不同產(chǎn)區(qū)掌葉大黃酒蒸前后指紋圖譜的建立及3種差異性成分的含量測(cè)定

榮曉惠 劉艷 王秋茹 李紫薇 匡海學(xué) 楊炳友

中圖分類(lèi)號(hào) R284 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號(hào) 1001-0408（2022）03-0280-07

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2022.03.05

摘 要 目的 建立掌葉大黃酒蒸前后高效液相色譜（HPLC）指紋圖譜，并測(cè)定其中3種差異性成分的含量。方法 采用HPLC法建立掌葉大黃（酒蒸前）、熟大黃（酒蒸后）各15批樣品的指紋圖譜并進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)，通過(guò)主成分分析、聚類(lèi)分析、偏最小二乘法-判別分析、正交偏最小二乘法-判別分析對(duì)指紋圖譜進(jìn)行化學(xué)模式識(shí)別分析。對(duì)30批樣品中的3種差異性成分沒(méi)食子酸、白藜蘆醇-4′-O-葡萄糖苷、白藜蘆醇-4′-O-（6″-沒(méi)食子?；?葡萄糖苷進(jìn)行含量測(cè)定。結(jié)果 指紋圖譜研究中掌葉大黃標(biāo)定了48個(gè)共有峰，熟大黃標(biāo)定了47個(gè)共有峰，并指認(rèn)出17個(gè)共有峰。聚類(lèi)分析與主成分分析顯示，青海產(chǎn)掌葉大黃酒蒸前后均與四川、甘肅產(chǎn)掌葉大黃酒蒸前后存在顯著差異。含量測(cè)定結(jié)果顯示，青海產(chǎn)掌葉大黃酒蒸前后3種差異性成分的含量均高于其他2個(gè)產(chǎn)區(qū)樣品，各產(chǎn)區(qū)熟大黃中沒(méi)食子酸含量均高于掌葉大黃，各產(chǎn)區(qū)掌葉大黃中的白藜蘆醇-4′-O-葡萄糖苷、白藜蘆醇-4′-O-（6″-沒(méi)食子?；?葡萄糖苷含量均高于熟大黃。結(jié)論 該研究建立的指紋圖譜及含量測(cè)定方法能夠快速、科學(xué)、準(zhǔn)確地評(píng)價(jià)不同產(chǎn)區(qū)掌葉大黃及其酒蒸炮制品的質(zhì)量，為掌葉大黃炮制規(guī)范及質(zhì)量控制提供依據(jù)。

關(guān)鍵詞 掌葉大黃;熟大黃;高效液相色譜法;指紋圖譜;含量測(cè)定;差異性成分

Establishment of fingerprint and content determination of 3 differential components in Rheum palmatum before and after steaming with wine derived from different producing areas

RONG Xiaohui，LIU Yan，WANG Qiuru，LI Ziwei，KUANG Haixue，YANG Bingyou（School of Pharmacy， Heilongjiang University of Chinese Medicine/Key Laboratory of Basic and Applied Research of Northern Chinese Materia Medica of Ministry of Education， Harbin 150040， China）

ABSTRACT? ?OBJECTIVE To establish HPLC fingerprint of Rheum palmatum before and after steaming with wine， and to determine the contents of 3 differential components. METHODS HPLC method was used to establish the fingerprints of 15 batches of R. palmatum （before wine-steaming） and prepared rhubarb （after wine-steaming） and the similarity evaluation was conducted. The chemical pattern recognition analysis was carried out by principal component analysis， cluster analysis， partial least squares- discriminant analysis and orthogonal partial least squares-discriminant analysis. The contents of gallic acid， resveratrol-4′-O- glucoside and resveratrol-4′-O-（6″-galloyl）-glucoside in 30 batches of samples were determined. RESULTS In the fingerprint study， 48 common peaks were demarcated for R. palmatum and 47 for prepared rhubarb as well as 17 common peaks were identified by reference substance. Cluster analysis and principal component analysis showed that R. palmatum derived from Qinghai before and after steaming with wine could be distinguished from those from Sichuan and Gansu. The results of content determination showed that the contents of 3 differential components in R. palmatum derived from Qinghai before and after steaming with wine were higher than those from other two production areas; the contents of gallic acid in prepared rhubarb derived from those production areas were higher than R. palmatum; the contents of resveratrol-4′-O-glucoside and resveratrol-4′-O-（6″-galloyl）-glucoside in R. palmatum derived from those production areas were higher than prepared rhubarb. CONCLUSIONS Fingerprint and content determination method established in this study can quickly， scientifically and accurately evaluate the quality of R. palmatum from different producing areas before and after wine steaming， which provide a basis for the processing specification and quality control of R. palmatum.

KEYWORDS? ?Rheum palmatum; prepared rhubarb; HPLC; fingerprint; content determination; differential component

大黃為蓼科植物掌葉大黃Rheum palmatum L.、唐古特大黃Rheum tanguticum Maxim. ex Balf.或藥用大黃Rheum officinale Baill.的干燥根和根莖[1]，主產(chǎn)于甘肅、青海、四川等地，具有攻積瀉下、涼血解毒、利濕退黃等功效[2]。大黃的化學(xué)成分復(fù)雜，主要包括蒽醌類(lèi)、蒽酮類(lèi)、鞣質(zhì)類(lèi)、苯丁酮類(lèi)和二苯乙烯類(lèi)，其中蒽醌類(lèi)成分中的結(jié)合蒽醌和蒽酮類(lèi)成分中的番瀉苷類(lèi)具有良好的瀉下作用，游離蒽醌具有良好的抑菌、抗腫瘤作用，鞣質(zhì)類(lèi)成分中的兒茶素和沒(méi)食子酸具有良好的止血作用，苯丁酮類(lèi)成分中的蓮花掌苷和異蓮花掌苷是大黃抗炎鎮(zhèn)痛的主要成分，二苯乙烯類(lèi)成分是大黃清除自由基和抗衰老的主要成分[3-5]。對(duì)于大黃、熟大黃的質(zhì)量控制，2020年版《中華人民共和國(guó)藥典》（以下簡(jiǎn)稱(chēng)《中國(guó)藥典》）中僅對(duì)其中的游離蒽醌和總蒽醌含量制定了標(biāo)準(zhǔn)，但通過(guò)臨床及藥理作用研究發(fā)現(xiàn)，大黃酒蒸為熟大黃后在減緩瀉下作用、減少胃氣損傷的同時(shí)，還能增強(qiáng)活血化瘀之功效，這不僅與蒽醌類(lèi)成分有關(guān)，還與蒽酮類(lèi)、鞣質(zhì)類(lèi)、苯丁酮類(lèi)、二苯乙烯類(lèi)成分的變化有關(guān)[6-7]。大黃在《中國(guó)藥典》中共收載3個(gè)基原，其中掌葉大黃較其他兩個(gè)基原的大黃主產(chǎn)地資源豐富，采收較容易，資源易得到保證，且在臨床應(yīng)用廣泛[8-9]。近年來(lái)，雖有大量關(guān)于不同產(chǎn)地掌葉大黃指紋圖譜的研究，但是僅局限于對(duì)蒽醌類(lèi)、蒽酮類(lèi)及鞣質(zhì)類(lèi)成分的質(zhì)量控制[10-13]，對(duì)其炮制品的研究也局限于同一產(chǎn)地甚至同一批次各炮制品炮制前后的差異性成分分析[14]，目前仍缺乏整體綜合評(píng)價(jià)掌葉大黃酒蒸前后質(zhì)量的方法。本課題組通過(guò)前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)不同產(chǎn)地掌葉大黃中沒(méi)食子酸、白藜蘆醇-4′-O-葡萄糖苷、白藜蘆醇-4′-O-（6″-沒(méi)食子?；?葡萄糖苷在酒蒸前后存在著較大的差異且含量較高可測(cè)，因此本研究通過(guò)對(duì)蒽醌類(lèi)、蒽酮類(lèi)、苯丁酮類(lèi)、二苯乙烯類(lèi)、鞣質(zhì)類(lèi)共5類(lèi)主要成分的定性分析和沒(méi)食子酸、白藜蘆醇-4′-O-葡萄糖苷、白藜蘆醇-4′-O-（6″-沒(méi)食子酰基）-葡萄糖苷3種差異性成分的定量分析以及對(duì)不同產(chǎn)區(qū)掌葉大黃酒蒸前后高效液相色譜（HPLC）指紋圖譜的比較，探討不同產(chǎn)區(qū)掌葉大黃酒蒸前后化學(xué)成分的差異，為掌葉大黃的規(guī)范化炮制生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器有2695-2998型HPLC儀（美國(guó)Waters公司），N-1300D-WB型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（日本東京理化器械株式會(huì)社），AL204型萬(wàn)分之一電子分析天平（上海梅特勒-托利多國(guó)際貿(mào)易有限公司），KQ-250E型超聲波清洗器（昆山超聲儀器有限公司），YXQ-LS-50A型立式壓力蒸汽滅菌器（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）等。

1.2 主要藥品與試劑

沒(méi)食子酸（批號(hào)CHB180114，純度≥98%）、兒茶素（批號(hào)CHB180809，純度≥98%）、番瀉苷A（批號(hào)CHB180729，純度≥98%）、蘆薈大黃素-8-O-葡萄糖苷（批號(hào)CHB190115，純度≥98%）、大黃酸-8-O-β-D-葡萄糖苷（批號(hào)CHB180726，純度≥98%）、大黃酚-8-O-β-D-葡萄糖苷（批號(hào)CHB180726，純度≥98%）、大黃素-8-β-D-吡喃葡萄糖苷（批號(hào)CHB180727，純度≥98%）、大黃素甲醚-8-O-β-D-葡萄糖苷（批號(hào)CHB201109，純度≥98%）對(duì)照品均購(gòu)自成都克洛瑪生物科技有限公司;大黃酸（批號(hào)HR152461198，純度≥98%）、大黃素（批號(hào)HR4919S1，純度≥98%）、大黃酚（批號(hào)HR19415S1，純度≥98%）、蘆薈大黃素（批號(hào)HR16119S1，純度≥98%）、大黃素甲醚（批號(hào)HR20425W1，純度≥98%）對(duì)照品均購(gòu)自寶雞晨光生物科技有限公司;蓮花掌苷（批號(hào)YL19121001，純度≥98%）、異蓮花掌苷（批號(hào)YL20012123，純度≥98%）、白藜蘆醇-4′-O-葡萄糖苷（批號(hào)YL20061703，純度≥98%）、白藜蘆醇-4′-O-（6″-沒(méi)食子酰基）-葡萄糖苷（批號(hào)YL20030506，純度≥98%）對(duì)照品均購(gòu)自上海一林生物科技有限公司。

15批掌葉大黃飲片均購(gòu)自廣州采芝林藥業(yè)有限公司，編號(hào)為S1～S15（表1），經(jīng)黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院藥用植物教研室樊銳鋒教授鑒定為蓼科植物掌葉大黃R. palmatum L.的干燥根和根莖。結(jié)合《中國(guó)藥典》[1]并參考文獻(xiàn)[6]，取大黃飲片100 g，加黃酒30 g，悶潤(rùn)4 h，蒸制溫度105 ℃，蒸制時(shí)間10 h，制備得熟大黃（與掌葉大黃樣品一一對(duì)應(yīng)編號(hào)為ZS1～ZS15），并根據(jù)《中國(guó)藥典》方法[1]對(duì)掌葉大黃、熟大黃進(jìn)行含量測(cè)定后發(fā)現(xiàn)其游離蒽醌含量分別不低于0.35%、0.50%，總蒽醌含量均不低于1.50%，均為合格樣品。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱為Symmtrey C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）;流動(dòng)相為甲醇（A）-0.1%磷酸溶液（B），梯度洗脫（0～20 min，5%A→37%A;20～59 min，37%A→76%A;59～61 min，76%A→85%A;61～75 min，85%A;75～77 min，85%A→100%A）;流速為1.0 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng)為280 nm;柱溫為30 ℃;進(jìn)樣量為10 μL。

2.2 不同產(chǎn)區(qū)掌葉大黃酒蒸前后HPLC指紋圖譜的建立與分析

2.2.1 混合對(duì)照品溶液的制備 分別取對(duì)照品沒(méi)食子酸、兒茶素、番瀉苷A、蘆薈大黃素-8-O-葡萄糖苷、大黃酸-8-O-β-D-葡萄糖苷、大黃酚-8-O-β-D-葡萄糖苷、大黃素-8-β-D-吡喃葡萄糖苷、大黃素甲醚-8-O-β-D-葡萄糖苷、大黃酸、大黃素、大黃酚、蘆薈大黃素、大黃素甲醚、蓮花掌苷、異蓮花掌苷、白藜蘆醇-4′-O-葡萄糖苷、白藜蘆醇-4′-O-（6″-沒(méi)食子?；?葡萄糖苷適量，精密稱(chēng)定，用甲醇溶解并稀釋?zhuān)渲瞥少|(zhì)量濃度分別為0.190 1、0.165 3、0.082 6、0.082 6、0.107 4、0.082 6、0.082 6、0.082 6、0.082 6、0.082 6、0.107 4、0.082 6、0.082 6、0.148 8、0.082 6、0.061 1、0.061 1 mg/mL的混合對(duì)照品溶液，過(guò)0.22 μm微孔濾膜，即得。

2.2.2 供試品溶液的制備 精密稱(chēng)取飲片粉末（過(guò)三號(hào)篩）1.0 g，置于50 mL具塞錐形瓶中，加甲醇25 mL，稱(chēng)定質(zhì)量，超聲（600 W，40 kHz）30 min后，補(bǔ)足減失質(zhì)量，搖勻，過(guò)濾，取濾液，用0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾，即得。

2.2.3 精密度試驗(yàn) 精密稱(chēng)取S6樣品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，以沒(méi)食子酸為參照峰，計(jì)算各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。結(jié)果，各共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD均小于3.00%（n=6），表明儀器進(jìn)樣精密度良好。

2.2.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密稱(chēng)取S6樣品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別在室溫下放置0、2、4、6、12、24 h時(shí)按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，以沒(méi)食子酸為參照峰，計(jì)算各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。結(jié)果，各共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD均小于3.00%（n=6），表明供試品溶液在室溫24 h內(nèi)是穩(wěn)定的。

2.2.5 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱(chēng)取S6樣品6份，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，以沒(méi)食子酸為參照峰，計(jì)算各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。結(jié)果，各共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD均小于3.00%（n=6），表明該方法重復(fù)性好。

2.2.6 各批次掌葉大黃和熟大黃HPLC指紋圖譜建立、相似度評(píng)價(jià)及色譜峰指認(rèn) 取15批掌葉大黃、15批熟大黃樣品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。將所得色譜數(shù)據(jù)導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012版）》，采用中位數(shù)法，設(shè)定時(shí)間窗為0.20 min，分別以S6、ZS6為參照?qǐng)D譜，經(jīng)多點(diǎn)校正后，生成指紋圖譜共有模式，并以此作為對(duì)照指紋圖譜（R、R′）。結(jié)果顯示，掌葉大黃有48個(gè)共有峰，熟大黃有47個(gè)共有峰，詳見(jiàn)圖1、圖2。

采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012版）》，對(duì)掌葉大黃酒蒸前后的各樣品指紋圖譜進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)，結(jié)果見(jiàn)表2。甘肅、四川產(chǎn)掌葉大黃相似度為0.779～0.840，青海產(chǎn)掌葉大黃相似度為0.949～0.978，甘肅、青海、四川產(chǎn)熟大黃相似度為0.873～0.972，表明各產(chǎn)區(qū)的掌葉大黃具有相似的色譜信息，且甘肅、四川產(chǎn)掌葉大黃與青海產(chǎn)掌葉大黃之間存在著一定差異，熟大黃的質(zhì)量則較均一穩(wěn)定。

根據(jù)掌葉大黃、熟大黃樣品的HPLC指紋圖譜生成結(jié)果，選擇圖譜中峰面積較大且分離度較好的色譜峰作為特征峰。結(jié)果顯示，掌葉大黃、熟大黃共有62個(gè)特征峰，與混合對(duì)照品溶液HPLC圖（圖3）進(jìn)行比對(duì)，共指認(rèn)出17個(gè)色譜峰，分別為5號(hào)峰（沒(méi)食子酸）、14號(hào)峰（兒茶素）、22號(hào)峰（白藜蘆醇-4′-O-葡萄糖苷）、24號(hào)峰（異蓮花掌苷）、25號(hào)峰（蓮花掌苷）、27號(hào)峰（蘆薈大黃素-8-O-葡萄糖苷）、29號(hào)峰[白藜蘆醇-4′-O-（6″-沒(méi)食子?；?葡萄糖苷]、30號(hào)峰（大黃酸-8-O-β-D-葡萄糖苷）、33號(hào)峰（番瀉苷A）、43號(hào)峰（大黃酚-8-O-β-D-葡萄糖苷）、45號(hào)峰（大黃素-8-β-D-吡喃葡萄糖苷）、49號(hào)峰（大黃素甲醚-8-O-β-D-葡萄糖苷）、50號(hào)峰（蘆薈大黃素）、55號(hào)峰（大黃酸）、59號(hào)峰（大黃素）、60號(hào)峰（大黃酚）、61號(hào)峰（大黃素甲醚）。

2.3 化學(xué)模式識(shí)別分析

2.3.1 聚類(lèi)分析 以15批不同產(chǎn)區(qū)掌葉大黃酒蒸前后的62個(gè)特征峰峰面積為變量，采用組間聯(lián)接，借助SPSS 23.0軟件進(jìn)行系統(tǒng)聚類(lèi)分析（cluster analysis，CA）[15]，結(jié)果見(jiàn)圖4。從圖4可知，當(dāng)平方歐式距離為5時(shí)，30批樣品被明顯聚為4類(lèi)：青海產(chǎn)掌葉大黃（S6～S9）聚為一類(lèi)，青海產(chǎn)掌葉大黃（S10）聚為一類(lèi)，青海產(chǎn)熟大黃（ZS6～ZS10）聚為一類(lèi)，甘肅、四川產(chǎn)掌葉大黃及熟大黃（S1～S5、S11～S15、ZS1～ZS5、ZS11～ZS15）聚為一類(lèi);當(dāng)平方歐式距離為25時(shí)，30批樣品被明顯聚為2類(lèi)：青海產(chǎn)掌葉大黃（S6～S10）單獨(dú)聚為一類(lèi)，其余樣品聚為一類(lèi)。

2.3.2 主成分分析 主成分分析（principal component analysis，PCA）可快速表征樣本的差異信息[16]。將15批不同道地產(chǎn)區(qū)掌葉大黃酒蒸前后指紋圖譜的62個(gè)特征峰峰面積組成62×30階矩陣導(dǎo)入SIMCA-P14.1軟件，建立PCA模型，繪制PCA散點(diǎn)圖。結(jié)果顯示，30批樣品大體可聚為兩類(lèi)：青海產(chǎn)掌葉大黃（S6～S10）聚為一類(lèi)，其余樣品聚為一類(lèi)。其結(jié)果與CA結(jié)果基本一致，詳見(jiàn)圖5。

2.3.3 偏最小二乘法-判別分析 由相似度、CA和PCA結(jié)果可知，青海產(chǎn)區(qū)的掌葉大黃與其他2個(gè)產(chǎn)區(qū)的掌葉大黃存在著明顯區(qū)別，因此選擇偏最小二乘法-判別分析（partial least squares-discriminant analysis，PLS-DA）[15]對(duì)甘肅、青海、四川3個(gè)產(chǎn)區(qū)的掌葉大黃及熟大黃進(jìn)行產(chǎn)地差異性成分表征。

將15批不同產(chǎn)區(qū)掌葉大黃的48個(gè)共有峰峰面積導(dǎo)入SIMCA-P14.1軟件，進(jìn)行PLS-DA分析。結(jié)果顯示，自變量累積解釋能力參數(shù)（R2X）為0.993，因變量累積解釋能力參數(shù)（R2Y）為0.995，預(yù)測(cè)能力參數(shù)（Q2）為0.994，均大于0.5，表明該模型擬合效果較好[17]。以變量投影重要性（variable importance in the projection，VIP）值>1為標(biāo)準(zhǔn)，篩選質(zhì)量差異標(biāo)志物。結(jié)果共得到17個(gè)差異性成分，依次為峰32、峰49（大黃素甲醚-8-O-β-D-葡萄糖苷）、峰25（蓮花掌苷）、峰59（大黃素）、峰23、峰45（大黃素-8-β-D-吡喃葡萄糖苷）、峰29[白藜蘆醇-4′-O-（6″-沒(méi)食子酰基）-葡萄糖苷]、峰34、峰14（兒茶素）、峰24（異蓮花掌苷）、峰43（大黃酚-8-O-葡萄糖苷）、峰33（番瀉苷A）、峰27（蘆薈大黃素-8-O-葡萄糖苷）、峰4、峰38、峰30（大黃酸-8-O-β-D-葡萄糖苷）、峰5（沒(méi)食子酸），詳見(jiàn)圖6。

將15批不同產(chǎn)區(qū)熟大黃的47個(gè)共有峰峰面積導(dǎo)入SIMCA-P14.1軟件，進(jìn)行PLS-DA分析。結(jié)果顯示，R2X為0.974，R2Y為0.990，Q2為0.979，均大于0.5，表明該模型預(yù)測(cè)能力好[17]。以VIP值>1為標(biāo)準(zhǔn)，篩選質(zhì)量差異標(biāo)志物。結(jié)果共得到14個(gè)差異性成分，依次為峰59（大黃素）、峰37、峰60（大黃酚）、峰5（沒(méi)食子酸）、峰55（大黃酸）、峰49（大黃素甲醚-8-O-β-D-葡萄糖苷）、峰54、峰50（蘆薈大黃素）、峰7、峰43（大黃酚-8-O-葡萄糖苷）、峰27（蘆薈大黃素-8-O-葡萄糖苷）、峰61（大黃素甲醚）、峰45（大黃素-8-β-D-吡喃葡萄糖苷）、峰24（異蓮花掌苷），詳見(jiàn)圖7。

2.3.4 正交偏最小二乘法-判別分析 將15批不同產(chǎn)區(qū)掌葉大黃酒蒸前后指紋圖譜的62個(gè)特征峰峰面積導(dǎo)入SIMCA-P14.1軟件，進(jìn)行有監(jiān)督模式的正交偏最小二乘法-判別分析（orthogonal partial least squares- discriminant analysis，OPLS-DA）[18]，分析各批次掌葉大黃酒蒸前后的差異。結(jié)果顯示，R2X為0.916，R2Y為0.951，Q2為0.940，均大于0.5。以VIP值>1為參考值得到22個(gè)差異性成分，依次為峰45（大黃素-8-β-D-吡喃葡萄糖苷）、峰29[白藜蘆醇-4′-O-（6″-沒(méi)食子?；?葡萄糖苷]、峰32、峰14（兒茶素）、峰37、峰5（沒(méi)食子酸）、峰38、峰27（蘆薈大黃素-8-O-葡萄糖苷）、峰22（白藜蘆醇-4′-O-葡萄糖苷）、峰30（大黃酸-8-O-β-D-葡萄糖苷）、峰7、峰25（蓮花掌苷）、峰34、峰33（番瀉苷A）、峰43（大黃酚-8-O- β-D-葡萄糖苷）、峰23、峰36、峰4、峰46、峰20、峰19、峰41，詳見(jiàn)圖8。

2.4 沒(méi)食子酸、白藜蘆醇-4′-O-葡萄糖苷、白藜蘆醇-4′-O-（6″-沒(méi)食子?；?葡萄糖苷的含量測(cè)定

2.4.1 3種成分混合對(duì)照品貯備液的制備 分別取沒(méi)食子酸、白藜蘆醇-4′-O-葡萄糖苷、白藜蘆醇-4′-O-（6″-沒(méi)食子?；?葡萄糖苷對(duì)照品適量，精密稱(chēng)定，用甲醇溶解并稀釋?zhuān)渲瞥少|(zhì)量濃度分別為1.875 0、0.350 0、1.100 0 mg/mL的混合對(duì)照品貯備液。

2.4.2 線性關(guān)系考察 分別精密吸取“2.4.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品貯備液（6號(hào)工作液）各1.5 mL，加甲醇稀釋至2、3、5、30、75 mL得5、4、3、2、1號(hào)工作液。精密吸取上述工作液（1～6號(hào)）各10 μL，按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。以待測(cè)成分質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X）、對(duì)應(yīng)峰面積為縱坐標(biāo)（Y）作線性回歸，得到?jīng)]食子酸、白藜蘆醇-4′-O-葡萄糖苷、白藜蘆醇-4′-O-（6″-沒(méi)食子?；?葡萄糖苷的回歸方程分別為Y=10 510 614.561 6X- 219 016.339 0（r=0.999 9）、Y=24 643 758.406 3X- 101 355.909 8（r=0.999 9）、Y=15 107 174.438 8X- 188 775.455 4（r=0.999 9），其檢測(cè)質(zhì)量濃度的線性范圍分別為0.037 5～1.875 0、0.007 0～0.350 0、0.022 0～1.100 0 mg/mL。

2.4.3 精密度試驗(yàn) 精密吸取“2.4.2”項(xiàng)下4號(hào)工作液，按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積。結(jié)果顯示，沒(méi)食子酸、白藜蘆醇-4′-O-葡萄糖苷、白藜蘆醇-4′-O-（6″-沒(méi)食子?；?葡萄糖苷峰面積的RSD分別為2.51%、2.76%、2.69%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.4.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一樣品（S6）粉末1.0 g，精密稱(chēng)定，按照“2.2.2”項(xiàng)下方法制成供試品溶液，分別于室溫下放置0、2、6、10、12、24 h時(shí)按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果顯示，沒(méi)食子酸、白藜蘆醇-4′-O-葡萄糖苷、白藜蘆醇-4′-O-（6″-沒(méi)食子?；?葡萄糖苷峰面積的RSD分別為0.71%、0.77%、0.81%（n=6），表明供試品溶液在室溫下放置24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.5 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一樣品（S6）粉末共6份，每份1.0 g，精密稱(chēng)定，分別按照“2.2.2”項(xiàng)下方法制成供試品溶液，再按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并按標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算樣品中各待測(cè)成分的含量。結(jié)果顯示，沒(méi)食子酸、白藜蘆醇-4′-O-葡萄糖苷、白藜蘆醇-4′-O-（6″-沒(méi)食子酰基）-葡萄糖苷含量的RSD分別為1.84%、0.98%、2.63%（n=6），表明該方法重復(fù)性較好。

2.4.6 加樣回收率試驗(yàn) 取同一批已知含量的掌葉大黃樣品（S1）粉末約0.2 g，共6份，分別置于具塞錐形瓶中，精密加入混合對(duì)照品貯備液[沒(méi)食子酸、白藜蘆醇-4′-O-葡萄糖苷、白藜蘆醇-4′-O-（6″-沒(méi)食子?；?葡萄糖苷質(zhì)量濃度分別為1.495 4、0.171 9、0.276 4 mg/mL]1 mL，再分別加入甲醇9 mL，其余按照“2.2.2”項(xiàng)下方法制成供試品溶液，然后按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算加樣回收率。結(jié)果顯示，3種成分的平均加樣回收率分別為102.15%、100.99%、101.59%，RSD分別為1.95%、2.85%、2.87%（n=6），表明該方法準(zhǔn)確度較好，詳見(jiàn)表3。

2.4.7 含量測(cè)定 分別稱(chēng)取30批樣品粉末約1.0 g，按照“2.2.2”項(xiàng)下方法制成供試品溶液后，再按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法分別計(jì)算樣品中沒(méi)食子酸、白藜蘆醇-4′-O-葡萄糖苷、白藜蘆醇-4′-O-（6″-沒(méi)食子酰基）-葡萄糖苷的含量。平行測(cè)定3次，取平均值。結(jié)果顯示，30批樣品中3種成分的含量分別為4.211 2～32.719 1、0.182 3～7.261 9、0.563 5～26.195 7 mg/g，詳見(jiàn)表4。

3 討論

本研究前期對(duì)樣品的提取條件進(jìn)行考察，發(fā)現(xiàn)超聲30 min與浸泡12 h后超聲30 min無(wú)明顯差異，故選擇超聲30 min作為提取條件。對(duì)色譜條件進(jìn)行考察發(fā)現(xiàn)，以甲醇-0.1%磷酸溶液為流動(dòng)相、280 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)時(shí)，色譜峰較多，各主要色譜峰可達(dá)到較好的分離，且基線較平穩(wěn)。

本研究通過(guò)對(duì)不同產(chǎn)區(qū)掌葉大黃酒蒸前后的相似度、CA、PCA結(jié)果進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)各產(chǎn)區(qū)樣品之間存在著較大差異，尤其是青海產(chǎn)掌葉大黃，其與青海產(chǎn)熟大黃及四川、甘肅產(chǎn)掌葉大黃和熟大黃都存在著較大差異。對(duì)PLS-DA結(jié)果進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)：酒蒸前掌葉大黃差異性成分主要為蒽醌類(lèi)、蒽酮類(lèi)、鞣質(zhì)類(lèi)、苯丁酮類(lèi)和二苯乙烯類(lèi)，其中白藜蘆醇-4′-O-（6″-沒(méi)食子酰基）-葡萄糖苷的差異性影響較大（VIP值>1.5），推測(cè)苯丁酮類(lèi)和二苯乙烯類(lèi)成分對(duì)掌葉大黃的質(zhì)量控制也起著重要作用;酒蒸后其差異性成分主要為蒽醌類(lèi)、鞣質(zhì)類(lèi)和苯丁酮類(lèi)，推測(cè)可進(jìn)一步通過(guò)對(duì)蒽醌類(lèi)、鞣質(zhì)類(lèi)和苯丁酮類(lèi)成分的含量測(cè)定來(lái)對(duì)熟大黃進(jìn)行質(zhì)量控制。對(duì)OPLS-DA結(jié)果進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)：峰45（大黃素-8-β-D-吡喃葡萄糖苷）、峰29[白藜蘆醇-4′-O-（6″-沒(méi)食子?；?葡萄糖苷]、峰32、峰14（兒茶素）、峰37、峰5（沒(méi)食子酸）、峰38對(duì)掌葉大黃酒蒸前后的差異性影響較大（VIP值>1.5），推測(cè)可進(jìn)一步通過(guò)對(duì)這些成分的質(zhì)量控制來(lái)對(duì)炮制終點(diǎn)進(jìn)行判定。

根據(jù)上述分析結(jié)果，本研究進(jìn)一步選擇了不同產(chǎn)區(qū)間及酒蒸前后差異性較大且鮮有報(bào)道的鞣質(zhì)類(lèi)成分（沒(méi)食子酸）、二苯乙烯類(lèi)成分[白藜蘆醇-4′-O-葡萄糖苷、白藜蘆醇-4′-O-（6″-沒(méi)食子?；?葡萄糖苷]進(jìn)行含量測(cè)定。對(duì)含量測(cè)定結(jié)果進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)：各產(chǎn)區(qū)掌葉大黃酒蒸后沒(méi)食子酸含量增加，白藜蘆醇-4′-O-（6″-沒(méi)食子?；?葡萄糖苷、白藜蘆醇-4′-O-葡萄糖苷含量減少;不同產(chǎn)區(qū)中青海產(chǎn)掌葉大黃中3種差異性成分的含量最高，甘肅產(chǎn)掌葉大黃次之。同時(shí)，結(jié)合指紋圖譜進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，青海產(chǎn)掌葉大黃中3種差異性成分含量明顯高于其他2個(gè)產(chǎn)區(qū)樣品，推測(cè)其原因可能與海拔差異、栽培方式不同等有關(guān)[19]。

綜上所述，相對(duì)于以往研究，本研究建立了不同道地產(chǎn)區(qū)掌葉大黃酒蒸前后指紋圖譜，并對(duì)其中差異性較大的沒(méi)食子酸、白藜蘆醇-4′-O-（6″-沒(méi)食子?；?葡萄糖苷、白藜蘆醇-4′-O-葡萄糖苷進(jìn)行了含量測(cè)定，所建立的HPLC指紋圖譜和含量測(cè)定方法穩(wěn)定、可靠，可用于不同道地產(chǎn)區(qū)掌葉大黃及酒蒸炮制品的質(zhì)量評(píng)價(jià)，為大黃其他兩個(gè)基原的質(zhì)量評(píng)價(jià)研究提供了參考，同時(shí)也為不同產(chǎn)區(qū)大黃及其不同炮制品的深入研究奠定了基礎(chǔ)。

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（收稿日期：2021-09-24 修回日期：2021-12-14）

（編輯：曾海蓉）

基金項(xiàng)目：國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（No.2018YFC1707103）

碩士研究生。研究方向：中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。E-mail：rxh_4376@163.com

通信作者：教授，博士生導(dǎo)師，博士。研究方向：中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。電話：0451-82193007。E-mail：ybywater@163.com