槐耳發(fā)酵液乙酸乙酯部位化學(xué)成分的研究

李可心， 呂建華， 董 婧， 范冬雨， 王英平， 李長田*

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食藥用菌教育部工程研究中心，吉林 長春 130118；2.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)人參新品種選育與開發(fā)國家地方聯(lián)合工程研究中心，吉林 長春 130118)

槐耳TramesrobiniophilaMurrll.屬于真菌門、擔(dān)子菌亞門、層菌綱、非褶菌目、多孔菌科、栓菌屬，是一種珍稀的藥用真菌。具有提高免疫力、抗氧化、抗腫瘤等多種生物活性?；倍嗌L在刺槐的死樹、活立木、倒木及樹樁上，分布在東北、華北、華中和西北地區(qū)等少數(shù)地區(qū)[1]。槐耳中含有大量多糖類化合物，也是其重要的活性成分，多用于抗癌和炎癥的治療，而對槐耳的化學(xué)成分研究較少[2]。由于槐耳野生資源稀少，采用發(fā)酵技術(shù)不僅能夠獲得大量穩(wěn)定的次生代謝產(chǎn)物，而且有利于對槐耳的深度開發(fā)利用。因此本研究對槐耳發(fā)酵液乙酸乙酯提取物進(jìn)行化學(xué)成分分析，從中分離得到16個化合物，所有化合物均為首次從該真菌發(fā)酵液中分離得到。

1 材料

500 L發(fā)酵罐(大連富森科技有限公司)；AL104電子天平[梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司]；MJ-25085H-II生化培養(yǎng)箱(上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司)；YX Q-LS-30SII立式壓力蒸汽滅菌器(上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)；SW-CJ-2D超凈工作臺(上海蘇凈實業(yè)有限公司)；QHZ-98B恒溫?fù)u床(上海智城分析儀器制造有限公司)；Agilent Technologies半制備型高效液相(美國Agilent公司)；ZMD核磁共振儀600 MHz(德國Bruker公司)。

正向柱色譜硅膠(100～200、200～300目，青島海洋化工有限公司)；ODS反相色譜填料(50 μm，日本YMC公司)；GH0525010C18A制備型反相色譜柱(250 mm×10 mm，5 μm，北京綠百草科技發(fā)展有限公司)。甲醇、二氯甲烷、乙酸乙酯、無水乙醇(北京永定化工廠)；色譜級甲醇、乙腈(美國Thermo Fisher Scientific公司)；娃哈哈水(杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司)。

槐耳菌株(編號BNCC)存放于吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材學(xué)院菌物生態(tài)學(xué)實驗室。

2 提取與分離

將保存在4 ℃冰箱中的槐耳菌種于PDA培養(yǎng)基(馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂20 g、蒸餾水1 L、pH 6)上進(jìn)行轉(zhuǎn)接活化，25 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)7 d。將活化好的槐耳菌種接種到液體培養(yǎng)基(蔗糖20 g、酵母浸粉2 g、KH2PO42 g、MgSO41 g、蒸餾水1 L、pH 6，接種量12%)，于溫度25 ℃，轉(zhuǎn)速150 r/min的條件下培養(yǎng)7 d后轉(zhuǎn)入到400 L發(fā)酵培養(yǎng)基中(同液體培養(yǎng)基)，于溫度25 ℃在發(fā)酵罐中培養(yǎng)20 d得到發(fā)酵產(chǎn)物。

將發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行過濾后得到發(fā)酵液250 L，濃縮至50 L，用乙酸乙酯反復(fù)萃取(5次，每次12 h)，將萃取液合并濃縮，得到浸膏350 g。

經(jīng)硅膠柱色譜分離，二氯甲烷-甲醇(100∶1、50∶1、20∶1、10∶1、5∶1、0∶100)梯度洗脫，得到6個餾份Fr.1～Fr.6。Fr. 4析出白色沉淀化合物1(10 g)。將Fr.3(50 g)進(jìn)行ODS反相硅膠色譜柱分離，30%、40%、50%、65%、80%、100%甲醇-水洗脫，得到6個餾份Fr.3.1～Fr.3.6，F(xiàn)r.3.1～Fr.3.2每個餾份分為6個組分分別為Fr.3.1.1～Fr.3.1.6、Fr. 3.2.1～Fr.3.2.6。Fr.3.2.1進(jìn)行HPLC半制備分離純化(乙腈∶水)得到化合物2(7 mg)、將Fr.3.2.2和Fr.3.2.3合并進(jìn)行HPLC半制備分離純化得化合物3(5 mg)、4(6 mg)、5(3 mg)。將剩余Fr.4(60 g)進(jìn)行ODS反相硅膠色譜柱分離，30%、40%、50%、65%、80%、100%甲醇-水洗脫，得到6個餾份Fr.4.1～Fr.4.6，F(xiàn)r.4.1～Fr.4.2每個餾份分為6個組分分別為Fr.4.1.1～Fr.4.1.6、Fr.4.2.1～Fr.4.2.6、Fr.4.3.1～Fr.4.3.6、Fr.4.5.1～Fr.4.5.6、Fr.4.6.1～Fr.4.6.6，將Fr.4.6.1進(jìn)行HPLC半制備分離純化得化合物6(2 mg)；將Fr.4.2.2進(jìn)行HPLC半制備分離純化得化合物7(2 mg)、8(2 mg)；將Fr.4.1.5進(jìn)行HPLC半制備分離純化得化合物9(6 mg)；將Fr.4.6.3進(jìn)行HPLC半制備分離純化得化合物10(5 mg)；將Fr.4.3.1進(jìn)行HPLC半制備分離純化得化合物11(7 mg)；將Fr.4.2.1進(jìn)行HPLC半制備分離純化得化合物12(5 mg)；將Fr.4.3.3進(jìn)行HPLC半制備分離純化得化合物13(3 mg)。將Fr.6(45 g)加入水，用乙酸乙酯萃取(3次，每次12 h)后濃縮，進(jìn)行ODS反相硅膠色譜柱分離，30%、40%、50%、65%、80%、100%甲醇-水洗脫，得到6個餾份Fr.6.1～Fr.6.6，F(xiàn)r.6.1～Fr.6.2每個餾份分為6個組分分別為Fr.6.1.1～Fr.6.1.6、Fr.6.2.1～Fr.6.2.6。Fr.6.1.1進(jìn)行HPLC半制備分離純化得化合物14(4 mg)；Fr.6.2.1進(jìn)行HPLC半制備分離純化得化合物15(5 mg)、16(3 mg)。

3 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1：白色粉末(甲醇)，分子式C4H4N2O2，ESI-MSm/z：112.1[M+H]+。1H-NMR(600 MHz，DMSO-d6)δ：11.41(2H，brs，1-NH，3-NH)，7.37(1H，d，J=7.6 Hz，H-6)，5.46(1H，d，J=7.6 Hz，H-5)；13C-NMR(150 MHz，DMSO-d6)δ：165.2(C-4)，152.2(C-2)，142.9(C-6)，101.0(C-5)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[3]基本一致，故鑒定為尿嘧啶。

化合物2：白色粉末(甲醇)，分子式C8H8O4，ESI-MSm/z：168.2[M+H]+。1H-NMR(600 MHz，Methanol-d4)δ：7.45(1H，s，H-2)，7.45(1H，d，J=9.8 Hz，H-6)，6.82(1H，d，J=8.0 Hz，H-5)，3.69(3H，s，8-OCH3)；13C-NMR(150 MHz，Methanol-d4)δ：173.4(C-7)，150.1(C-4)，144.6(C-3)，122.5(C-1)，121.8(C-6)，116.4(C-5)，114.4(C-2)，50.8(-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[4]基本一致，故鑒定為3，4-二羥基苯甲酸甲酯。

化合物3：白色粉末(甲醇)，分子式C7H6O4，ESI-MSm/z：154.1[M+H]+。1H-NMR(600 MHz，DMSO-d6)δ：7.34(1H，s，H-2)，7.29(1H，d，J=8.2 Hz，H-6)，6.78(1H，d，J=8.2 Hz，H-5)；13C-NMR(150 MHz，DMSO-d6)δ：115.6(C-2)，117.0(C-5)，122.2(C-6)，122.3(C-1)，145.3(C-3)，150.4(C-4)，167.8(C-7)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[5]基本一致，故鑒定為3，4-二羥基苯甲酸。

化合物4：黃色油狀(甲醇)，分子式C9H12O2，ESI-MSm/z：152.2[M+H]+。1H-NMR(600 MHz，DMSO-d6)δ：7.35～7.26(4H，m，H-5，6，8，9)，7.25～7.19(1H，m，H-7)，4.28(1H，d，J=6.2 Hz，H-1)，3.65(1H，m，H-2)，0.83(3H，d，J=6.2 Hz，H-3)；13C-NMR(150 MHz，DMSO-d6)δ：143.5(C-4)，128.1(C-6，8)，127.5(C-5，9)，127.2(C-7)，78.0(C-1)，71.1(C-2)，19.2(C-3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[6]基本一致，故鑒定為1-苯基-1，2-丙二醇。

化合物5：白色粉末(甲醇)，分子式C11H18N2O2，ESI-MSm/z：211.1[M+H]+。1H-NMR(600 MHz，DMSO-d6)δ：8.00(1H，s，H-8)，4.19(1H，t，J=8.0 Hz，H-6)，4.00(1H，dd，J=7.4，5.2 Hz，H-9)，3.49～3.22(3H，m，H-3，H-5)，2.12(1H，m，H-5)，1.96～1.60(4H，m，H-10，4)，1.35(1H，m，H-11)，0.87(3H，d，J=6.0 Hz，H-12)，0.86(3H，d，J=6.0 Hz，H-13)；13C-NMR(150 MHz，DMSO-d6)δ：170.8(C-1)，167.0(C-7)，58.9(C-6)，53.1(C-9)，45.3(C-3)，38.2(C-10)，27.9(C-5)，24.5(C-11)，23.3(C-4)，22.9(C-13)，22.4(C-12)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[7]基本一致，故鑒定為環(huán)(亮氨酸-脯氨酸)。

化合物6：白色粉末(甲醇)，分子式C12H14N2O2，ESI-MSm/z：218.3[M+H]+。1H-NMR(600 MHz，DMSO-d6)δ：8.11(1H，s，2-NH)，8.01(1H，s，5-NH)，7.28(2H，dd，J=8.0，6.7 Hz，H-3′，5′)，7.25～7.19(1H，m，H-4′)，7.18～7.12(2H，m，H-2′，6′)，4.23～4.09(1H，m，H-6)，3.69～3.58(1H，m，H-3)，3.13(1H，dd，J=13.4，3.7 Hz，H-7)，2.86(1H，dd，J=13.4，4.8 Hz，H-7)，0.47(3H，d，J=7.0 Hz，H-8)；13C-NMR(150 MHz，DMSO-d6)δ：168.2(C-5)，166.4(C-2)，136.5(C-9)，130.9(C-11，13)，128.5(C-10, 14)，127.2(C-12)，56.6(C-3)，51.0(C-6)，20.2(C-8)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[8]基本一致，故鑒定為環(huán)(苯丙氨酸-丙氨酸)。

化合物7：無色油狀(甲醇)，分子式C11H18N2O3，ESI-MSm/z：227.3[M+H]+。1H-NMR(600 MHz，Methanol-d4)δ：7.96(1H，s，H-8)，5.09(1H，s，4-OH)，4.28(1H，t，J=4.8 Hz，H-4′)，4.00(1H，brs，H-9)，3.53(1H，dd，J=4.8，12.6 Hz，H-3)，3.21(1H，d，J=12.6 Hz，H-3′)，2.04(1H，dd，J=6.6，13.2 Hz，H-5)，2.01(1H，m，H-10)，1.88(1H，ddd，J=4.8，11.4，13.2 Hz，H-5′)，1.34(1H，m，H-11)，1.28(1H，m，H-11′)，0.98(3H，t，d，J=7.8 Hz，H-13)，0.82(3H，t，J=7.2 Hz，H-12)；13C-NMR(150 MHz，Methanol-d4)δ：170.5(C-7)，165.3(C-1)，66.8(C-4)，59.1(C-9)，56.7(C-6)，53.8(C-3)，37.2(C-5)，34.8(C-10)，23.9(C-11)，14.9(C-13)，12.3(C-12)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[9]基本一致，故鑒定為環(huán)(4-S-羥基-R-脯氨酸-R-異亮氨酸)。

化合物8：白色粉末(甲醇)，分子式C11H12N2O2，ESI-MSm/z：204.2[M+H]+。1H-NMR(600 MHz，Methanol-d4)δ：8.14(1H，brs，H-6)，7.88(1H，brs，H-3)，7.28(3H，m，H-3′ -4′ -5′)，7.17(2H，m，H-2′，6′)，4.06(1H，m，H-2)，3.35(1H，dd，J=3.0，18.0 Hz，H-5)，3.09(1H，dd，J=4.2，13.2 Hz，H-7)，2.88(1H，dd，J=4.8，13.8 Hz，H-7′)，2.77(1H，d，J=17.4 Hz，H-5′)；13C-NMR(150 MHz，Methanol-d4)δ：167.1(C-1)，165.6(C-4)，136.0(C-1′)，130.0(C-2′，6′)，128.1(C-3′，5′)，126.7(C-4′)，55.5(C-2)，43.7(C-5)，38.8(C-7)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[10]基本一致，故鑒定為環(huán)(苯丙氨酸-甘氨酸)。

化合物9：白色粉末(甲醇)，分子式C14H16N2O3，ESI-MSm/z：260.3[M+H]+。1H-NMR(600 MHz，DMSO-d6)δ：8.17(1H，d，J=3.8 Hz，8-NH)，7.36～7.22(3H，m，H-2′-4′)，7.18～7.10(2H，m，H-5′，6′)，4.97(1H，s，4-OH)，4.19(1H，t，J=6.0，4.4 Hz，H-4)，4.00(1H，q，J=5.0 Hz，H-9)，3.59(1H，dd，J=12.6，4.8 Hz，H-3)，3.26(1H，dd，J=11.6，6.1 Hz，H-6)，3.06(1H，d，J=12.6 Hz，H-3)，3.04(1H，dd，J=13.6，5.9 Hz，H-10)，2.91(1H，dd，J=13.6，5.0 Hz，H-10)，1.86(1H，dd，J=12.8，6.1 Hz，H-5)，1.69(1H，td，J=12.2，4.4 Hz，H-5)；13C-NMR(150 MHz，DMSO-d6)δ：169.2(C-7)，165.3(C-1)，136.4(C-1′)，130.2(C-2′-6′)，128.7(C-3′，5′)，127.3(C-4′)，66.5(C-4)，58.4(C-9)，56.0(C-6)，54.5(C-3)，39.8(C-10)，38.3(C-5)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[11]基本一致，故鑒定為環(huán)(D-羥脯氨酸-L苯丙氨酸)。

化合物10：白色粉末(甲醇)，分子式C14H16N2O3，ESI-MSm/z：260.3[M+H]+。1H-NMR(600 MHz，DMSO-d6)δ：7.98(1H，s，8-NH)，7.31～7.19(5H，m，H-2′，3′，4′，5′，6′)，4.40(1H，t，J=5.2 Hz，H-9)，4.31(1H，dd，J=11.2，6.3 Hz，H-6)，4.19(1H，t，J=4.7 Hz，H-4)，3.52(1H，dd，J=12.6，4.8 Hz，H-3)，3.16(1H，d，J=12.6 Hz，H-3)，3.08(1H，dd，J=14.2，5.4 Hz，H-10)，3.01(1H，dd，J=14.2，5.0 Hz，H-10′)，1.94(1H，dd，J=12.8，6.2 Hz，H-5)，1.52(1H，td，J=12.0，4.6 Hz，H-5′)；13C-NMR(150 MHz，DMSO-d6)δ：35.6(C-10)，37.7(C-5)，54.3(C-3)，56.1(C-9)，57.4(C-6)，67.2(C-4)，126.8(C-4′)，128.4(C-3′，5′)，130.2(C-2′，6′)，137.8(C-1′)，165.7(C-1)，170.0(C-7)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[11]基本一致，故鑒定為環(huán)(L-苯丙氨酸-L羥脯氨酸)。

化合物11：無色晶體(甲醇)，分子式C8H8O3，ESI-MSm/z：152.2[M+H]+。1H-NMR(600 MHz，Methanol-d4)δ：10.50(s，1H，4-OH)，7.80(2H，d，J=8.6 Hz，H-2，6)，6.83(2H，d，J=8.6 Hz，H-3，5)，3.78(3H，s，-COOCH3)；13C-NMR(150 MHz，Methanol-d4)δ：166.5(C-7)，162.8(C-4)，131.9(C-2)，120.4(C-1)，115.9(C-3)，52.1(COOCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[12]基本一致，故鑒定為對羥基苯甲酸甲酯。

化合物12：白色粉末(甲醇)，分子式C7H6O3，ESI-MSm/z：138.1[M+H]+。1H-NMR(600 MHz，Methanol-d4)δ：7.86(2H，d，J=8.8 Hz，H-2，6)，6.81(2H，d，J=8.4 Hz，H-3，5)；13C-NMR(150 MHz，Methanol-d4)δ：170.1(-COOH)，163.3(C-4)，133.0(C-2，6)，122.8(C-1)，116.0(C-3，5)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[13]基本一致，故鑒定為對羥基苯甲酸。

化合物13：白色粉末(甲醇)，分子式C7H6O2，ESI-MSm/z：123.1[M+H]+。1H-NMR(600 MHz，Methanol-d4)δ：9.57(1H，S，H-7)，7.76(2H，d，J=8.4 Hz，H-3，5)，6.90(2H，d，J=8.4 Hz，H-2，6)；13C-NMR(150 MHz，Methanol-d4)δ：191.4(C-7)，164.0(C-4)，132.1(C-2，6)，128.8(C-1)，115.5(C-3，5)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[14]基本一致，故鑒定為對羥基苯甲醛。

化合物14：黃色針狀晶體(甲醇)，分子式C9H10O4，ESI-MSm/z：182.2[M+H]+。1H-NMR(600 MHz，Methanol-d4)δ：7.43(1H，s，H-2)，7.41(1H，dd，J=8.0，2.3 Hz，H-6)，6.81(1H，d，J=8.0 Hz，H-5)，4.29(2H，q，J=7.0 Hz，H-8)，1.36(3H，t，J=7.0 Hz，H-9)；13C-NMR(150 MHz，Methanol-d4)δ：167.2(C-7)，150.3(C-4)，144.8(C-3)，122.2(C-1)，121.4(C-6)，116.0(C-2)，114.5(C-5)，60.4(C-8)，13.3(C-9)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[15]基本一致，故鑒定為3，4-二羥基苯甲酸乙酯。

化合物15：白色粉末(甲醇)，分子式C9H16N2O2，ESI-MSm/z：184.2[M+H]+。1H-NMR(600 MHz，Methanol-d4)δ：8.10(1H，brs，H-4)，7.96(1H，brs，H-1)，3.88(1H，q，J=6.0 Hz，H-3)，3.74(1H，m，H-6)，1.85(1H，m，H-8)，1.39(1H，m，H-9)，1.27(1H，d，J=7.2 Hz，H-7)，1.18(1H，m，H-9′)，0.91(1H，d，J=6.6 Hz，H-11)，0.84(1H，t，J=7.2 Hz，H-10)；13C-NMR(150 MHz，Methanol-d4)δ：168.6(C-2)，166.6(C-5)，58.8(C-6)，49.6(C-3)，38.0(C-8)，24.2(C-9)，15.0(C-11)，11.9，(C-10)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[16]基本一致，故鑒定為環(huán)(丙氨酸-異亮氨酸)。

化合物16：白色粉末(甲醇)，分子式C11H18N2O3，ESI-MSm/z：226.3[M+H]+。1H-NMR(600 MHz，Methanol-d4)δ：8.31(1H，d，J=4.8 Hz，H-8)，4.99(1H，s，4-OH)，4.23(1H，m，H-4′)，4.22(1H，m，H-6)，3.62(1H，dt，J=4.8，9.6 Hz，H-9)，3.46(1H，dd，J=3.6，12.0 Hz，H-3)，3.26(1H，dd，J=5.4，12.0 Hz，H-3′)，2.26(1H，ddd，J=5.4，9.0，13.8 Hz，H-5)，2.04(1H，m，H-5′)，1.68(1H，m，H-11)，1.56(1H，m，H-10)，1.43(1H，m，H-10′)，0.91(1H，d，J=6.6 Hz，H-12)，0.87(1H，d，J=6.6 Hz，H-13)；13C-NMR(150 MHz，Methanol-d4)δ：168.6(C-7)，166.4(C-1)，66.8(C-4)，55.8(C-6)，55.1(C-9)，52.9(C-3)，41.9(C-10)，36.5(C-5)，23.9(C-11)，22.8(C-12)，21.5(C-13)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[17]基本一致，故鑒定為環(huán)(D-亮氨酸-反-4-羥基-L-脯氨酸)。

4 討論

本研究從槐耳發(fā)酵液乙酸乙酯提取物中分離鑒定了16個化合物，包括1個含氮類、1個苯丙素類、6個酚酸類和8個環(huán)二肽類，以上化合物均為首次從該真菌發(fā)酵液中分離得到。本研究對槐耳進(jìn)行液體發(fā)酵培養(yǎng)時，所用培養(yǎng)基中含有酵母浸粉，其含有蛋白質(zhì)、氨基酸、肽、多肽、核酸等營養(yǎng)成分。艾洪蓮等[18]從黃連內(nèi)生真菌發(fā)酵液中分離出酚酸類和環(huán)二肽類化合物，但其液體培養(yǎng)基中未用酵母浸粉。樺褐孔菌和靈芝子實體中也分離出酚酸類和環(huán)二肽化合物[19-20]，而槐耳是與樺褐孔菌和靈芝相似的藥用真菌，因此，以上均為該真菌中的化合物。酚酸類化合物具有抗肝癌、抗氧化，抗炎、降血脂等作用[21-22]；環(huán)二肽化合物具有調(diào)節(jié)免疫、抗腫瘤、抗真菌等作用[23-24]。因此，推測酚酸類和環(huán)二肽類可能為槐耳發(fā)酵液乙酸乙酯提取物中主要的有效成分。今后，將繼續(xù)對分離得到的單體化合物進(jìn)行活性篩選，以期為槐耳發(fā)酵液的深度開發(fā)利用提供理論依據(jù)。