苦參堿對(duì)腫瘤壞死因子-α誘導(dǎo)膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎大鼠成纖維樣滑膜細(xì)胞PI3K/AKT信號(hào)傳導(dǎo)通路的影響

劉瓊 丁超華 白菊芳 關(guān)金花 孫娜娜 呂楊 張樂(lè) 王鳳春 楊永生

【摘 要】目的：探討苦參堿對(duì)腫瘤壞死因子-α（TNF-α）誘導(dǎo)膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎（CIA）大鼠成纖維樣滑膜細(xì)胞（FLS）中磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（PKB/AKT）信號(hào)傳導(dǎo)通路相關(guān)蛋白及基因表達(dá)的影響。方法：按照隨機(jī)數(shù)字表法將40只SD大鼠分為正常對(duì)照組、炎癥細(xì)胞組、苦參堿組、抑制劑組，每組10只。除正常對(duì)照組外，其余各組通過(guò)牛Ⅱ型膠原與不完全弗氏佐劑建立CIA大鼠模型。斷椎法處死大鼠，剝離大鼠滑膜組織，提取FLS，并進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)、鑒定。正常對(duì)照組不加任何藥物干預(yù)，炎癥細(xì)胞組僅予TNF-α干預(yù)，苦參堿組予TNF-α及苦參堿干預(yù)，抑制劑組予TNF-α及LY294002干預(yù)。Western Blot測(cè)定各組CIA大鼠FLS中p-PI3K、p-AKT、AKT蛋白的表達(dá)程度，RT-PCR測(cè)定PI3K mRNA、AKT mRNA的表達(dá)程度。結(jié)果：與正常對(duì)照組比較，其余各組CIA大鼠FLS數(shù)量明顯增多;免疫熒光測(cè)定顯示絕大多數(shù)細(xì)胞染色呈陽(yáng)性表達(dá)。與炎癥細(xì)胞組比較，苦參堿組、抑制劑組p-PI3K、p-AKT蛋白表達(dá)程度下降（P < 0.01或P < 0.05），PI3K mRNA、AKT mRNA表達(dá)程度受到明顯抑制（P < 0.01）;各組間非活化AKT蛋白表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。結(jié)論：苦參堿對(duì)CIA大鼠FLS中PI3K/AKT信號(hào)傳導(dǎo)通路的過(guò)度活化具有抑制作用。

【關(guān)鍵詞】 類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎;苦參堿;PI3K/AKT信號(hào)傳導(dǎo)通路;成纖維樣滑膜細(xì)胞;膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎

Effect of Matrine on PI3K/AKT Signaling Pathway of Fibroblast Like Synovial Cells of TNF-α Induced CIA Rats

LIU Qiong，DING Chao-hua，BAI Ju-fang，GUAN Jin-hua，SUN Na-na，LYU Yang，ZHANG Le，WANG Feng-chun，YANG Yong-sheng

【ABSTRACT】 Objective：To investigate the effect of matrine on PI3K/AKT signaling pathway of fibroblast like synovial cells of TNF-α induced CIA rats.Methods：According to the random number table，

40 SD rats were divided into a normal control group，an inflammatory cell group，a matrine group and an inhibitor group，with 10 rats in each group.Except the normal control group，the CIA rat models were established in the other groups by bovine typeⅡcollagen and incomplete Freund's adjuvant.The rats were killed by breaking push method，and the synovial tissue of the rats was stripped.FLS was extracted，and the cells were cultured and identified.The normal control group did not receive any drug intervention，the inflammatory cell group only received TNF-α intervention，the matrine group was given TNF-α and matrine intervention，and the inhibitor group was given TNF-α and LY294002 intervention.The expressions of p-PI3K，p-AKT and AKT proteins in FLS of CIA rats in each group were determined by Western Blot.The expressions of PI3K mRNA and AKT mRNA were determined by RT-PCR.Results：Compared with the normal control group，the number of FLS of CIA rats in other groups increased significantly.Immunofluorescence assay showed that most of the cells were positive.Compared with the inflammatory cell group，the expressions of p-PI3K and p-AKT protein in the matrine group and the inhibitor group decreased（P < 0.01 or P < 0.05），and the expressions of PI3K mRNA and AKT mRNA were significantly inhibited（P < 0.01）.There was no significant difference in the expression of non activated AKT protein among the groups（P > 0.05）.Conclusion：Matrine can inhibit the over activation of PI3K/AKT signaling pathway in FLS of CIA rats.

【Keywords】 rheumatoid arthritis;matrine;PI3K/AKT signaling pathway;fibroblast like synovial cells;

collagen induced arthritis

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種慢性、炎癥性自身免疫性疾病，以進(jìn)行性骨、軟骨及關(guān)節(jié)破壞為特征[1]。研究發(fā)現(xiàn)，磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（PKB/AKT）信號(hào)傳導(dǎo)通路不僅參與成纖維樣滑膜細(xì)胞（FLS）異常增殖和滑膜炎癥，而且對(duì)破骨細(xì)胞的分化和生成也有影響[2]。膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎（CIA）大鼠是研究RA的經(jīng)典模型，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立CIA大鼠模型以模擬人類RA活動(dòng)期，研究苦參堿對(duì)CIA大鼠FLS中PI3K/AKT信號(hào)傳導(dǎo)通路的影響。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)雄性SD大鼠40只，4～5周齡，均來(lái)自內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（京）2018-0010，動(dòng)物使用許可證號(hào)SYXK（內(nèi)）2016-0015。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)符合內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)標(biāo)準(zhǔn)。

1.2 藥品與試劑 苦參堿（上海源葉生物技術(shù)公司，批號(hào)B20679），根據(jù)前期研究[3]，選取苦參堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.75 mg·mL-1;LY294002（美國(guó)MCE公司，批號(hào)HY-10108），根據(jù)文獻(xiàn)[4]，選取體積分?jǐn)?shù)20 μmol·L-1為本實(shí)驗(yàn)的觀察濃度。牛Ⅱ型膠原（CⅡ）（美國(guó)Chondrex公司，批號(hào)110M7002V）;不完全弗氏佐劑（美國(guó)SIGMA公司，批號(hào)SLBG5293V）;抗PI3K抗體（Affinity公司，批號(hào)AF3241）;抗AKT抗體（Affinity公司，批號(hào)AF4718）;磷酸化AKT抗體（Affinity公司，批號(hào)AF3261）;GAPDH（Proteintech公司，批號(hào)60004-1-LG）;Real-time PCR試劑盒（全式金公司，批號(hào)AQ131-01）。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 電泳儀（中國(guó)Tanon公司，EPS300）;4 ℃離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf公司，Centrifuge 5415R）;全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光分析儀（中國(guó)Tanon公司，4600）;PCR儀（德國(guó)Eppendorf公司，5333，53658）;實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（德國(guó)Eppendorf公司，ABI 7500）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 模型制備 所有大鼠正常飼養(yǎng)1周以適應(yīng)環(huán)境，采用隨機(jī)數(shù)字表法分為正常對(duì)照組、炎癥細(xì)胞組、苦參堿組、抑制劑組，每組10只。參照文獻(xiàn)[5]中方法，取牛Ⅱ型膠原20 mg在無(wú)菌條件下溶解于0.1 mol·L-1醋酸10 mL中，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為

2 mg·mL-1，在4 ℃下攪拌過(guò)夜;次日將其與不完全弗氏佐劑等體積混合，在冰塊上連續(xù)攪拌至完全融合并乳化。將其作為誘導(dǎo)劑，以滴入水中不擴(kuò)散為度。除正常對(duì)照組外，對(duì)炎癥細(xì)胞組、苦參堿組、抑制劑組大鼠進(jìn)行初次免疫。于尾根部1 cm處多點(diǎn)肌內(nèi)注射，每只注射誘導(dǎo)劑劑量為0.3 mL，注射當(dāng)天記為第1天。在第7天重復(fù)上述步驟同部位進(jìn)行二次免疫以激發(fā)炎癥，誘導(dǎo)劑配制及注射劑量同第1次。二次免疫中正常對(duì)照組大鼠于同時(shí)同處注射同體積生理鹽水，大鼠自由進(jìn)食、飲水。

二次免疫后對(duì)關(guān)節(jié)腫脹程度進(jìn)行評(píng)分，依據(jù)大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)（AI）評(píng)分≥4分，認(rèn)定模型達(dá)到實(shí)驗(yàn)使用標(biāo)準(zhǔn)。

按照文獻(xiàn)[6]進(jìn)行AI評(píng)分：0分，關(guān)節(jié)無(wú)腫脹;1分，個(gè)別足趾輕度腫脹;2分，小腳趾關(guān)節(jié)及足趾關(guān)節(jié)腫脹;3分，膝關(guān)節(jié)以下關(guān)節(jié)部分腫脹;4分，膝關(guān)節(jié)及足部全部腫脹。計(jì)算出AI（AI = 關(guān)節(jié)腫脹分?jǐn)?shù)之和，最低為1分，最高為16分），評(píng)分與關(guān)節(jié)腫脹程度呈正相關(guān)，AI值 > 4分，認(rèn)定造模成功。

2.2 大鼠FLS分離、培養(yǎng)及鑒定 二次免疫6周后，經(jīng)鑒定模型達(dá)到實(shí)驗(yàn)使用標(biāo)準(zhǔn)，以斷椎法處死大鼠，無(wú)菌環(huán)境下剝離膝關(guān)節(jié)滑膜組織，膠原酶消化法培養(yǎng)FLS，以質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%的多聚甲醛進(jìn)行固定、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%的triton溶液進(jìn)行通透、體積分?jǐn)?shù)為10%山羊血清進(jìn)行封閉，滴加一抗稀釋液Vimentin antibody（1∶1000）;過(guò)夜后，滴加二抗稀釋液山羊抗雞IgY H&L（1∶200）;再次過(guò)夜后，DAPI染核，免疫熒光染色鑒定、拍照。

2.3 細(xì)胞分組及藥物干預(yù) 經(jīng)形態(tài)和免疫熒光鑒定后，F(xiàn)LS選取3～5代，分組及藥物干預(yù)條件如下：正常對(duì)照組不加任何藥物及試劑干預(yù)，炎癥細(xì)胞組僅腫瘤壞死因子-α（TNF-α）干預(yù)，苦參堿組TNF-α加0.75 mg·mL-1苦參堿干預(yù)，抑制劑組TNF-α加20 μmol·L-1 LY294002干預(yù)。

2.4 Western Blot測(cè)定各組大鼠FLS中p-PI3K、p-AKT、AKT蛋白表達(dá) 將配制好的裂解液加入到各組細(xì)胞中裂解完畢后離心，按照BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒說(shuō)明測(cè)定蛋白濃度然后進(jìn)行電泳，轉(zhuǎn)膜至PVDF膜;用含質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的脫脂奶粉的TBST（封閉液）封閉，TBST洗膜3次，滴加相應(yīng)一抗稀釋（GAPDH為1∶5000、p-AKT為1∶100、p-PI3K為1∶100、AKT為1∶200），TBST充分洗滌PVDF膜3～4次洗去多余一抗;用封閉液稀釋HRP標(biāo)記二抗（1∶1000稀釋），37 ℃搖床孵育2 h;TBST洗去多余二抗，放入全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光分析儀中曝光，拍照并分析其灰度值。

2.5 RT-PCR測(cè)定各組大鼠FLS中PI3K mRNA、AKT mRNA表達(dá) 按照商品說(shuō)明書(shū)，用TRIzol方法提取總RNA。在隨機(jī)引物和無(wú)酶雙蒸水條件下，用第一鏈cDNA合成試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄，GAPDH作為內(nèi)參對(duì)照，見(jiàn)表1。對(duì)PCR進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增條件：首先95 ℃下預(yù)變性、變性，時(shí)間分別為3 min、30 s;然后55 ℃下退火，最后72 ℃下延伸;退火與延伸時(shí)間均為20 s，總計(jì)40個(gè)循環(huán)。qRT-PCR系統(tǒng)分析PCR產(chǎn)物，使用2-ΔΔCT方法計(jì)算mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。全部實(shí)驗(yàn)進(jìn)行3次獨(dú)立重復(fù)，計(jì)量資料以表示，結(jié)果采用單因素方差（ANOVA）分析，方差不齊采用Games-Howell法檢驗(yàn)，2組間比較采用LSD分析。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié) 果

3.1 FLS的培養(yǎng) 傳代至第3代時(shí)，倒置顯微鏡下觀察各組細(xì)胞，可見(jiàn)炎癥細(xì)胞組、苦參堿組、抑制劑組與正常對(duì)照組比較，細(xì)胞數(shù)量明顯增多，排列密集、形態(tài)均一、呈橢圓形。見(jiàn)圖1。

3.2 FLS的鑒定 Vimentin是FLS特異性表達(dá)蛋白，通過(guò)免疫熒光測(cè)定CIA大鼠膝關(guān)節(jié)FLS中Vimentin表達(dá)情況，以確保所提取的細(xì)胞為FLS，結(jié)果顯示，絕大多數(shù)細(xì)胞染色為亮藍(lán)色，呈陽(yáng)性表達(dá)，提示FLS純度達(dá)到99%以上。見(jiàn)圖2。

3.3 苦參堿對(duì)各組大鼠FLS中p-PI3K、p-AKT、AKT蛋白表達(dá)的影響 藥物干預(yù)后，與正常對(duì)照組比較，炎癥細(xì)胞組p-PI3K、p-AKT蛋白表達(dá)程度明顯升高（P < 0.01）;與炎癥細(xì)胞組比較，苦參堿組及抑制劑組均可下調(diào)p-PI3K、p-AKT蛋白的表達(dá)程度（P < 0.01或P < 0.05）;各組間非活化AKT蛋白的表達(dá)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

（P > 0.05）。見(jiàn)圖3、表2。

3.4 苦參堿對(duì)各組大鼠FLS中PI3K mRNA、AKT mRNA表達(dá)的影響 藥物干預(yù)后，與正常對(duì)照組比較，炎癥細(xì)胞組PI3K mRNA、AKT mRNA表達(dá)程度明顯增強(qiáng)（P < 0.01）;與炎癥細(xì)胞組比較，苦參堿組、抑制劑組對(duì)PI3K mRNA、AKT mRNA表達(dá)程度抑制效果顯著（P < 0.01）;與抑制劑組比較，苦參堿組PI3K mRNA、AKT mRNA的表達(dá)程度下調(diào)（P < 0.01）。見(jiàn)表3。

4 討 論

目前，臨床上應(yīng)用于治療RA的藥物雖然能有效緩解患者的疼痛，抑制體內(nèi)炎癥反應(yīng)，但嚴(yán)重的肝腎毒性、心血管疾病等不良反應(yīng)限制了其臨床應(yīng)用。新興的藥物靶向治療在RA中發(fā)揮了重要作用，但由于易導(dǎo)致嚴(yán)重感染和過(guò)度激活免疫效應(yīng)，以及昂貴的價(jià)格，使這些藥物的使用受到限制[7]。傳統(tǒng)中藥具備不良反應(yīng)小、價(jià)格低、效果良好的優(yōu)勢(shì)，值得深入研究。

滑膜是一種覆蓋于關(guān)節(jié)囊內(nèi)表面的結(jié)締組織，具有潤(rùn)滑關(guān)節(jié)的作用，是RA發(fā)病的靶器官[8]。FLS是滑膜細(xì)胞的重要組成部分，在RA病理狀態(tài)下，F(xiàn)LS受到致炎因子刺激而過(guò)度激活，導(dǎo)致滑膜組織炎性增生[9]。RA的FLS呈現(xiàn)“腫瘤樣”特征，如凋亡減少、過(guò)度增殖和異常遷移，活化的FLS侵襲軟骨和骨，導(dǎo)致滑膜血管翳形成和關(guān)節(jié)破壞[10]。炎性細(xì)胞因子是RA發(fā)病的關(guān)鍵性影響因素[11]，常見(jiàn)炎性細(xì)胞因子如TNF-α和白細(xì)胞介素的分泌增加，與RA的進(jìn)展密切相關(guān)[12]。

RA的發(fā)病機(jī)制尚未明確，近年來(lái)發(fā)現(xiàn)與某些信號(hào)通路激活密切相關(guān)，激酶抑制劑作為RA治療的安全有效選擇受到越來(lái)越多的關(guān)注[2]。研究發(fā)現(xiàn)，在RA病理狀態(tài)下，F(xiàn)LS中PI3K/AKT信號(hào)傳導(dǎo)通路被過(guò)度激活[13]。高度活躍的PI3K/AKT信號(hào)傳導(dǎo)通路介導(dǎo)了RA-FLS的增殖、凋亡及炎癥反應(yīng)等過(guò)程[14]。研究發(fā)現(xiàn)，高、中、低度活動(dòng)期的RA患者滑膜細(xì)胞中PI3K mRNA、AKT mRNA表達(dá)程度同正常人相比升高較為明顯[15]，提示PI3K、AKT基因與RA發(fā)展關(guān)系重大。有文獻(xiàn)報(bào)道，

RA-FLS中的細(xì)胞因子具有啟動(dòng)PI3K/AKT信號(hào)傳導(dǎo)通路的能力，從而促進(jìn)滑膜細(xì)胞的遷移和侵襲;而且該文獻(xiàn)中實(shí)驗(yàn)還顯示，與對(duì)照組相比，經(jīng)TNF-α干預(yù)的RA滑膜細(xì)胞中PI3K和p-AKT表達(dá)水平顯著升高[16]。PI3K屬于脂類激酶家族，是調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)的關(guān)鍵因子，于RA滑膜細(xì)胞中高度活躍[17]，激活后的PI3K對(duì)RA-FLS的增殖和存活具有促進(jìn)作用[18]。AKT是一種蛋白激酶，具有調(diào)節(jié)細(xì)胞存活的作用，同時(shí)也是PI3K的下游關(guān)鍵靶蛋白?；罨蟮腁KT可磷酸化大量的下游底物從而引發(fā)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，調(diào)控細(xì)胞的存活、增殖、凋亡等[19]，AKT通路已被證實(shí)與RA患者關(guān)節(jié)腫脹及炎癥反應(yīng)關(guān)系密切[20]。研究發(fā)現(xiàn)，RA-FLS中磷酸化AKT水平高于骨關(guān)節(jié)炎，用TNF-α處理RA-FLS后，AKT磷酸化增強(qiáng)，細(xì)胞增殖能力被強(qiáng)化，提示活化的AKT參與了RA滑膜增生的病理、生理變化過(guò)程[21]。

苦參在中醫(yī)、蒙醫(yī)臨床應(yīng)用中占有重要地位，有清熱燥濕、利尿、殺蟲(chóng)等作用。蒙藥忠倫阿湯是蒙醫(yī)臨床治療RA常用方，苦參是忠倫阿湯的組成藥物之一?？鄥A是苦參的重要成分，有抗炎、抗菌、抗氧化、抑制腫瘤細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移及誘導(dǎo)其自噬、凋亡等作用[22];前期的研究證實(shí)了苦參堿對(duì)CIA大鼠腫脹的關(guān)節(jié)具有緩解作用，可通過(guò)抑制JAK/STAT信號(hào)傳導(dǎo)通路的活化誘導(dǎo)CIA大鼠FLS凋亡[3]。研究證實(shí)苦參堿有抑制人FLS生長(zhǎng)的作用[23]，可下調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶-3、TNF-α及白細(xì)胞介素-1β的表達(dá)水平，同時(shí)抑制核轉(zhuǎn)錄因子-κB p65的表達(dá)[24]，能明顯減輕RA大鼠模型的炎癥反應(yīng)和嚴(yán)重程度（足體積和關(guān)節(jié)指數(shù)評(píng)分）[25];通過(guò)抑制核轉(zhuǎn)錄因子-κB通路促炎細(xì)胞因子和蛋白的釋放，對(duì)CIA大鼠表現(xiàn)出抗炎作用[26]。

在本研究中，通過(guò)TNF-α對(duì)CIA大鼠FLS進(jìn)行刺激，模擬RA活動(dòng)期的狀態(tài)，結(jié)果顯示，CIA大鼠FLS經(jīng)過(guò)TNF-α干預(yù)后，炎癥細(xì)胞組p-PI3K、p-AKT蛋白及PI3K mRNA、AKT mRNA表達(dá)程度均得到顯著增強(qiáng)，提示PI3K/AKT信號(hào)傳導(dǎo)通路被過(guò)度激活。進(jìn)一步的藥物干預(yù)后發(fā)現(xiàn)，與炎癥細(xì)胞組比較，苦參堿組及抑制劑組p-PI3K、p-AKT蛋白表達(dá)程度均降低，而各組間非活化AKT蛋白表達(dá)無(wú)差異，苦參堿組及抑制劑組PI3K mRNA、AKT mRNA的表達(dá)均被明顯抑制，而且苦參堿的抑制效果優(yōu)于抑制劑LY294002。

綜上所述，本研究從體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)苦參堿對(duì)CIA-FLS中PI3K/AKT信號(hào)傳導(dǎo)通路的過(guò)度活化呈現(xiàn)出抑制作用，故而推測(cè)苦參堿可能通過(guò)抑制PI3K/AKT信號(hào)傳導(dǎo)通路的活化干預(yù)RA的發(fā)生、發(fā)展。

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收稿日期：2022-03-06;修回日期：2022-04-28