荷葉化學(xué)成分的研究

高利興， 王麗明， 運(yùn)乃茹， 隋洪飛， 韓立峰*

(1.天津中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，天津 300150；2.天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 301617)

荷葉為睡蓮科蓮屬植物蓮NelumbonuciferaGaertn.的干燥葉，具有清暑化濕、升發(fā)清陽、涼血止血之功效，主要用于治療暑熱煩渴、暑濕泄瀉、脾虛泄瀉、血熱吐衄、便血崩漏等癥[1]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明荷葉在降壓、降脂等方面功效顯著，由于其為藥食同源的藥材，所以眾多減肥降脂保健品均含有荷葉。荷葉中含有的化學(xué)成分主要有生物堿、黃酮、降倍半萜、揮發(fā)油、有機(jī)酸等[2-4]。為進(jìn)一步闡明荷葉的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，為創(chuàng)新藥物和保健品的研究與開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)，對(duì)荷葉的化學(xué)成分進(jìn)行了分離純化研究，從該植物的70%乙醇提取物中分離得到9個(gè)化合物，其中化合物1～4、6～9為首次從蓮屬植物中分離得到。

1 材料

Bruker AV 400及500 M超導(dǎo)核磁共振波譜儀，內(nèi)標(biāo)為TMS(瑞士Bruker公司)；Agilent 6520系列質(zhì)譜儀(美國Agilent公司)；DLSB-25 L真空循環(huán)水泵 (鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司)；RE-52 A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)；VOS-301SD真空干燥箱(日本EYELA公司)；柱色譜硅膠(青島海洋化工有限公司)；柱色譜ODS填料(日本YMC公司，50 μm)。分析純二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇、甲醇及色譜純甲醇等有機(jī)溶劑(江蘇漢邦科技有限公司)；分析純氯仿、丙酮(新疆烏魯木齊飛躍試劑有限責(zé)任公司)。

荷葉藥材購買于安徽亳州中藥飲片廠，經(jīng)天津中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院藥學(xué)部胡永健專家鑒定為睡蓮科植物蓮NelumbonuciferaGaertn.的干燥葉，植物標(biāo)本存放于天津中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院藥學(xué)部標(biāo)本室。

2 提取與分離

干燥荷葉藥材5 kg，用70%乙醇回流提取3次，每次2 h，合并提取液，過濾，減壓濃縮，真空干燥，得干膏550 g。取500 g干膏加1 000 mL水懸浮，分別用等體積的二氯甲烷、乙酸乙酯和水飽和正丁醇萃取，每種溶劑萃取3次，合并各萃取層，減壓濃縮，真空干燥。

對(duì)二氯甲烷萃取物(80 g)進(jìn)行硅膠柱色譜分離，以石油醚-丙酮(100∶0～0∶100)梯度洗脫，薄層檢識(shí)，合并相同流分，共得到14個(gè)流分(Fr.C1～Fr.C14)。取Fr.C6(2.1 g)，經(jīng)ODS柱色譜，用甲醇-水(50%～100%)梯度洗脫，共得到14個(gè)流分(Fr.C6.1～Fr.C6.14)，F(xiàn)r.C6.2經(jīng)制備HPLC，55%甲醇分離，得化合物3(14 mg)，F(xiàn)r.C6.4經(jīng)Sephadex LH-20柱色譜，甲醇洗脫，得化合物2(16 mg)；Fr.C8(5.1 g)經(jīng)ODS柱色譜，用甲醇-水(30%～100%)梯度洗脫，共得到12個(gè)流分(Fr.C8.1～Fr.C8.12)，F(xiàn)r.C8.9經(jīng)制備HPLC純化，32%甲醇洗脫，得化合物4(12 mg)；Fr.C11(1.1 g)經(jīng)ODS柱色譜，用甲醇-水(40%～100%)梯度洗脫，共得到17個(gè)流分(Fr.C11.1～Fr.C11.17)，F(xiàn)r.C11.9經(jīng)制備HPLC分離，43%甲醇洗脫，得化合物1(7 mg)。

乙酸乙酯萃取物(100 g)，采用硅膠柱色譜，二氯甲烷-甲醇(10∶0～0∶10)梯度洗脫，薄層檢識(shí)，合并相同流分，得5個(gè)組分(Fr.E1～Fr.E5)，F(xiàn)r.E4(13.5 g)通過ODS柱色譜，依次用甲醇-水(30%～100%)梯度洗脫，共得到8個(gè)流分(Fr.E4.1～Fr.E4.8)，F(xiàn)r.E4.2經(jīng)Sephadex LH-20柱色譜分離，甲醇洗脫，分別得化合物5(27 mg)、6(36 mg)、9(22 mg)，F(xiàn)r.E4.3經(jīng)Sephadex LH-20柱色譜分離，甲醇洗脫，分別得化合物7(21 mg)、8(8 mg)。

3 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1：桔黃色粉末。TLC板上，紫外燈254 nm下有一很明顯的暗斑，用改良碘化鉍鉀溶液顯色呈黃色，推測該化合物可能為生物堿。1H-NMR(400 MHz，CDCl3)譜的高場區(qū)δ：2.69、3.82(each 1H，m，H2-4)與3.54、3.72(each 1H，m，H2-5)，結(jié)合1H-1H COSY譜，推斷為相鄰的2個(gè)亞甲基，除此之外，還有一組亞甲基信號(hào)δ：3.18(1H，dd，J=14.4，3.6 Hz，H-7)、3.66(1H，d，J=14.4 Hz，H-7)；在高場區(qū)還有一個(gè)明顯的甲基單峰δ：3.46(3H，s，N-CH3)；在低場區(qū)有3個(gè)單峰δ：5.92(1H，brs)、6.11(1H，brs)和6.60(1H，s，H-3)，結(jié)合HSQC譜，分別歸屬為一個(gè)亞甲二氧基(-OCH2O-)和一個(gè)孤立的苯環(huán)上的氫質(zhì)子信號(hào)(H-3)；此外，還可觀察到一組特征峰δ：7.26(1H，td，J=7.6，1.2 Hz，H-9)、7.30(1H，td，J=7.6，1.2 Hz，H-10)、7.32(1H，d，J=7.6 Hz，H-11)、8.06(1H，d，J=7.6 Hz，H-8)，根據(jù)偶合常數(shù)及化學(xué)位移值，可知為鄰二取代苯環(huán)上相鄰的4個(gè)氫信號(hào)。13C-NMR(100 MHz，CDCl3)譜結(jié)合DEPT譜，知該化合物中有7個(gè)季碳，4個(gè)仲碳，6個(gè)叔碳和1個(gè)甲基，在化學(xué)位移大于100×10-6的低場區(qū)，總共有13個(gè)碳，除去1個(gè)亞甲二氧基信號(hào)δ：101.1，其余為2個(gè)苯環(huán)上的碳信號(hào)δ：143.5(C-1)、117.1(C-1a)、121.2(C-1b)、147.8(C-2)、107.6(C-3)、124.5(C-3a)、133.4(C-7a)、127.0(C-8)、128.0(C-9)、128.5(C-10)、127.4(C-11)、130.3(C-11a)。高場區(qū)5個(gè)碳信號(hào)歸屬為δ：24.9(C-4)、65.1(C-5)、29.7(C-7)、71.2(C-6a)、58.5(N-CH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[5]報(bào)道基本一致，故鑒定為roemerineNα-oxide。

化合物2：棕色粉末。TLC板上，紫外燈254 nm下有一很明顯的暗斑，用10%硫酸乙醇溶液顯色呈黃色。1H-NMR(400 MHz，CDCl3)低場區(qū)的1組氫信號(hào)δ：7.53(2H，d，J=6.4 Hz，H-3′，5′)、7.54(1H，m，H-4′)、7.88(2H，d，J=6.4 Hz，H-2′，6′)提示結(jié)構(gòu)中存在一個(gè)單取代的苯環(huán)；低場區(qū)另存在2個(gè)單峰δ：6.66(1H，s，H-3)，6.62(1H，s，H-8)，在高場區(qū)有一個(gè)甲氧基信號(hào)δ：4.05(3H，s，6-OCH3)；13C-NMR(100 MHz，CDCl3)結(jié)合HSQC譜，知該化合物有8個(gè)季碳，7個(gè)叔碳和1個(gè)甲氧基，13C-NMR譜數(shù)據(jù)歸屬如下δ：164.1(C-2)、105.3(C-3)、183.0(C-4)、153.3(C-5)、130.4(C-6)、152.1(C-7)、93.4(C-8)、155.2(C-9)、105.9(C-10)、131.3(C-1′)、126.3(C-2′，6′)、129.1(C-3′，5′)、131.9(C-4′)、60.9(6-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[6]報(bào)道基本一致，故鑒定為千葉紙素-A。

化合物3：淡黃色粉末。TLC板上，紫外燈254 nm下有一暗斑，用10%硫酸乙醇溶液顯色呈黃色。1H-NMR(400 MHz，DMSO-d6)譜低場區(qū)的1組氫信號(hào)δ：7.62(2H，d，J=7.2 Hz，H-3′，5′)、7.63(1H，m，H-4′)、8.08(2H，dd，J=7.2，2.0 Hz，H-2′，6′)提示結(jié)構(gòu)中同樣存在一個(gè)單取代的苯環(huán)；低場區(qū)另存在2個(gè)單峰δ：7.00(1H，s，H-3)，6.32(1H，s，H-6)，在高場區(qū)有1個(gè)甲氧基信號(hào)δ：3.86(3H，s，8-OCH3)；13C-NMR(100 MHz，DMSO-d6)結(jié)合HSQC譜知有8個(gè)季碳信號(hào)，7個(gè)叔碳信號(hào)和1個(gè)甲氧基信號(hào)，13C-NMR譜數(shù)據(jù)歸屬如下δ：162.9(C-2)、105.0(C-3)、181.9(C-4)、156.2(C-5)、99.1(C-6)、157.4(C-7)、127.7(C-8)、149.5(C-9)、103.6(C-10)、130.8(C-1′)、126.2(C-2′，6′)、129.2(C-3′，5′)、132.0(C-4′)、60.9(8-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[6]報(bào)道基本一致，故鑒定為漢黃芩素。

化合物4：黃色粉末。TLC板上，紫外燈254 nm下有一很明顯的暗斑，用體積分?jǐn)?shù)為10%的硫酸乙醇溶液顯色呈淡黃色。1H-NMR(400 MHz，CD3OD)低場區(qū)可以觀測到3組氫信號(hào)δ：7.11(1H，s，H-2)、6.79(1H，d，J=8.0 Hz，H-5)、7.02(1H，d，J=8.0 Hz，H-6)提示結(jié)構(gòu)中存在一個(gè)ABX自旋耦合系統(tǒng)的苯環(huán)；δ：7.05(2H，d，J=7.6 Hz，H-2′，6′)、6.72(2H，d，J=7.6 Hz，H-3′，5′)提示結(jié)構(gòu)中還存在AA’BB’自旋耦合系統(tǒng)的苯環(huán)；δ：7.43(1H，d，J=16.0 Hz，H-7), 6.40(1H，d，J=16.0 Hz，H-8)提示存在一個(gè)反式雙鍵；在高場區(qū)有1個(gè)甲氧基信號(hào)δ：3.88(3H，s，3-OCH3)，以及2個(gè)亞甲基信號(hào)δ：2.75(2H，t，J=7.6 Hz，H-7′)、δ：3.46(2H，t，J=7.6 Hz，H-8′)；13C-NMR(100 MHz，CD3OD)結(jié)合HSQC譜知有6個(gè)季碳信號(hào)，9個(gè)叔碳信號(hào)，2個(gè)仲碳和1個(gè)甲氧基信號(hào)，具體13C-NMR譜數(shù)據(jù)如下δ：128.2(C-1)、111.5(C-2)、149.3(C-3)、149.9(C-4)、116.5(C-5)、123.3(C-6)、142.1(C-7)、118.7(C-8)、169.2(C-9)、131.3(C-1′)、130.8(C-2′，6′)、116.3(C-3′，5′)、156.9(C-4′)、35.8(C-7′)、42.6(C-8′)、56.4(3-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[7]報(bào)道基本一致，故鑒定為反-N-(4-羥基苯乙基)-阿魏酸酰胺。

化合物5：白色無定形粉末，易溶于甲醇。在正離子ESI-MS譜中，可以看到準(zhǔn)分子離子峰m/z：155.0[M + H]+，推測其分子量為154。在1H-NMR(400 MHz，DMSO-d6)譜低場區(qū)，可以看到一組ABX偶合系統(tǒng)芳香氫質(zhì)子信號(hào)δ：6.78(1H，d，J=8.0 Hz，H-5)、7.29(1H，dd，J=2.0，8.0 Hz，H-6)、7.34(1H，d，J=2.0 Hz，H-2)；在13C-NMR(100 MHz，DMSO-d6)譜上出現(xiàn)6個(gè)相應(yīng)的芳香碳信號(hào)δ：121.6(C-1)、116.5(C-2)、144.8(C-3)、149.9(C-4)、115.1(C-5)、121.8(C-6)和一個(gè)羧基碳信號(hào)δ：167.2。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[8]報(bào)道基本一致，故鑒定為原兒茶酸。

化合物6：白色無定形粉末，易溶于甲醇。在正離子ESI-MS譜中，給出準(zhǔn)分子離子峰m/z：181.1[M + H]+，推測其分子量為180。1H-NMR(400 MHz，CD3OD)譜顯示一組ABX芳香氫質(zhì)子信號(hào)δ：6.78(1H，d，J=8.0 Hz，H-5)、6.94(1H, dd,J=1.2，8.0 Hz，H-6)、7.05(1H，d，J=1.2 Hz，H-2)和一組反式烯氫質(zhì)子信號(hào)δ：6.22(1H，d，J=16.0 Hz，H-8)、7.54(1H，d，J=16.0 Hz，H-7)；在13C-NMR(100 MHz，CD3OD)譜上出現(xiàn)六個(gè)相應(yīng)的芳香碳信號(hào)δ：127.8(C-1)、115.2(C-2)、146.8(C-3)、149.4(C-4)、116.5(C-5)、122.9(C-6)和一組雙鍵碳信號(hào)δ：147.1(C-7)、115.5(C-8)，此外，還可觀測到一個(gè)羧基碳信號(hào)δ：171.1(C-9)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[9]報(bào)道基本一致，故鑒定為咖啡酸。

化合物7：棕色油狀物。TLC板上，紫外燈254 nm下有一暗斑，用10%硫酸乙醇溶液顯色呈淡紫色。高分辨Q-TOF-MS給出其準(zhǔn)分子離子峰m/z：181.084 2[M+H]+，確定其分子式C10H12O3。1H-NMR(500 MHz，DMSO-d6)在低場區(qū)有3組特征信號(hào)δ：7.00(1H，d，J=1.5 Hz，H-2)、6.80(1H，dd，J=2.0，8.0 Hz，H-6)、6.72(1H，d，J=8.0 Hz，H-5)，說明化合物中存在一個(gè)1,3,4-三取代的苯環(huán)。在中低場區(qū)觀測到有2組d峰δ：6.42和6.19，計(jì)算其偶合常數(shù)都為16.0 Hz，知該化合物中含有一個(gè)反式雙鍵。在高場區(qū)有2組信號(hào)，一個(gè)是dd峰，為δ：4.08(2H，dd，J=1.5，5.5 Hz),一個(gè)是單峰為δ：3.78，根據(jù)其化學(xué)位移值和峰面積，知前者為亞甲基，后者為甲氧基信號(hào)；13C-NMR(125 MHz，DMSO-d6)譜中顯示有10個(gè)明顯的碳信號(hào)，在低場區(qū)的8個(gè)碳信號(hào)，結(jié)合上面氫譜，知為苯環(huán)和反式烯氫的碳信號(hào)。再觀察HMBC譜δ：129.5(C-7)與δ：7.00(H-2)和6.80(H-6)有耦合，δ：129.0與δ：6.72(H-5)和6.19(H-8)有耦合，則推出δ：129.0為反式雙鍵與苯環(huán)的連接處，即為C-1；甲氧基的氫信號(hào)δ：3.78與148.2有遠(yuǎn)程耦合，則知甲氧基連在C-3位上，13C-NMR譜數(shù)據(jù)歸屬如下δ：129.0(C-1)、110.3(C-2)、148.2(C-3)、146.7(C-4)、116.0(C-5)、119.9(C-6)、129.5(C-7)、128.0(C-8)、62.2(C-9)、56.1(3-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[10]報(bào)道基本一致，故鑒定為松柏醇。

化合物8：淡黃色粉末。TLC板上，紫外燈254 nm下有一暗斑，用10%硫酸乙醇溶液顯色呈紫紅色。高分辨Q-TOF-MS(positive and negative)分別給出其準(zhǔn)分子離子峰m/z：249.073 5[M+Na]+和225.077 5[M-H]-，確定其分子式C11H14O5。1H-NMR(500 MHz，DMSO-d6)譜的低場區(qū)有1個(gè)孤立的單峰δ：7.24(2H，s，H-2′，6′)，推測可能為烯氫或苯環(huán)上的氫；在中高場區(qū)有一明顯的單峰δ：3.83(6H，s，3′，5′-OCH3)，根據(jù)峰面積知為2個(gè)甲氧基信號(hào)；在高場區(qū)有2個(gè)三重峰δ：3.77(2H，t，J=6.0 Hz，H-3)和3.10(2H，t，J=6.0 Hz，H-2)則為飽和碳上的氫信號(hào)。13C-NMR(125 MHz，DMSO-d6)譜中總共有8根碳信號(hào)，結(jié)合高分辨質(zhì)譜得出的分子式知譜圖中有3個(gè)重疊信號(hào)δ：147.5、106.0和56.0，則推斷化合物中有對(duì)稱結(jié)構(gòu)。從DEPT譜圖中可知該化合物中有4個(gè)季碳，2個(gè)仲碳，2個(gè)叔碳，2個(gè)甲氧基。通過HSQC譜和HMBC譜，確定了各氫碳之間的對(duì)應(yīng)關(guān)系和遠(yuǎn)程關(guān)系。從HMBC譜中可觀察到δ：147.5(C-3′,5′)與δ：7.24(H-2′, 6′)、δ3.83(3′, 5′-OCH3)有遠(yuǎn)程耦合，則知甲氧基連在碳3′和5′上；δ：140.8和127.4分別與δ：7.24都有遠(yuǎn)程耦合，則推出δ：140.8為C-4′位，且連有一個(gè)羥基，而δ：127.4為C-1′位；同時(shí)在HMBC譜圖上也觀察到酮羰基信號(hào)δ：197.2與7.24(2H，s， H-2′、 6′)、3.77(2H，t，J=6.0 Hz，H-3)和3.10(2H，t，J=6.0 Hz，H-2)有遠(yuǎn)程耦合，則推出δ：197.2(C-1)連在C-1′位。13C-NMR譜數(shù)據(jù)歸屬如下δ：197.2(C-1)、40.8(C-2)、57.2(C-3)、127.4(C-1′)、106.0(C-2′)、147.5(C-3′)140.8(C-4′)、147.5(C-5′)、106.0(C-6′)、56.0(3′-CH3)、56.0(5′-CH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[11]報(bào)道基本一致，故鑒定為3-hydroxy-1-(3′,5′-dimethoxy-4′-hydroxyphyenyl)propan-1-one。

化合物9：深棕色粉末。TLC板上，紫外燈254 nm下有一暗斑，用10%硫酸乙醇溶液顯色呈淡黃色。高分辨Q-TOF-MS給出其準(zhǔn)分子離子峰m/z： 181.051 7[M-H]-，確定其分子式C9H10O4。1H-NMR(500 MHz，DMSO-d6)在低場區(qū)有三組特征性的信號(hào)δ：7.36(1H，d，J=2.0 Hz，H-2)，7.31(1H，dd，J=2.0，8.5 Hz，H-6)，6.80(1H，d，J=8.5 Hz，H-5)，提示為ABC偶合系統(tǒng)，表明化合物中含有一個(gè)1,3,4-三取代的苯環(huán)。在中高場區(qū)和高場區(qū)可觀察到另2組特征信號(hào)： 4.22(2H，q，J=7.5 Hz，-OCH2)和 1.28(3H，t，J=7.5 Hz，CH3)，知為乙氧基質(zhì)子信號(hào)。13C-NMR(125 MHz，DMSO-d6)結(jié)合DEPT譜知有3個(gè)季碳信號(hào)，1個(gè)仲碳信號(hào)，4個(gè)叔碳信號(hào)和1個(gè)甲基信號(hào)。低場區(qū)顯示有7個(gè)碳信號(hào)，其中δ：165.6為酯羰基信號(hào)，其余6個(gè)為苯環(huán)上的碳信號(hào)；中高場區(qū)的δ：59.9為亞甲基信號(hào)，高場區(qū)的δ：14.2為甲基信號(hào)。13C-NMR譜數(shù)據(jù)歸屬如下：δ：120.7(C-1)、116.2(C-2)、145.0(C-3)、150.3(C-4)、115.2(C-5)、121.6(C-6)、165.6(C-7)、59.9(C-8)、14.2(C-9)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[12-13]報(bào)道基本一致，故鑒定為3,4-二羥基苯甲酸乙酯。

4 結(jié)論

從荷葉70%乙醇提取物中分離鑒定了9個(gè)化合物，化合物1～4、6～9為首次從蓮屬植物中分離得到。荷葉具有廣泛的藥理作用，尤其在減肥、降脂方面具有廣闊的應(yīng)用前景，而無論是新藥開發(fā)還是保健食品的研發(fā)都需要對(duì)荷葉的物質(zhì)基礎(chǔ)進(jìn)行系統(tǒng)研究，以期為荷葉資源的深入開發(fā)利用提供依據(jù)。