基于鐵調(diào)素調(diào)控鐵代謝相關(guān)蛋白探討腦泰方干預(yù)氧糖剝奪損傷的神經(jīng)元保護(hù)機(jī)制

王建君　余清平　郭丹　廖君　彭驊

〔摘要〕 目的 觀察大鼠原代神經(jīng)元氧糖剝奪損傷后，腦泰方通過(guò)調(diào)節(jié)二價(jià)金屬離子轉(zhuǎn)運(yùn)體1（divalent metal transporter 1，DMT1）、轉(zhuǎn)鐵蛋白受體（transferrin receptor， TfR）、鐵調(diào)素（hepcidin， Hep）及膜鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（ferroportin， FPN）表達(dá)變化，探討腦泰方對(duì)氧糖剝奪損傷神經(jīng)元保護(hù)機(jī)制。方法 將原代培養(yǎng)大鼠神經(jīng)元隨機(jī)分為對(duì)照（CG）組、氧糖剝奪模型（OGD）組、腦泰方干預(yù)氧糖剝奪模型（NTF）組。MTT法檢測(cè)各組神經(jīng)元細(xì)胞存活率;熒光探針檢測(cè)各組神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)二價(jià)鐵離子（Fe）、活性氧（reactive oxygen species， ROS）濃度;Western blot法檢測(cè)各組神經(jīng)元細(xì)胞Hep、DMT1、TfR、FPN蛋白表達(dá)。結(jié)果 與CG組比較，OGD組、NTF組神經(jīng)元細(xì)胞存活率均明顯降低（P<0.01）;與OGD組比較，NTF組神經(jīng)元細(xì)胞存活率明顯升高（P<0.01）。與CG組比較，OGD組、NTF組神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)Fe、ROS濃度均明顯升高（P<0.01）;與OGD組比較，NTF組神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)Fe、ROS濃度均顯著降低（P<0.01）。與CG組比較，OGD組、NTF組神經(jīng)元細(xì)胞Hep表達(dá)均明顯降低（P<0.01），DMT1、TfR、FPN表達(dá)均明顯升高（P<0.01）;與OGD組比較，NTF組神經(jīng)元細(xì)胞Hep表達(dá)明顯升高（P<0.01），DMT1、TfR、FPN表達(dá)均明顯降低（P<0.01，P<0.05）。結(jié)論 腦泰方通過(guò)促進(jìn)神經(jīng)元細(xì)胞Hep的表達(dá)，抑制神經(jīng)元細(xì)胞DMT1、TfR、FPN表達(dá)，減少氧糖剝奪損傷后神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)Fe及ROS聚積，起到保護(hù)神經(jīng)元，減輕氧糖剝奪損傷的作用。

〔關(guān)鍵詞〕 腦泰方;腦缺血;鐵調(diào)素;二價(jià)金屬離子轉(zhuǎn)運(yùn)體1;轉(zhuǎn)鐵蛋白受體;膜鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白;氧糖剝奪;神經(jīng)元

〔中圖分類號(hào)〕R255.2? ? ? ?〔文獻(xiàn)標(biāo)志碼〕A? ? ? ? 〔文章編號(hào)〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2022.04.005

Mechanism of Naotaifang intervention on oxygen-glucose deprivation injury of neurons based on hepcidin regulating iron metabolism related proteins

WANG Jianjun YU Qingping GUO Dan LIAO Jun PENG Hua

（1. Medical School of Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China;

2. Changsha Health Vocational College， Changsha， Hunan 410100， China）

〔Abstract〕 Objective To explore the protective mechanism of Naotaifang on neurons by observing the expression changes of divalent metal transporter 1 （DMT1）， transferrin receptor （TfR）， hecpidin （Hep） and membrane iron transporter ferroportin （FPN） after oxygen-glucose deprivation injury in primary neuronal. Methods The rat neurons were maturely cultured and then randomly divided into the control （CG） group， the oxygen-glucose deprivation model （OGD） group and Naotaifang interventing the oxygen-glucose deprivation （NTF） group. Cell viability was measured by MTT assay in each group. The intracellular concentration

of ferrous iron （Fe） and reactive oxygen species （ROS） in neurons of each group were detected by fluorescent probe. The expression of Hep， DMT1， TfR， FPN were analyzed by Western blot. Results Compared with the CG group， the survival rate of neurons in OGD group and NTF group was significantly lower （P<0.01）; compared with OGD group， the survival rate of neurons in NTF group was significantly higher （P<0.01）. Compared with CG group， the concentrations of Fe and ROS in neurons of OGD group and NTF group were significantly increased （P<0.01）; compared with OGD group， the concentrations of Feand ROS in neurons of NTF group were significantly decreased （P<0.01）. Compared with CG group， the expression levels of Hep in neurons of OGD group and NTF group were significantly decreased （P<0.01）， while the expression levels of DMT1， TfR and FPN were significantly increased （P<0.01）; compared with OGD group， the expression of Hep in neurons of NTF group was significantly increased （P<0.01）， while the expression levels of DMT1， TfR and FPN were significantly decreased （P<0.01， P<0.05）. Conclusion Naotaifang can protect neurons and reduce damage of oxygen-glucose deprivation injury by increasing the expression of Hep， inhibiting the expression of DMT1，TfR and FPN， reducing the accumulation of Fe and ROS in neurons after oxygen-glucose deprivation injury.

〔Keywords〕 Naotaifang; cerebral ischemia; hepcidin; divalent metal transporter 1; transferrin receptor; ferroportin; oxygen-glucose deprivation; neuron

缺血性腦卒中是人類三大死因之一，具有高發(fā)病率、高致殘率、高死亡率的特點(diǎn)，嚴(yán)重危害人類健康，加重社會(huì)負(fù)擔(dān)[1]。缺血性腦卒中損傷病理機(jī)制主要包括神經(jīng)炎癥、氧化應(yīng)激、興奮性氨基酸毒性、鈣離子超載等[2]。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)鐵代謝包括細(xì)胞內(nèi)外二價(jià)鐵離子（Fe）攝取、儲(chǔ)存與外排，而鐵代謝紊亂是腦缺血損傷的重要病理機(jī)制[3]。鐵是人體必需的微量元素，參與線粒體呼吸鏈的電子傳遞、神經(jīng)纖維髓鞘及神經(jīng)遞質(zhì)合成，對(duì)維持大腦正常生理功能起著至關(guān)重要的作用[4-5]。Fe也是一種催化劑，在缺氧狀況下，能顯著增加活性氧（reactive oxygen species， ROS）的濃度，導(dǎo)致脂質(zhì)過(guò)氧化和氧化應(yīng)激，最終引發(fā)線粒體功能紊亂、神經(jīng)元壞死[6-7]。因此，維持鐵穩(wěn)態(tài)是保證神經(jīng)元正常新陳代謝的重要因素。鐵調(diào)素（hepcidin， Hep）是肝細(xì)胞分泌產(chǎn)生的肽類物質(zhì)，由25個(gè)氨基酸長(zhǎng)鏈組成，是機(jī)體內(nèi)鐵代謝的關(guān)鍵調(diào)節(jié)分子[8-9]。Hep與膜鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（ferroportin，F(xiàn)PN）結(jié)合，誘導(dǎo)其內(nèi)化、降解，抑制細(xì)胞內(nèi)鐵的釋放，通過(guò)負(fù)反饋調(diào)節(jié)，Hep-FPN軸可維持全身鐵穩(wěn)態(tài)[10]。研究發(fā)現(xiàn)，Hep也可通過(guò)抑制神經(jīng)元鐵代謝相關(guān)蛋白二價(jià)金屬離子轉(zhuǎn)運(yùn)體1（divalent metal transporter 1， DMT1）、轉(zhuǎn)鐵蛋白受體（transferrin receptor， TfR）的表達(dá)，減少鐵聚積[11]。探索缺血性腦卒中后鐵代謝失調(diào)的病理機(jī)制，及通過(guò)干預(yù)Hep調(diào)節(jié)鐵穩(wěn)態(tài)研究，可提供腦缺血損傷防治的潛在治療靶點(diǎn)。缺血性腦卒中屬于中醫(yī)學(xué)“中風(fēng)”范疇，中醫(yī)藥防治缺血性腦卒中多采用“益氣活血，祛瘀通絡(luò)”的治則[12-13]。腦泰方是本課題組多年應(yīng)用于臨床治療缺血性腦卒中的有效方劑，具有益氣活血，祛瘀通絡(luò)的功效[14]。前期研究發(fā)現(xiàn)，腦泰方可通過(guò)干預(yù)脂質(zhì)代謝抑制鐵死亡，改善腦缺血后神經(jīng)元損傷[15-16]。因此，開(kāi)展腦缺血后Hep調(diào)節(jié)神經(jīng)元鐵代謝機(jī)制研究，為腦泰方臨床應(yīng)用提供重要實(shí)驗(yàn)依據(jù)，為中醫(yī)藥防治缺血性腦卒中機(jī)制的研究拓寬新的方向。

1 材料

1.1? 細(xì)胞及分組

大鼠原代神經(jīng)元細(xì)胞用加B27的Neurobasal基礎(chǔ)培養(yǎng)基，在37 ℃含5% CO的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，將神經(jīng)元細(xì)胞隨機(jī)分為對(duì)照（CG）組、氧糖剝奪模型（OGD）組、腦泰方干預(yù)氧糖剝奪模型（NTF）組。

1.2? 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)SD大鼠3只，體質(zhì)量250～280 g，8周齡，16～18 d孕鼠1只，1 d新生鼠10只，由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，合格證號(hào)：SYXK（湘）2019-0009。實(shí)驗(yàn)倫理審批號(hào)：LL20207160002，符合SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物標(biāo)準(zhǔn)。飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。

1.3? 藥物、主要試劑和儀器

腦泰方組成：黃芪40 g，地龍15 g，僵蠶15 g，川芎10 g，中藥飲片均購(gòu)自湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院（批號(hào)分別為CK21070602、2021031902、HH21051802、TH21063004）。

DMEM/F12培養(yǎng)基、FBS、青鏈霉素、胰酶、胎牛血清均購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司（批號(hào)分別為SH30023、SH30070、SV30010、SH30042、SH30070）;PBS（南京生興生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：SN331）;Neurobasal培養(yǎng)基、B27、Glutamine均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司（批號(hào)分別為21103049、17504044、25030081）;DMSO、Protease inhibitor cocktail均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司（批號(hào)分別為C6295、P8340）;MTT、HRP抗小鼠抗體、HRP抗兔抗體、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒均購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司（批號(hào)分別為C0009S、A0216、A0208、P0010）;ROS試劑盒（南京建成生物工程研究所有限公司，批號(hào)：E004-1-1）;30%聚丙烯酰胺、Tris-base、過(guò)硫酸銨、甘氨酸、SDS、Tween-20、蛋白marker、脫脂奶粉均購(gòu)自北京Solarbio科技有限公司（批號(hào)分別為A1010、T8060、A1030、G8200、S8010、T8220、PR1910、D8340）;PVDF膜（美國(guó)Millipore公司，批號(hào)：ISEQ00010）;ECL發(fā)光液（上海天能科技有限公司，批號(hào)：180-5001）;甲醇、鹽酸均購(gòu)自南京化學(xué)試劑股份有限公司（批號(hào)分別為C0690110281、C0680110228）;TEMED（美國(guó)Alladin公司，批號(hào)：T105496）;DMT1（美國(guó)Proteintech公司，批號(hào)：20507-1-AP）;TfR、FPN、Hep均購(gòu)自美國(guó)Abcam公司（批號(hào)分別為ab269513、ab235166、ab30760）;GAPDH（美國(guó)Abbkine公司，批號(hào)：A01020）。

CO培養(yǎng)箱、酶標(biāo)儀均購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司（型號(hào)分別為3131、Multiskan 51119000）、MetalloFluor FeRhonox-1 Fe（Ⅱ）活細(xì)胞成像探針（日本Goryo Chemical公司，型號(hào)：GC901）;熒光顯微鏡（日本Nikon儀器有限公司，型號(hào)：Ts2R）;離心機(jī)（常州金壇區(qū)西城新瑞儀器廠，型號(hào)：80-2）。

2 方法

2.1? 原代神經(jīng)元培養(yǎng)[17]

打開(kāi)水浴，預(yù)熱培養(yǎng)液，消毒操作區(qū)，滅菌解剖器械。在每個(gè)60 mm的培養(yǎng)基中加入4 mL DMEM/F12培養(yǎng)基，1個(gè)100 mm的培養(yǎng)皿中加入15 mL DMEM/F12培養(yǎng)基，一個(gè)15 mL離心管中加入13 mL DMEM/F12培養(yǎng)基（均放置在冰上）。處死16～18 d孕鼠，然后取出胎鼠腦，并將取出來(lái)的腦放到1個(gè)裝有培養(yǎng)基的60 mm皿中，在解剖鏡下去除腦膜，把干凈的大腦皮質(zhì)放在1個(gè)60 mm皿中，使用滅菌的眼科剪將組織剪15 min。加入5 mL 0.125%胰酶，震蕩混勻，放入37 ℃水浴中15 min（每3～4 min輕輕上下顛倒離心管，使消化均勻）。加入DMEM/F12培養(yǎng)基中和胰酶作用，過(guò)細(xì)胞篩，1000 r/min，離心半徑33.6 cm，離心5 min。移除上清液，加入5 mL

DMEM/F12培養(yǎng)基，清洗兩次。吹打10～15次，靜置片刻收集上清液，小心取出細(xì)胞懸液，移至15 mL離心管中，收集細(xì)胞懸液到15 mL離心管，1000 r/min，離心半徑33.6 cm，離心5 min。細(xì)胞計(jì)數(shù)之后，種植到6孔板和24孔板中。4 h后去除培養(yǎng)基加入維持培養(yǎng)基（含Neurobasal培養(yǎng)基、B27、Glutamine及PBS），每隔3 d半量換液。大鼠原代神經(jīng)元細(xì)胞培養(yǎng)光學(xué)顯微鏡結(jié)果顯示：可見(jiàn)高度分化的神經(jīng)元細(xì)胞，細(xì)胞核大而圓，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)含尼氏小體，細(xì)胞突起豐富。見(jiàn)圖1。

2.2? 含藥血清的制備

將中藥放入水中浸泡2 h，煮沸后微火煎煮30 min，過(guò)濾留湯汁，藥渣加3倍量的水再煎煮20 min，將湯汁混合后在水浴鍋中濃縮至生藥量5 g/mL，置于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?。通過(guò)HPLC和HRMS分別對(duì)腦泰方含藥血清中的3個(gè)代表性化合物和4個(gè)有效成分進(jìn)行了驗(yàn)證，主要化合物為鹽酸川芎嗪2.07 μg/mL、阿魏酸286.96 μg/mL、毛蕊異黃酮葡萄糖苷176.23 μg/mL[18]。取3只成年雄性SD大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后制備腦泰方含藥血清，按體表面積換算，2倍劑量灌胃給予大鼠（生藥量28.8 g/kg）[19]，每天1次，連續(xù)7 d，于末次給藥后1 h無(wú)菌條件下行頸總動(dòng)脈取血，分離血清，0.22 μm過(guò)濾滅菌后置于-80 ℃冰箱留存?zhèn)溆谩?/p>

2.3? 氧糖剝奪模型造模方法[20]

原代神經(jīng)元細(xì)胞培養(yǎng)成熟后，一部分接種在96孔板中，每孔3×10個(gè)，另一部分接種在3.5 cm玻璃底培養(yǎng)皿中，每孔1×10個(gè)。根據(jù)分組將培養(yǎng)基去除，加入opti-MEM培養(yǎng)基，放入含1% O的培養(yǎng)箱中4 h后，除去opti-MEM培養(yǎng)基，更換為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，NTF組在缺氧后加入10%的含藥血清，共同放入常氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。

2.4? MTT法檢測(cè)神經(jīng)元細(xì)胞存活率

在96孔板內(nèi)加入MTT，再培養(yǎng)3 h，去除孔內(nèi)液體，每孔加入150 μL DMSO，搖晃均勻，用酶標(biāo)儀在570 nm波長(zhǎng)測(cè)定光密度（optical density， OD）值，計(jì)算公式為：神經(jīng)元細(xì)胞存活率=（OGD或NTF組OD值-空白孔平均OD值）/（CG組OD值-空白孔平均OD值）×100%，實(shí)驗(yàn)中空白孔OD值分別為0.045、0.046、0.046、0.051、0.049、0.047，求出平均值后分析結(jié)果。

2.5? 各組神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)Fe濃度測(cè)定

使用FeRhoNoxTM-1評(píng)估神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)Fe濃度。FeRhoNoxTM-1是一種可激活的熒光探針，通過(guò)橙色（紅色）熒光特異性檢測(cè)不穩(wěn)定的Fe2+離子在神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)的濃度。將3.5 cm玻璃底培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)基去除，加入預(yù)冷的PBS輕輕洗滌2次，隨后加入5 μmol/L Fe檢測(cè)試劑混勻后，放入37 ℃含5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)60 min。去除培養(yǎng)基，加入預(yù)冷的PBS洗3次，在熒光顯微鏡下拍照，使用Image J軟件進(jìn)行掃描，計(jì)算公式為：平均熒光OD值=該區(qū)域熒光OD值總和/該區(qū)域面積，得出數(shù)據(jù)后分析結(jié)果。

2.6? 各組神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)ROS濃度測(cè)定

用DCFH-DA探針測(cè)定細(xì)胞濃度。將3.5 cm玻璃底培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)基去除，加入預(yù)冷的PBS輕輕洗滌2次，加入基礎(chǔ)培養(yǎng)基1 mL，再加入1 μL ROS試劑，放入37 ℃含5%CO的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)60 min。去除培養(yǎng)基，加入預(yù)冷的PBS洗3次，在熒光顯微鏡下拍照，用Image J軟件分析檢測(cè)熒光OD值，計(jì)算公式為：平均熒光OD值=該區(qū)域熒光OD值總和/該區(qū)域面積，得出數(shù)據(jù)后分析結(jié)論。

2.7? Western blot測(cè)定神經(jīng)元細(xì)胞鐵代謝相關(guān)蛋白的表達(dá)

提取30 mg細(xì)胞組織，提取總蛋白，用BCA法測(cè)定總蛋白量，確定最終上樣量為30 μg，取出上樣樣品至0.5 mL離心管中，加入5倍濃度的SDS并稀釋至1倍濃度，于沸水中煮5 min使蛋白變性。電泳，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉TBST溶液封閉，將一抗用含1% BSA的TBST溶液稀釋（稀釋比例為T(mén)fR 1∶1000、DMT1 1∶1000、FPN 1∶2000、Hep 1∶1000、GAPDH 1∶5000），于4 ℃孵育過(guò)夜，將二抗用TBST按照1∶5000稀釋，室溫下孵育2 h后，TBST在室溫下脫色搖床上洗3次，每次10 min，用Tanon

5200化學(xué)發(fā)光成像儀下拍照，得出數(shù)據(jù)，進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2.8? 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料以“x±s”表示，均服從正態(tài)分布且各組間方差齊，采用單因素方差分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1? 各組神經(jīng)元細(xì)胞存活率比較

與CG組比較，OGD組、NTF組神經(jīng)元細(xì)胞存活率均明顯降低（P<0.01）;與OGD組比較，NTF組神經(jīng)元細(xì)胞存活率明顯升高（P<0.01）。見(jiàn)圖2。

3.2? 各組神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)Fe濃度比較

與CG組比較，OGD組、NTF組神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)Fe2+濃度均明顯升高（P<0.01）;與OGD組比較，NTF組神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)Fe濃度明顯降低（P<0.01）。見(jiàn)圖3。

3.3? 各組神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)ROS濃度比較

與CG組比較，OGD組、NTF組神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)ROS濃度均明顯升高（P<0.01）;與OGD組比較，NTF組細(xì)胞內(nèi)ROS濃度明顯降低（P<0.01）。見(jiàn)圖4。

3.4? 各組神經(jīng)元細(xì)胞鐵代謝相關(guān)蛋白比較

與CG組比較，OGD組神經(jīng)元細(xì)胞Hep表達(dá)明顯降低（P<0.01），DMT1、TfR、FPN表達(dá)均明顯升高（P<0.01）;與OGD組比較，NTF組Hep表達(dá)明顯升高（P<0.01），DMT1、TfR、FPN表達(dá)均明顯降低（P<0.05，P<0.01）。見(jiàn)圖5。

4 討論

Fe2+是人體內(nèi)不可或缺的微量元素之一，參與呼吸鏈電子傳遞、神經(jīng)纖維髓鞘及神經(jīng)遞質(zhì)的合成[21]。在細(xì)胞質(zhì)和溶酶體、線粒體等細(xì)胞器中存在不穩(wěn)定鐵池，過(guò)量游離鐵通過(guò)芬頓反應(yīng)生成大量ROS，造成細(xì)胞壞死、凋亡[22-23]。近年來(lái)研究表明，鐵超載及氧化應(yīng)激誘導(dǎo)線粒體損傷也是腦缺血損傷的病理機(jī)制之一[24-25]。觀察大腦中動(dòng)脈閉塞大鼠模型術(shù)后及腦梗死患者，發(fā)現(xiàn)Fe攝入增多，加重缺血區(qū)氧化應(yīng)激、興奮性毒性及炎癥反應(yīng)，腦梗死體積明顯增加[26-27]。高鐵飲食小鼠在腦原位血栓栓塞后，缺血再灌注損傷較假手術(shù)組嚴(yán)重[28-29]。而減少鐵聚集，維持神經(jīng)元Fe穩(wěn)態(tài)可減少ROS產(chǎn)生，緩解腦缺血及繼發(fā)性損傷[3]。因此，抑制腦缺血后神經(jīng)元內(nèi)鐵聚集，減少ROS的生成，對(duì)腦缺血損傷的治療及預(yù)后具有重要意義。

關(guān)于細(xì)胞內(nèi)外Fe轉(zhuǎn)運(yùn)，本課題組提出了如下工作模式，即“兩個(gè)中心，3個(gè)體系，網(wǎng)絡(luò)調(diào)控”：以Hep及胞漿鐵調(diào)節(jié)蛋白的調(diào)節(jié)為中心，細(xì)胞內(nèi)鐵的攝取、儲(chǔ)存與外排是通過(guò)鐵轉(zhuǎn)運(yùn)輸入蛋白、胞內(nèi)鐵儲(chǔ)存蛋白、鐵轉(zhuǎn)運(yùn)輸出蛋白3個(gè)體系完成;3個(gè)體系通過(guò)復(fù)雜的信號(hào)途徑對(duì)鐵進(jìn)出細(xì)胞進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)調(diào)控[30]。

Hep是調(diào)節(jié)鐵穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵蛋白，調(diào)控鐵的吸收、儲(chǔ)存和釋放，由肝細(xì)胞分泌產(chǎn)生，其生物活性主要由25個(gè)氨基酸多肽決定[31]。Hep與FPN結(jié)合，內(nèi)化、降解FPN，Hep-FPN軸通過(guò)負(fù)反饋調(diào)節(jié)維持鐵穩(wěn)態(tài)[10]。另有研究發(fā)現(xiàn)，Hep可通過(guò)蛋白酶內(nèi)化、降解細(xì)胞膜的DMT1，從而抑制鐵吸收，減少細(xì)胞鐵聚積[32]。Hep作用機(jī)制與細(xì)胞類型有關(guān)，巨噬細(xì)胞中的Hep結(jié)合和降解FPN，而腸上皮細(xì)胞中的Hecpidin通過(guò)抑制DMT1調(diào)節(jié)鐵代謝[33]。Hep及鐵相關(guān)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（DMT1、TfR、FPN）均廣泛分布于大腦各區(qū)域[34]。阿爾茨海默病中Hep通過(guò)負(fù)反饋調(diào)節(jié)FPN導(dǎo)致鐵聚集神經(jīng)元損傷[35]。研究發(fā)現(xiàn)Hep能顯著抑制神經(jīng)元及星形膠質(zhì)細(xì)胞中DMT1、TfR、FPN的表達(dá)[36];鐵調(diào)節(jié)“旁路模式”中，Hep抑制DMT1、TfR表達(dá)，游離Fe通過(guò)血腦屏障表達(dá)的FPN輸出，從而緩解鐵沉積[37]。因此，腦缺血后Hep調(diào)節(jié)神經(jīng)元鐵相關(guān)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白DMT1、TfR、FPN作用機(jī)制值得探討。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，中風(fēng)的病理性質(zhì)多屬“本虛標(biāo)實(shí)”，氣血虛衰為本，風(fēng)、火、痰、氣、瘀為標(biāo)，故中醫(yī)藥治療多遵循“活血祛瘀、祛風(fēng)通絡(luò)”的治則，標(biāo)本兼治[13]。腦泰方由中藥黃芪、川芎、地龍、僵蠶4味藥組成，黃芪為君藥，其力專，周行全身，大補(bǔ)脾胃元?dú)猓瑲馔鷦t血活，血活則瘀除，以治其本;地龍性寒、味咸，具有息風(fēng)通絡(luò)之功效;僵蠶味辛、咸，性平，兩者合用共奏通經(jīng)活絡(luò)、祛風(fēng)化痰之功效，均為臣藥;川芎活血行氣，氣行則血行，為“血中之氣藥”，具有引藥上行之功效，是為佐藥，4味藥配合共奏益氣活血、祛瘀通絡(luò)、標(biāo)本兼治之效[38]。前期研究發(fā)現(xiàn)，腦泰方通過(guò)調(diào)節(jié)大鼠神經(jīng)元鐵相關(guān)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（TfR、FPN等）的表達(dá)，抑制鐵的細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)，促進(jìn)鐵外排，起到保護(hù)神經(jīng)元的作用[39-40]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)原代培養(yǎng)神經(jīng)元，氧糖剝奪損傷后Fe2+聚集、ROS生成明顯增多（P<0.01），神經(jīng)元細(xì)胞存活率明顯降低（P<0.01）;腦泰方干預(yù)可明顯減少Fe聚集、減少ROS生成（P<0.01），明顯升高神經(jīng)元細(xì)胞存活率（P<0.01）。氧糖剝奪后Hep表達(dá)明顯降低（P<0.01），同時(shí)DMT1、TfR、FPN表達(dá)均明顯升高（P<0.01）;腦泰方干預(yù)后Hep表達(dá)明顯升高（P<0.01），DMT1、TfR、FPN表達(dá)均明顯減少（P<0.01，P<0.05）。由此，推測(cè)神經(jīng)元缺氧缺糖培養(yǎng)后，腦泰方通過(guò)促進(jìn)Hep生成，降解鐵相關(guān)輸入蛋白DMT1、TfR，從而抑制鐵聚集，減少ROS生成，起到保護(hù)神經(jīng)元的作用。

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