柏子仁制霜工藝優(yōu)化及脂肪油測定

王 瓊， 劉 敬*， 曹 暉

(1.中山火炬職業(yè)技術學院健康產業(yè)學院，廣東 中山 528436；2.國家中藥現(xiàn)代化工程技術研究中心，廣東 珠海 519085)

柏子仁為柏科植物側柏Platycladusorientalis(L.)Franco的干燥成熟種仁，味甘性平，歸心、腎、大腸經，具有養(yǎng)心安神、潤腸通便、止汗的功效。柏子仁霜在2020年版《中國藥典》一部[1]、1988年版《全國中藥炮制規(guī)范》[2]及部分省地方規(guī)范[3]中均有收載，其最早見于宋代《博濟方》[4]，炮制目的在于減少脂肪油含量，消除致嘔、致瀉副作用[5]。目前，有學者采用干燥箱制霜法[6]、CO2超臨界制霜法[7]等對柏子仁制霜方法進行研究，并對不同制霜炮制方法進行了比較[8]，但尚未見柏子仁霜壓榨制霜工藝的研究報道。本研究采用正交試驗對柏子仁壓榨去油制霜工藝中的炮制壓力、炮制溫度、炮制次數、炮制時間等參數進行優(yōu)化，并采用氣相色譜法(GC)對柏子仁和柏子仁霜所含脂肪油中成分進行分析，可為制定相關炮制規(guī)范提供科學依據。

1 材料

1.1 儀器 制霜板(實驗室自制)；800Y型多功能粉碎機(永康市鉑歐五金制品有限公司)；DHG-9070A型電熱恒溫鼓風干燥箱(上海一恒科學儀器有限公司)；BS124S型分析天平(德國Sartorius公司)；SB-5200DTD型超聲波清洗器(寧波新芝生物科技股份有限公司)；TU-1810型紫外-可見分光光度計(北京普析通用儀器有限責任公司)；GC-2010 PLUS型氣相色譜儀(日本島津公司)。

1.2 飲片 柏子仁由國家中藥現(xiàn)代化工程技術研究中心提供，批號20170401，經中山火炬職業(yè)技術學院趙斌博士鑒定為柏科植物側柏Platycladusorientalis(L.)Franco的干燥成熟果實,碾去果殼及種皮，取種仁備用。

1.3 試劑與藥物 烘焙專用吸油紙(厚0.1 mm，執(zhí)行標準GB4806.8-2016，廣州金潔灃紙業(yè)有限公司)。齊墩果酸對照品(批號PS013402，成都普思生物科技股份有限公司，純度>98.0%)；40種脂肪酸甲酯對照品(批號JA4-A，美國Nu-Chek公司，純度99.0%)。正庚烷為色譜純；氫氧化鈉、三氟化硼、氯化鈉、香蘭素、冰醋酸、濃硫酸、乙醇、甲醇、石油醚(60～90 ℃)等為分析純；水為超純水。

2 方法與結果

2.1 總皂苷含量測定 采用香草醛-濃硫酸顯色法[9]測定。

2.1.1 對照品溶液制備 精密稱取齊墩果酸對照品適量，甲醇制成每1 mL約含100 μg該成分的溶液，即得。

2.1.2 供試品溶液制備 精密稱取柏子仁霜2.0 g，裝入濾紙筒置索氏提取器中，加石油醚(60～90 ℃)200 mL回流提取2 h，棄去提取液，取出，藥渣連同濾紙筒揮干溶劑后移入具塞錐形瓶中，精密加入50 mL 70%乙醇，稱定質量，超聲(40 kHz、250 W)提取30 min，冷卻，70%乙醇溶液補足減失的質量，傾出提取液，精密吸取提取液25 mL，蒸干，殘渣加20 mL水，轉入分液漏斗中，加正丁醇提取3次，每次10 mL，合并正丁醇液并蒸干，適量甲醇溶解殘渣，轉移至10 mL量瓶中，甲醇定容至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.1.3 線性關系考察 精密量取“2.1.1”項下對照品溶液(0.116 5 mg/mL)0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，置于試管中，揮干溶劑，精密加入1 mL新鮮5%香蘭素冰醋酸、5 mL 80%硫酸，搖勻，85 ℃水浴加熱10 min，取出，冰水浴中冷卻15 min，取出，放置至室溫，以相應試劑為空白，在538 nm波長處測定吸光度。以吸光度為縱坐標(A)，對照品質量濃度為橫坐標(X)進行回歸，得方程為A=8.004 1X+0.039 7(r=0.999 5)，在0.116 5～0.023 3 mg/mL范圍內線性關系良好。

2.1.4 精密度試驗 取“2.1.3”項下對照品溶液，于538 nm波長處測定吸光度6次，測得其RSD為0.08%，表明儀器精密度良好。

2.1.5 穩(wěn)定性試驗 取“2.1.3”項下對照品溶液，于0、20、40、60、80、100、120 min測定吸光度，測得其RSD為1.04%，表明溶液在120 min內穩(wěn)定性良好。

2.1.6 重復性試驗 稱取同一批柏子仁霜6份，每份2.0 g，按“2.1.2”項下方法平行制備6份供試品溶液，精密量取1.0 mL，置于10 mL具塞試管中，按“2.1.3”項下方法測定吸光度，測得其RSD為0.86%，表明該方法重復性良好。

2.1.7 加樣回收率試驗 精密稱取同一批柏子仁霜6份，每份1.0 g，精密加入對照品溶液(2.913 mg/mL)1.0 mL，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，精密量取1.0 mL，置于10 mL具塞試管中，按“2.1.3”項下方法測定吸光度，計算回收率。結果，齊墩果酸平均加樣回收率為96.33%，RSD為1.71%。

2.2 制霜工藝優(yōu)化

2.2.1 正交試驗設計 在預試驗基礎上，以炮制溫度(A)、炮制壓力(B)、炮制次數(C)、炮制時間(D)為影響因素，每個因素3個水平，L9(34)正交試驗優(yōu)化炮制工藝，因素水平見表1。

2.2.2 飲片炮制 取凈柏子仁適量，碾成粗粉后分為9份，每份20 g，將吸油紙平鋪于制霜板上，粗粉均勻平鋪于吸油紙上，上層再覆蓋吸油紙，之后蓋上另一塊制霜板(首次試驗上下各用6張吸油紙，后續(xù)試驗各用3張)，調節(jié)螺母，使上下兩塊制霜板之間的壓力達到表1中的炮制壓力，置于規(guī)定溫度的烘箱中，達到規(guī)定時間后取出，打開制霜板，取出粗粉，完成1次壓制，同法操作至規(guī)定次數，取出，放涼，粉碎，收集過80目篩的細粉，即得柏子仁霜。

表1 因素水平

2.2.3 脂肪油提取 精密稱取粗粉1 g，置于索氏提取器中，加乙醚適量，回流提取8 h至脂肪油提盡，收集提取液，置于干燥至恒重的蒸發(fā)皿中，水浴低溫蒸干，在100 ℃下干燥1 h，移到干燥器中冷卻30 min，精密稱定質量。

2.2.4 數據處理 采用Hassan法對脂肪油、總皂苷含量進行歸一化處理[10]，前者取值越小越好，后者取值越大越好，計算公式為dmin=(Ymax-Yi)/(Ymax-Ymin)、dmax=(Yi-Ymin)/(Ymax-Ymin)，其中Ymin為指標中最小值，Ymax為指標中最大值，總評“歸一值”(OD值)=(d1·d2)1/2，結果見表2，方差分析見表3。

表2 試驗設計與結果

表3 方差分析

2.2.5 最優(yōu)工藝的確定 表3顯示，各因素影響程度依次為炮制壓力(B)>炮制溫度(A)>炮制次數(C)>炮制時間(D)，其中因素B有顯著影響(P<0.05)，最優(yōu)工藝為A1B3C1D1。具體為取凈柏子仁粗粉適量，吸油紙(上下各用6張)下墊上蓋，調節(jié)螺母使2塊制霜板之間的壓力達到120 kPa，于烘箱中恒溫40 ℃，靜置60 min后取出，重復2次(上下各用3張吸油紙)，取出柏子仁粗粉，放涼，粉碎，收集過80目篩的細粉，即得柏子仁霜。

2.3 驗證試驗 按“2.2.5”項下優(yōu)化工藝制備3批柏子仁霜(命名為柏子仁霜1～柏子仁霜3)，均為粒度均勻、疏松的淡黃色粉末，顯油性，見圖1，總皂苷、脂肪油平均含量分別為0.32%、13.6%，證明該工藝穩(wěn)定可行，重復性好。

圖1 柏子仁炮制前后圖

2.4 脂肪油含量測定 參照國標GB5009.168—2016(《食品中脂肪酸的測定品中氨基酸的測定》)[11]測定。

2.4.1 供試品溶液制備 按“2.2.3”項下方法提取脂肪油，取100 mg至燒瓶中，加入2%氫氧化鈉甲醇溶液8 mL，(80±1)℃水浴回流至油滴消失，從冷凝管上端加入7 mL 15%三氟化硼甲醇溶液，(80±1)℃水浴繼續(xù)回流2 min，停止加熱，用冷水沖洗冷凝管，取下燒瓶，快速冷卻，精密量取20 mL正庚烷至燒瓶中，搖動2 min左右，再加入適量飽和氯化鈉水溶液，分層后吸取約5 mL正庚烷溶液至試管中，加入3～5 g無水硫酸鈉，振搖1 min后靜置5 min，吸取上層溶液，即得。

2.4.2 色譜條件 HP-88色譜柱(100 m×0.25 mm，0.2 μm)；進樣口溫度240 ℃；檢測器溫度250 ℃；程序升溫(130 ℃保持1 min，10 ℃/min升至180 ℃，2.75 ℃/min升至215 ℃，5 ℃/min升至235 ℃，保持10 min)；體積流量1.2 mL/min；分流比5∶1。

2.4.3 結果分析 精密吸取“2.4.1”項下供試品溶液1.0 μL，在“2.4.2”項色譜條件下進樣測定，與混合脂肪酸甲酯對照品圖譜進行比對以確定脂肪酸歸屬，按“2.2.4”項下方法測定脂肪酸含量，結果見圖2、表4。由此可知，生品、炮制品中均檢出10種脂肪酸，其種類無明顯變化，相對含量基本一致，即未受制霜工藝影響，其中油酸甲酯、亞油酸甲酯、亞麻酸甲酯總含量約占85%，其次是棕櫚酸甲酯、硬脂酯酸甲酯，兩者總含量約占10%。

1. 棕櫚酸甲酯 2. 珠光脂酸甲酯 3. 硬脂酯酸甲酯 4. 油酸甲酯 5. 亞油酸甲酯 6. 亞麻酸甲酯 7. 花生烯酸甲酯8. 二十一烷酸甲酯 9. (11Z,14Z)-11,14-二十碳二烯酸甲酯 10. 芥酸甲酯圖2 各成分GC色譜圖

3 討論

目前柏子仁霜的法定炮制方法是壓榨去油制霜法，該方法也是柏子仁傳統(tǒng)炮制方法。本研究通過測定柏子仁中脂肪油和總皂苷的含量，采用正交試驗，優(yōu)化了炮制溫度、炮制壓力、炮制次數和炮制時間等重要的制霜工藝參數，確定了最佳工藝，不僅符合柏子仁霜炮制規(guī)范，還為制定柏子仁霜飲片生產規(guī)范奠定了基礎。

表4 脂肪酸含量測定結果(%，n=2)

柏子仁制霜的目的在于消除致嘔和致瀉的副作用[12]，多用于虛煩失眠的脾虛患者。孫付軍等[13]研究發(fā)現(xiàn)，0～16%含油量的柏子仁對小鼠便秘模型的相關指標均無明顯影響，提示柏子仁霜的含油量控制在16%以下就不會產生致瀉的副作用。另有研究表明柏子仁油能一定程度增加小鼠睡眠指數，柏子仁總皂苷能明顯延長小鼠睡眠時間，提示柏子仁制成霜以后，安神作用較強的皂苷成分含量增加，引起致瀉的脂肪油含量降低，符合古人對柏子仁制霜的目的[14]。

采用壓榨去油制霜法制備的柏子仁霜，脂肪油含量保持在13.6%左右，脂肪油成分在制霜過程中未受到破壞，各成分組成及其相對含量與生柏子仁均基本一致[15]，符合柏子仁制霜炮制的要求。