多倍(最低可檢測密度為0.2%)，可識別出其他技術(shù)可能漏診的病例，并且可在1個小時內(nèi)完成對組織樣本IDH及TERT突變狀態(tài)的檢測。該技術(shù)操作簡單，如果能夠擴大檢測范圍，將可以提升術(shù)中分子檢測的實用性。

二、其他檢測技術(shù)

分子病理的重要性日益凸顯，科學家們提出了對術(shù)中分子分型的渴求，也一直在研發(fā)不同的檢測新技術(shù)。IDH狀態(tài)是膠質(zhì)瘤分型和預后的重要指標，IDH突變后可形成2-羥基戊二酸(2-HG)的堆積，有學者建立了一系列檢測2-HG的方法，可間接反應(yīng)IDH的突變狀態(tài)。質(zhì)譜分析是一種測量物質(zhì)質(zhì)荷比的方法，已被廣泛用于醫(yī)療領(lǐng)域。近幾年來有許多經(jīng)研究聚焦于質(zhì)譜技術(shù)實現(xiàn)術(shù)中對2-HG的快速檢測[23]，比如高效液相色譜-電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜法(Liquid Chromatography/Electrospray Ionization tandem Mass Spectrometry,LC/ESI-MS/MS)、解吸電噴霧電離質(zhì)譜(Desorption Electrospray Ionization-Mass Spectrometry,DESI-MS)、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(Gas Chromatography Mass Spectrometry，GC-MS)[24-26]等，這些技術(shù)不僅可以間接判斷IDH狀態(tài)，還可以評估腫瘤細胞百分比，時效性和準確性都很好，但目前僅能作為一種輔助技術(shù)，也許未來隨著技術(shù)的發(fā)展可以大規(guī)模應(yīng)用于臨床，整合入膠質(zhì)瘤治療管理，術(shù)中評估多種分子突變狀態(tài)，甚至可用來評估腫瘤邊界。

其他可快速檢測分子突變狀態(tài)的技術(shù)還包括拉曼光譜、快速免疫組化、微流控技術(shù)等。術(shù)中分子檢測相比常規(guī)術(shù)后的分子檢測要求較高，必須具備高靈敏度、高特異度、高時效性，且操作流程簡捷。目前大部分的檢測技術(shù)還需更新迭代，不斷發(fā)展，轉(zhuǎn)化成臨床實踐成果。各類技術(shù)的優(yōu)缺點詳見表1。

表1 各項快速分子檢測技術(shù)的優(yōu)缺點

腦膠質(zhì)瘤分子病理已成為是腦膠質(zhì)瘤診療中的必不可少的一環(huán)，隨著研究的進展，我們發(fā)現(xiàn)分子病理不僅可以用于腦膠質(zhì)瘤的整合診斷、預后預測、治療指導，還影響病人手術(shù)切除所帶來的預后獲益。術(shù)中快速分子病理檢測是實現(xiàn)分子病理指導腦膠質(zhì)瘤手術(shù)切除的關(guān)鍵。當下高新技術(shù)迅速發(fā)展，測序技術(shù)、影像技術(shù)、物理化學技術(shù)、免疫技術(shù)、人工智能技術(shù)等逐漸融入各個領(lǐng)域，術(shù)前及術(shù)中分子病理檢測也逐漸成為可能。隨著相關(guān)研究對術(shù)中分子病理檢測技術(shù)的優(yōu)化與整合(圖1)，術(shù)中分子病理檢測可通過準確的分子分型指導膠質(zhì)瘤手術(shù)策略，推進腦膠質(zhì)瘤的精準治療。

圖1 腦膠質(zhì)瘤分子分型指導手術(shù)切除的示意圖