栽培黃芩與其對(duì)照藥材的HPLC指紋圖譜及近紅外圖譜比較研究

趙建軍高曉娟++王英華++馬玲　王漢卿

[摘要] 黃芩為我國(guó)常用大宗中藥材，其野生資源急劇減少，目前我國(guó)寧夏、河北、山西、甘肅等地大面積栽培，供中藥材市場(chǎng)及臨床應(yīng)用。該研究旨在通過12批栽培黃芩藥材和黃芩對(duì)照藥材的HPLC指紋圖譜及近紅外圖譜研究，對(duì)4個(gè)產(chǎn)區(qū)的栽培黃芩藥材進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)。結(jié)果顯示，12批栽培黃芩藥材與黃芩對(duì)照藥材色譜指紋圖譜和近紅外圖譜的相似度分別大于0.961和0.983，結(jié)合12批栽培黃芩藥材與黃芩對(duì)照藥材共有峰面積（近紅外為對(duì)應(yīng)點(diǎn)吸收值）的配對(duì)樣本t檢驗(yàn)，均無顯著差異，驗(yàn)證了12批栽培黃芩藥材與對(duì)照藥材質(zhì)量的一致性較高。該研究基于色譜指紋圖譜與近紅外圖譜，并結(jié)合配對(duì)樣本t檢驗(yàn)對(duì)分析結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，避免了分析中因指紋圖譜相似度閾值限定不明確而引起的誤判，為分析結(jié)果提供了可靠的依據(jù)。同時(shí)，通過對(duì)綜合性較強(qiáng)的2種檢測(cè)手段的比較研究，為完善中藥材質(zhì)量控制方法提供了新的思路。

[關(guān)鍵詞] 黃芩； 指紋圖譜； 近紅外； 化學(xué)成分； 質(zhì)量控制

Comparative studies on HPLC fingerprint and nearinfrared spectra of

cultivated and reference crude Scutellaria baicalensis

ZHAO Jianjun1， GAO Xiaojuan1， WANG Yinghua1，3， MA Ling3， WANG Hanqing1，2*

（1. College of Pharmacy， Ningxia Medical University， Yinchuan 750004， China；

2. Ningxia Research Center of Modern Hui Medicine Engineering and Technology， Ningxia Medical University， Yinchuan 750004， China；

3. Ningxia Institute for Drug Control， Yinchuan 750004， China）

[Abstract] Scutellaria baicalensis is a common and important medicinal plant in China， facing with reducing sharply in wild resources. To meet the needs in Chinese herbwouls medicine market and clinical application， S. baicalensis has been widely cultivated in Ningxia， Hebei， Shanxi， and Gansu et al. HPLC fingerprint and nearinfrared were studied in the research to evaluate quality difference of S. baicalensis in four districts. The results showed that the similarity of HPLC fingerprint of 12 cultivated S. baicalensis and reference crude herb is more than 0.961， and the other is more than 0.983. On the other hand， paired sample ttest indicated there has no significant difference between the common peaks′ area of 12 cultivated S. baicalensis and reference crude herb. It was verified that 12 cultivated S. baicalensis has highly consistency with reference crude herb. On the basis of chromatographic fingerprint and nearinfrared spectrum， the study applied paired sample ttest to verify analysis results， which could avoid erroneous judgment induced by indefinite threshold values in the similarity of chromatographic fingerprint and provide reliable basis for the analysis results. Meanwhile， it also provides a new idea for improving the quality control method of Chinese medicinal materials by comparative study about two comprehensive detection means.

[Key words] Scutellaria baicalensis； fingerprint； nearinfrared spectra； chemical composition； quality control

doi：10.4268/cjcmm20162220

黃芩Scutellaria baicalensis Georgi為唇形科黃芩屬多年生草本植物[1]，其根黃芩Scutellariae Radix 為大宗中藥材，具有清熱燥濕、瀉火解毒、止血、安胎之功[2]。研究表明黃芩中黃芩素、黃芩苷等黃酮類成分是其主要藥效成分[3]，具有抗炎、抗菌、抗氧化、鎮(zhèn)痛、保肝等多種藥理作用[45]。隨著藥理研究的深入，其藥效價(jià)值不斷得到開發(fā)，野生資源因此急劇減少，黃芩已列入Ⅲ級(jí)國(guó)家重點(diǎn)保護(hù)野生藥材物種。為滿足市場(chǎng)需求，自1958年以來，寧夏、河北、山西、甘肅等地開始大面積栽培[6]。影響中藥材質(zhì)量因素是復(fù)雜而多變的，如產(chǎn)地、采收期、規(guī)格、生長(zhǎng)方式等。因此，為了全面的控制及評(píng)價(jià)中藥材質(zhì)量，引入指紋圖譜的中藥質(zhì)量評(píng)價(jià)模式已成為國(guó)內(nèi)外共識(shí)[7]。

色譜圖譜具有重復(fù)性高、分離性能好、分析速度快、使用范圍廣等優(yōu)點(diǎn)已被廣泛用于中藥指紋圖譜的研究[89]。但其局限性也較為明顯，任何與色譜相關(guān)實(shí)驗(yàn)條件的改變，都意味著整體色譜圖形的變異，給中藥材評(píng)價(jià)工作造成一定困難，與此同時(shí)指紋圖譜的解析也是研究的一大難點(diǎn)，常用的相似度比較的方法雖然方便，但人為主觀判斷成分較多，缺乏相似度閾值的限定，缺乏評(píng)判的客觀標(biāo)準(zhǔn)[10]。近紅外光譜分析是一種快速、價(jià)廉、無損分析方法，適用于固體、液體等形態(tài)，可用于藥物研發(fā)、生產(chǎn)等生產(chǎn)過程的質(zhì)量監(jiān)控。其與化學(xué)計(jì)量學(xué)結(jié)合，已被用于農(nóng)業(yè)、食品、化學(xué)和石油化工等領(lǐng)域的定性和定量分析[11]。介于近紅外光譜分析的優(yōu)勢(shì)，其方法對(duì)中藥材質(zhì)量的評(píng)價(jià)結(jié)果是否與指紋圖譜方法的一致，相關(guān)研究還少有報(bào)道。

本研究采用HPLC測(cè)定12批不同產(chǎn)地栽培黃芩藥材和1批黃芩對(duì)照藥材中黃芩苷的含量并建立色譜指紋圖譜。同時(shí)，基于近紅外光譜分析技術(shù)建立黃芩藥材的光譜指紋圖譜，并對(duì)指紋圖譜及近紅外光譜進(jìn)行比較分析，判斷2種分析方法中，12批栽培黃芩與對(duì)照藥材相比較的質(zhì)量差異。

1 材料

高效液相色譜儀（Agilent 1260 LC色譜工作站，G1313A自動(dòng)進(jìn)樣器，G1316A柱溫箱，G1311A四元泵，G1379A脫氣機(jī)，G1314A紫外檢測(cè)器）；AE240電子分析天平（1/1萬）；超聲清洗機(jī)；Bruker MatrixF型傅利葉變換近紅外光譜儀（測(cè)試條件：分辨率8 cm-1；樣品累積掃描次數(shù)32 Scans；背景累積掃描次數(shù)32 Scans；光譜范圍12 000～4 000 cm-1；軟件為OPUS 5.5）。

黃芩苷對(duì)照品（批號(hào)110715200212，中國(guó)食品藥品檢定研究院）；甲醇、乙腈為色譜純；娃哈哈純凈水；其他試劑均為分析純。

實(shí)驗(yàn)所用的12批栽培黃芩藥材采自于4個(gè)產(chǎn)區(qū)，經(jīng)王英華主任藥師鑒定為唇形科黃芩屬植物黃芩S. baicalensis，樣本信息見表1。黃芩對(duì)照藥材來自于中國(guó)食品藥品檢定研究院。

2 方法

2.1 色譜條件

色譜柱Phenomenex Gemini C18柱（4.6 mm×250 mm， 5 μm）；流動(dòng)相甲醇乙腈醋酸、醋酸鈉（pH 4.5）緩沖液，梯度洗脫程序見表2；流速1.0 mL·min-1；柱溫25 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)276 nm；進(jìn)樣量10 μL。

2.2 色譜對(duì)照品溶液制備

精密稱量黃芩苷對(duì)照品 0.016 06 g，置于10 mL的量瓶中，加適量色譜甲醇使溶解，定容至刻度，得黃芩苷對(duì)照品儲(chǔ)備液。精密量取黃芩苷對(duì)照品儲(chǔ)備液4 mL，置于25 mL量瓶中，加甲醇定容，配制成質(zhì)量濃度為0.257 g·L-1的黃芩苷對(duì)照品溶液，備用。

2.3 色譜供試品溶液制備

黃芩藥材粉碎，過80目篩，精密稱取0.5 g，置100 mL量瓶中，加入70%甲醇100 mL，稱重，室溫超聲提取45 min，靜置，補(bǔ)足失重，取上清液過0.45 μm微孔濾膜，即得。

2.4 色譜方法學(xué)考察

2.4.1 精密度試驗(yàn) 取13號(hào)對(duì)照藥材供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣5次，以黃芩苷為標(biāo)準(zhǔn)峰，各主要色譜峰相對(duì)峰面積和相對(duì)保留時(shí)間的RSD均小于5.0%，表明儀器精密度良好。

2.4.2 重復(fù)性試驗(yàn) 取13號(hào)對(duì)照藥材粉末5份，每份0.5 g，按2.3項(xiàng)制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣檢測(cè)。5次測(cè)得的各主要色譜峰峰面積和保留時(shí)間的RSD均小于5.0%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.4.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取13號(hào)對(duì)照藥材供試品溶液，分別于放置0， 2， 4， 8， 12， 24 h，按2.1項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣檢測(cè)。測(cè)得各時(shí)間段的RSD均小于5.0%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5 樣品色譜測(cè)定

分別精密對(duì)照品和供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣檢測(cè)，記錄90 min色譜圖，見圖1。

2.6 樣品近紅外光譜測(cè)定

分別取烘干至恒重且過80目篩的黃芩藥材粉末適量，在Bruker MatrixF型傅利葉變換近紅外光譜儀掃描近紅外光譜，測(cè)試條件：分辨率8 cm-1；樣品累積掃描次數(shù)32 Scans；背景累積掃描次數(shù)32 Scans；光譜范圍12 000～4 000 cm-1；軟件為OPUS 5.5。每個(gè)樣品平行測(cè)定6次，取平均值作為該樣品的原始光譜，環(huán)境條件為溫度23 ℃，濕度40%。

2.7 數(shù)據(jù)分析

2.7.1 指紋圖譜相似度分析 采用中國(guó)藥典委員會(huì)頒布的中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)（A版），以對(duì)照藥材色譜峰為參照峰，對(duì)12批黃芩藥材和對(duì)照藥材指紋圖譜進(jìn)行自動(dòng)匹配，并對(duì)所有的HPLC指紋圖譜全譜進(jìn)行相似度計(jì)算，用相關(guān)系數(shù)表征相似度。

2.7.2 近紅外特征譜段相關(guān)系數(shù)分析 采用OPUS軟件對(duì)獲取的各批次黃芩藥材及對(duì)照藥材的近紅外光譜進(jìn)行一階導(dǎo)數(shù)+矢量歸一化預(yù)處理，以對(duì)照藥材近紅外光譜為參考光譜，計(jì)算各批次黃芩藥材測(cè)定光譜與參考光譜的相關(guān)系數(shù)，比較其與參考光譜的相似程度。

2.7.3 共有峰差異顯著性分析 采用SPSS 19.0 中的配對(duì)樣本t檢驗(yàn)分別分析各栽培黃芩藥材與黃芩對(duì)照藥材的色譜指紋圖譜和光譜指紋圖譜共有峰吸收是否存在顯著差異。

3 結(jié)果

3.1 黃芩苷含量測(cè)定

采用HPLC測(cè)定12批栽培黃芩藥材和黃芩對(duì)照藥材中黃芩苷含量數(shù)據(jù)，見表1。由表1可知，對(duì)照藥材中黃芩苷含量高于其他各批次藥材，但是，各批次藥材中黃芩苷含量均高于2015年版藥典規(guī)定的含量（9.0%），說明各產(chǎn)地栽培黃芩均可作為合格黃芩藥材使用。

3.2 栽培黃芩色譜指紋圖譜及相似度評(píng)價(jià)

12批黃芩藥材和黃芩對(duì)照藥材按2.1項(xiàng)制備供試品溶液后按2.3項(xiàng)色譜條件進(jìn)行檢測(cè)，記錄90 min色譜圖，建立了黃芩HPLC指紋圖譜。色譜記錄數(shù)據(jù)經(jīng)Aligent工作站導(dǎo)出AIA.格式數(shù)據(jù)后輸入中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)軟件中進(jìn)行共有峰標(biāo)定和相似度計(jì)算。以匹配數(shù)目為13的色譜峰為共有峰，共標(biāo)定23個(gè)共有峰，見圖2，各共有峰的保留時(shí)間和峰面積見表3。由表3可知，各共有峰保留時(shí)間的RSD均小于0.40%，說明該方法準(zhǔn)確、可靠，可以用于黃芩藥材的質(zhì)量評(píng)價(jià)。以13號(hào)黃芩對(duì)照藥材為參照譜圖計(jì)算的相似度，1～12號(hào)樣品與對(duì)照藥材的相似度分別為0.980，0.961，0.984，0.989，0.987，0.983，0.989，0.995，0.995，0.974，0.990，0.983。由相似度計(jì)算結(jié)果可知，用于建立指 紋圖譜的12批栽培黃芩藥材和黃芩對(duì)照藥材相似度較高（0.961～0.995），說明各產(chǎn)地栽培黃芩與對(duì)照藥材的一致度較高。

3.3 栽培黃芩共有峰面積與黃芩對(duì)照藥材共有峰面積差異分析

依據(jù)表3中各樣品共有峰面積值，12批栽培黃芩的共有峰面積值分別與黃芩對(duì)照藥材共有峰面積進(jìn)行配對(duì)樣本t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)結(jié)果見表4。由表4可知，各批次栽培黃芩藥材的共有峰面積與對(duì)照藥材共有峰面積無顯著差異。

3.4 栽培黃芩近紅外光譜分析

獲取的12批栽培黃芩藥材及黃芩對(duì)照藥材的近紅外原始光譜見圖3。近紅外光譜常受到光程、樣品厚度、基線漂移等因素的影響，在分析之前需要對(duì)其進(jìn)行預(yù)處理。矢量歸一化可以消除光程或樣品厚度的影響，而導(dǎo)數(shù)化可以消除基線漂移等因素的影響，本研究采用一階導(dǎo)數(shù)+矢量歸一化對(duì)各批栽培黃芩藥材近紅外圖譜進(jìn)行預(yù)處理，預(yù)處理后圖譜見圖4。對(duì)預(yù)處理后的近紅外圖譜利用OPUS 5.5軟件，以對(duì)照藥材圖譜為參照譜圖，計(jì)算1～12號(hào)栽培黃芩近紅外圖譜與黃芩對(duì)照藥材圖譜的相似度結(jié)果分別為0.991， 0.989， 0.983， 0.993， 0.993， 0.991， 0.990， 0.995， 0.994， 0.995， 0.992，

0.990。由相似度計(jì)算可知，各批次栽培黃芩藥材與黃芩對(duì)照藥材的近紅外光譜相似度較高（0.983～0.995），說明各產(chǎn)地栽培黃芩與對(duì)照藥材在近紅外光譜分析層面上的一致度較高。

3.5 栽培黃芩藥材與黃芩對(duì)照藥材近紅外吸收差異

利用OPUS軟件對(duì)各批近紅外光譜進(jìn)行一階導(dǎo)數(shù)和矢量歸一化預(yù)處理后導(dǎo)出各點(diǎn)吸收數(shù)據(jù)，分別將12批栽培黃芩藥材的近紅外吸收數(shù)據(jù)與黃芩藥材的吸收數(shù)據(jù)進(jìn)行配對(duì)樣本t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)結(jié)果見表5。由表5可知，各批次栽培黃芩藥材的近紅外吸收與對(duì)照藥材近紅外吸收無顯著差異。

4 討論

常用中藥指紋圖譜研究的方法與技術(shù)包含廣泛，如薄層色譜法、液相色譜法、氣相色譜法、近紅外光譜法、X射線衍射法及核磁共振法等。其中液相色譜法是最常用的指紋圖譜研究方法。但其不足之處也較為明顯[12]，如對(duì)中藥這樣一個(gè)復(fù)雜體系，同時(shí)解決分離與檢測(cè)兩大問題，單一的分離與檢測(cè)模式容易丟失大量信息；其次由于實(shí)驗(yàn)條件的微小改動(dòng)就會(huì)顯著的影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，對(duì)重現(xiàn)性有較大挑戰(zhàn)，這也是眾多研究黃芩指紋圖譜的文章當(dāng)中，色譜圖有較大差異的原因之一。近年來，近紅外光譜技術(shù)較多的應(yīng)用于中藥的鑒別和定性、定量的分析中。其方法快速、方便、準(zhǔn)確、非侵入式分析、易于實(shí)現(xiàn)生產(chǎn)過程的在線控制等優(yōu)點(diǎn)[13]。但也有其方法的局限性，如：近紅外光譜較差的特征性，導(dǎo)致分析技術(shù)對(duì)化學(xué)計(jì)量學(xué)極其依賴；作為相對(duì)分析技術(shù)，數(shù)學(xué)模型的建立需要傳統(tǒng)分析方法輔助等[14]。

本研究分別采用HPLC指紋圖譜和近紅外光譜對(duì)4個(gè)產(chǎn)區(qū)12批栽培黃芩藥材與其對(duì)照藥材的差異進(jìn)行研究，結(jié)果表明：色譜指紋圖譜與近紅外光譜相似度表征中，12批栽培黃芩藥材與其對(duì)照藥材的相似度均較高（均大于0.96）。雖然相似度均較高，但由于相似度沒有客觀的閾值限定，為確保所得結(jié)論的可靠性，同時(shí)采用12批栽培黃芩藥材指紋圖譜共有峰面積（近紅外為各點(diǎn)吸收值）與黃芩對(duì)照藥材的共有峰面積（近紅外為各點(diǎn)吸收值）進(jìn)行配對(duì)樣本t檢驗(yàn)比較其差異，結(jié)果表明12批黃芩栽培藥材均與黃芩對(duì)照藥材的吸收無顯著差異，與相似度結(jié)果一致。色譜指紋圖譜、近紅外光譜及配對(duì)樣本t檢驗(yàn)的綜合方法相互驗(yàn)證，為最終所得結(jié)果12批栽培黃芩藥材與黃芩對(duì)照藥材品質(zhì)無顯著差異，作為合格藥材使用提供了可靠的分析依據(jù)。

本研究首次同時(shí)用色譜指紋圖譜和近紅外光譜分析栽培黃芩與其對(duì)照藥材的質(zhì)量差異，并結(jié)合配對(duì)樣本t檢驗(yàn)對(duì)分析結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。一方面避免了分析中因指紋圖譜相似度無閾值而引起的誤判；另一方面通過多種分析的相互驗(yàn)證，為分析結(jié)果提供了可靠的依據(jù)，同時(shí)，為完善中藥材質(zhì)量控制方法提供了新的思路。

上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果提出了新的思考方向，HPLC指紋圖譜與近紅外光譜的一致性問題是否在某些中藥材原料中，近紅外光譜可以對(duì)HPLC指紋圖譜進(jìn)行補(bǔ)充或替代，從而在鑒定中藥材原料符合我國(guó)藥典質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的基礎(chǔ)上，采用更加經(jīng)濟(jì)與環(huán)境友好的實(shí)驗(yàn)方法，還需要進(jìn)一步研究。

[參考文獻(xiàn)]

[1] 中國(guó)植物志編輯委員會(huì).中國(guó)植物志[M].北京：科學(xué)出版社，1977.

[2] 中國(guó)藥典.一部[S].2015：301.

[3] 王丹，蔣亞杰，梁艷，等.黃芩不同規(guī)格與化學(xué)成分及內(nèi)在質(zhì)量相關(guān)性的研究[J].中國(guó)中藥雜志， 2012， 37（4）：426.

[4] 施高翔，邵菁，汪天明，等.黃芩及其有效成分抗菌作用新進(jìn)展[J].中國(guó)中藥雜志， 2014， 39（19）：3713.

[5] 柴玉爽，雷帆，邢東明，等.黃芩苷對(duì)模式識(shí)別受體TLR2/4NOD2的作用及其成藥性意義[J].中國(guó)中藥雜志， 2013， 38（16）：2639.

[6] Yuan Q J， Zhang Z Y， Hu J， et al. Impacts of recent cultivation on genetic diversity pattern of a medicinal plant， Scutellaria baicalensis[J]. Bmc Genetics， 2009， 11（1）：52.

[7] 梁逸曾，易倫朝，黃熙， 等.中藥分析新思路及其質(zhì)量控制[J].分析測(cè)試學(xué)報(bào)， 2014， 33（2）：119.

[8] 黃洋，邵慧凱，路麗，等.不同采收期小葉榕葉HPLC指紋圖譜研究[J].中草藥，2014， 45（2）：271.

[9] 邵林，郭慶梅，冉蓉，等.山東不同栽培品種金銀花HPLC指紋圖譜的比較[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2011（19）：117.

[10] 詹雪艷，史新元，段天璇，等.色譜指紋圖譜相似度方法的研究進(jìn)展[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志， 2011， 17（2）：248.

[11] Roggo Y， Chalus P， Maurer L， et al. A review of near infrared spectroscopy and chemometrics in pharmaceutical technologies [J]. J Pharm Biomed Anal， 2007， 44（3）：683.

[12] 陳林偉，秦昆明，徐雪松，等.中藥指紋圖譜數(shù)據(jù)庫的研究現(xiàn)狀及展望[J].中草藥， 2014， 45（21）：3041.

[13] 袁明洋，黃必勝，余馳，等.8種含碳酸鹽的礦物類中藥近紅外定性定量模型的建立[J].中國(guó)中藥雜志， 2014， 39（2）：267.

[14] 汪小莉，李嬛，秦昆明，等.近紅外光譜學(xué)與化學(xué)計(jì)量學(xué)在中成藥液體制劑過程分析中的應(yīng)用[J].中草藥， 2013， 44（15）：3420.

[責(zé)任編輯 丁廣治]