中藥蛋白質(zhì)組學(xué)研究策略

樂(lè)亮　姜保平　徐江　胡克平　陳士林

[摘要] 蛋白質(zhì)組學(xué)在中藥研究中的應(yīng)用已十分廣泛，有許多較為成功的實(shí)例。作者回顧了前人應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)對(duì)中藥復(fù)雜體系的研究工作，并提出建立一門(mén)專(zhuān)門(mén)針對(duì)中藥研究的蛋白組學(xué)，即中藥蛋白質(zhì)組學(xué)。該文對(duì)中藥蛋白質(zhì)組學(xué)的研究策略及未來(lái)的研究方向進(jìn)行了綜述和思考，希望為從事中藥蛋白質(zhì)組學(xué)研究者提供一點(diǎn)思路。

[關(guān)鍵詞] 中藥蛋白質(zhì)組學(xué)； 生物信息學(xué)； 蛋白修飾； 蛋白質(zhì)相互作用

Research strategy of traditional Chinese medicine proteomics

LE Liang1， JIANG Baoping2， XU Jiang1， HU Keping2， CHEN Shilin1*

（1.Institute of Chinese Materia Medica， China Academy of Chinese Medical Sciences， Beijing 100700， China；

2.Institute of Medicinal Plant Development， China Academy of Medical Sciences and Peking Union

Medical College， Beijing 100193， China）

[Abstract] The application of proteomics in the research of traditional Chinese medicine （TCM） is very extensive， and there have been many successful cases. In this paper， the previous studies on the complex system of TCM by using proteomics technology were reviewed， and the authors proposed to set up a special subject on proteomics in TCM， which is called TCM proteomics. In this paper， the research strategies and the future research directions of TCM proteomics were reviewed and discussed， which may provide some ideas for the researchers of TCM proteomics.

[Key words] traditional Chinese medicine proteomics； bioinformatics； protein modification； protein interaction

doi：10.4268/cjcmm20162203

中藥是我國(guó)傳統(tǒng)文化的重要財(cái)富，是現(xiàn)代醫(yī)藥可持續(xù)發(fā)展的寶貴資源。歷經(jīng)千年的傳承，中藥的有效性、科學(xué)性和實(shí)用性已得到諸多的驗(yàn)證。2015年青蒿素的研制獲得諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)，是中藥應(yīng)用于世界醫(yī)學(xué)研究中的一次偉大勝利，也是世界對(duì)中藥單體研究的認(rèn)可，為中藥現(xiàn)代化作出了突出貢獻(xiàn)。然而從中藥單體的勝利邁向中藥復(fù)方的勝利仍然需要更多的努力。中藥是典型的復(fù)雜物質(zhì)體系，其復(fù)雜的體系是中藥的一把雙刃劍，因其成分的多樣使得中藥更系統(tǒng)的治療疾病，也因其成分的復(fù)雜也使得中藥作用機(jī)制的研究非常困難。因此，迫切需要應(yīng)用現(xiàn)代科學(xué)發(fā)展的新技術(shù)和新手段來(lái)研究中藥復(fù)雜體系的作用機(jī)制，探索適合中藥研究的新方法、新模式才有可能真正揭示中藥的物質(zhì)基礎(chǔ)與作用機(jī)制，使中藥研究真正邁向現(xiàn)代化。

中藥的現(xiàn)代化研究一直是中醫(yī)藥界多年來(lái)關(guān)注的焦點(diǎn)和研究的熱點(diǎn)。目前中藥現(xiàn)代化取得了許多新進(jìn)展，如整體觀認(rèn)識(shí)在提高；中藥多成分與藥效研究在加強(qiáng)；從藥效物質(zhì)基礎(chǔ)闡明中藥作用的內(nèi)涵；對(duì)于具有多成分的中藥，從植物化學(xué)角度建立中藥化學(xué)成分指紋圖譜；應(yīng)用現(xiàn)代科學(xué)對(duì)“辨證論治”和“君臣佐使”配伍規(guī)律進(jìn)行研究；“組學(xué)”方法和技術(shù)的應(yīng)用等[1]。在大數(shù)據(jù)時(shí)代，基于各種組學(xué)，如基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、代謝組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)等技術(shù)平臺(tái)的系統(tǒng)生物學(xué)是中藥現(xiàn)代化研究的必備工具[2]。使用系統(tǒng)生物學(xué)研究中藥復(fù)雜體系的思路，為中藥現(xiàn)代化的發(fā)展提供了嶄新的思路和方法，成為目前中藥現(xiàn)代化研究的熱點(diǎn)。迄今為止，不少科研工作者都在系統(tǒng)生物學(xué)思路指導(dǎo)下開(kāi)展了對(duì)中藥復(fù)雜體系的研究。而在后基因時(shí)代，蛋白質(zhì)組學(xué)等基因功能學(xué)的研究成為系統(tǒng)生物學(xué)研究的重點(diǎn)。

1 中藥蛋白質(zhì)組學(xué)的定義

將蛋白質(zhì)組學(xué)的技術(shù)應(yīng)用于中藥研究領(lǐng)域，一方面通過(guò)比較對(duì)照細(xì)胞或動(dòng)物組織的蛋白質(zhì)表達(dá)譜和給予中藥后蛋白質(zhì)表達(dá)譜的差異，可以找到中藥的可能靶點(diǎn)相關(guān)蛋白質(zhì)，另一方面不同中草藥及其不同組分，例如根莖葉中蛋白質(zhì)組的差異，用以評(píng)價(jià)中草藥活性成分與其生長(zhǎng)過(guò)程中蛋白組的變化的關(guān)系，尋找中藥高活性的原理，由此發(fā)展起來(lái)的學(xué)科稱(chēng)之為中藥蛋白質(zhì)組學(xué)。

2 中藥蛋白質(zhì)組學(xué)的主要研究?jī)?nèi)容

不同于其他蛋白質(zhì)組學(xué)，中藥蛋白質(zhì)組學(xué)的研究對(duì)象為中草藥本身及用中藥（單體化合物、中藥組分或復(fù)方）處理后的生物體（細(xì)胞或組織），于此發(fā)現(xiàn)中藥的有效成分及作用機(jī)制。中藥蛋白質(zhì)組學(xué)的研究目標(biāo)包括：中藥藥物作用靶點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)和確認(rèn)，特別是中藥復(fù)方的多靶點(diǎn)效應(yīng)，蛋白質(zhì)組學(xué)能更好的發(fā)現(xiàn)中藥復(fù)方的多種靶點(diǎn)；研究中藥植物蛋白質(zhì)組成的差異；闡明中藥的作用機(jī)制及中藥毒理的作用機(jī)制，以及為中藥配伍提供科學(xué)依據(jù)。

3 中藥蛋白質(zhì)組學(xué)的常用技術(shù)

蛋白質(zhì)組學(xué)已經(jīng)歷了20多年的發(fā)展，現(xiàn)今技術(shù)成熟，被應(yīng)用于多種學(xué)科的研究。對(duì)中藥蛋白質(zhì)組進(jìn)行分析需要有合適的研究策略和技術(shù)、有效的實(shí)時(shí)分析模式，從而獲得在基因組和轉(zhuǎn)錄組上不易獲得的功能信息。以下是一些常用的技術(shù)。

3.1 蛋白質(zhì)分離技術(shù) 蛋白質(zhì)分離技術(shù)在蛋白質(zhì)組學(xué)中起著至關(guān)重要的作用，雙向聚丙烯酰胺凝膠電泳（two dimensional gel electrophoresis， 2DE）是其中一種經(jīng)典方法，但由于生物樣品中蛋白質(zhì)表達(dá)水平的巨大差異，如蛋白質(zhì)大小的動(dòng)態(tài)范圍及表達(dá)量豐度的巨大差異，以及二維電泳技術(shù)對(duì)某些蛋白質(zhì)的“偏性”，極大的限制了該技術(shù)的應(yīng)用范圍[35]。因此，人們發(fā)展了多種蛋白質(zhì)分離技術(shù)，如色譜分離技術(shù)、毛細(xì)管電泳技術(shù)、毛細(xì)管色譜技術(shù)、微流控芯片（Chip）技術(shù)等。

3.2 質(zhì)譜技術(shù) 質(zhì)譜是最常用的，也是最主要的蛋白質(zhì)鑒定技術(shù)，已經(jīng)逐步取代了傳統(tǒng)的氨基酸組成分析和Edman降解測(cè)序。質(zhì)譜技術(shù)的基本原理是將蛋白質(zhì)樣品先經(jīng)過(guò)離子化后，然后根據(jù)不同離子間質(zhì)子與電荷之比（m/z）的差異來(lái)分離并確定蛋白質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量。因此，離子源、質(zhì)量分析器和檢測(cè)器構(gòu)成了質(zhì)譜儀的核心組件。應(yīng)用于蛋白質(zhì)樣品的離子源包括基質(zhì)輔助激光解吸離子化（MALDI）和電噴霧離子化（ESI）2種。而常用的質(zhì)量分析器包括傅立葉變換離子回旋共振質(zhì)譜（FTICR/FT）、線(xiàn)性離子阱質(zhì)譜（LIT/LTQ）、四級(jí)桿離子阱質(zhì)譜（QIT）和飛行時(shí)間質(zhì)譜（TOF）4種。而質(zhì)譜檢測(cè)器也有多種，包括電子倍增管、離子計(jì)數(shù)器、感應(yīng)電荷檢測(cè)器等。

3.3 蛋白質(zhì)芯片 蛋白質(zhì)芯片（protein chip）是將固相載體進(jìn)行特殊的化學(xué)處理，再將一系列已知的蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)結(jié)合分子（如酶、抗體、配體、細(xì)胞因子等）固定其上，根據(jù)這些生物分子的自身特性，捕獲與之特異性結(jié)合的待測(cè)蛋白，來(lái)確定樣本中蛋白質(zhì)組的表達(dá)譜、生化活性及相互作用[67]。

3.4 蛋白質(zhì)相互作用技術(shù) 研究蛋白質(zhì)相互作用的技術(shù)有多種，包括酵母雙雜交技術(shù)，Pull down技術(shù)、免疫共沉淀技術(shù)等。

4 中藥蛋白質(zhì)組學(xué)研究的應(yīng)用

以疾病為基礎(chǔ)，經(jīng)過(guò)中藥體系的治療，再通過(guò)蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)研究中藥作用機(jī)制的研究思路是中藥蛋白質(zhì)組學(xué)的通用研究思路。以往的研究表明，蛋白質(zhì)組學(xué)在中藥研究中的應(yīng)用主要有5個(gè)方面：①通過(guò)比較中草藥不同產(chǎn)地，野生與栽培，不同組分等蛋白質(zhì)組表達(dá)譜的差異，研究中藥藥用功能的機(jī)制；②通過(guò)比較正常狀態(tài)、疾病狀態(tài)以及中藥單體、單味藥和復(fù)方提取物治療后蛋白質(zhì)組表達(dá)譜的差異，尋找可能的相關(guān)靶點(diǎn)蛋白；③通過(guò)生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)中藥單體化合物與特異性靶點(diǎn)的相互作用，再利用BIAcore生物大分子相互作用儀對(duì)中藥單體化合物進(jìn)行體外相互作用的篩選及驗(yàn)證；④通過(guò)比較蛋白質(zhì)組學(xué)的結(jié)果，結(jié)合在蛋白質(zhì)相互作用數(shù)據(jù)庫(kù)中與中藥相互作用的蛋白信息，利用生物信息學(xué)技術(shù)繪制出與中藥作用相關(guān)的蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)，并對(duì)特異性靶點(diǎn)運(yùn)用生物學(xué)的實(shí)驗(yàn)手段（如酵母雙雜交，免疫共沉淀，基因過(guò)表達(dá)及基因敲除技術(shù)）對(duì)蛋白質(zhì)相互作用信號(hào)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行驗(yàn)證；⑤比較中藥體系對(duì)疾病治療后的蛋白修飾譜，如組蛋白乙酰化修飾譜，泛素化修飾譜等，研究中藥體系對(duì)于靶點(diǎn)蛋白的修飾作用。

4.1 基于蛋白質(zhì)組學(xué)的中草藥生物學(xué)研究 蛋白質(zhì)組學(xué)在中草藥上的應(yīng)用可以繪制中草藥及其不同藥用部位的蛋白質(zhì)表達(dá)譜，不但可以闡明藥效活性成分的生物合成途徑，還能揭示在逆境脅迫下中草藥體內(nèi)次生代謝產(chǎn)物發(fā)生變化的分子機(jī)制[8]（表1）。

2016年Wang等[9]利用二維電泳和質(zhì)譜技術(shù)比較了正常培養(yǎng)液、酵母刺激和銀離子刺激培養(yǎng)的丹參毛根的蛋白質(zhì)組學(xué)差異，鑒定了64種蛋白，發(fā)現(xiàn)酵母和銀離子刺激引起丹參毛根中自由基的產(chǎn)生和激活鈣離子信號(hào)通路，增加免疫抑制蛋白的表達(dá)，增強(qiáng)能量代謝，碳代謝轉(zhuǎn)向于有利于次生代謝產(chǎn)物如木質(zhì)素、丹參酮、丹參總酚酸的產(chǎn)生。2013年Mohamad Ansor等[10]研究靈芝菌絲體中抗血管緊張素轉(zhuǎn)化酶的蛋白質(zhì)組成，其對(duì)靈芝菌絲體總蛋白進(jìn)行硫酸銨沉淀，再通過(guò)HPLC分離，質(zhì)譜鑒定，發(fā)現(xiàn)胱硫醚合成酶蛋白、DEAD/DEAH 盒解旋酶、Paxillin樣蛋白和α/β水解酶蛋白這4種蛋白在靈芝抗血管緊張素轉(zhuǎn)化酶中起重要作用。大麻素在大麻不同組織中的累積不同，主要分布于腺體，在花和葉也有分布。2004年Raharjo等[11]比較了大麻葉、花和腺體的蛋白質(zhì)組的差異。發(fā)現(xiàn)磷脂酶Dβ1亞型1A，PG1等在腺體中高

表達(dá)，可能參與大麻素的生物合成。

2013年Ma等[12]比較了不同年齡人參根的蛋白質(zhì)組的差異，與快速生長(zhǎng)期相比，生長(zhǎng)緩慢期中有至少62種蛋白上調(diào)和21種蛋白下調(diào)，這些蛋白主要與能量代謝和機(jī)體防御有關(guān)。其結(jié)果表明人參在快速生長(zhǎng)期主要儲(chǔ)存能量以促進(jìn)根的生長(zhǎng)，而在生長(zhǎng)緩慢期則通過(guò)消耗能量和提高次級(jí)代謝產(chǎn)物的合成來(lái)抵抗應(yīng)激反應(yīng)。2016年Colzani等[13]在3個(gè)不同pH條件下用組合肽配體庫(kù)捕獲和質(zhì)譜技術(shù)比較了人參根蛋白質(zhì)組差異。采用人參和擬南芥蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行搜庫(kù)，共鑒定了207個(gè)蛋白，其中95種蛋白可能與人參生物活性有關(guān)，且有6種與人參的抗菌活性有關(guān)。2016年Sun等[14]比較了30年的野生人參根和6年的栽培人參根蛋白組的差異，結(jié)果顯示與培養(yǎng)人參相比，至少14種氨基酸的濃度在野生型人參根中較高，其氨基酸代謝相關(guān)酶等都在野生型人參中有明顯聚集。硫類(lèi)氨基酸合成相關(guān)蛋白如甲硫氨酸合成酶水平在野生型人參根中明顯較高，另外在野生型人參根還明顯聚集三羧酸循環(huán)酶和糖分解相關(guān)酶以及它們的中間產(chǎn)物。他們的結(jié)果指示了野生型人參根和培養(yǎng)人參根氨基酸等的差異，為野生型人參的藥用功能研究提供一些參考。

2013年Tian等[15]采用定量蛋白組學(xué)技術(shù)分離了野生型黃花蒿與易生根突變株之間差異蛋白。結(jié)果鑒定到的蛋白數(shù)量1 292個(gè)，其中1 025個(gè)（79.3%）蛋白質(zhì)表現(xiàn)與己知功能的蛋白有顯著相似性，112個(gè)（8.7%）蛋白質(zhì)與未知的蛋白質(zhì)有顯著相似性，其他155個(gè)（12%）蛋白質(zhì)與公共數(shù)據(jù)庫(kù)中的任何蛋白質(zhì)無(wú)顯著相似性。根據(jù)功能可將總蛋白分為22類(lèi)，包括RNA的合成、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、抗逆、蛋白質(zhì)的合成、代謝、次生代謝、能量、細(xì)胞生長(zhǎng)/分裂、轉(zhuǎn)錄、蛋白質(zhì)目的地/儲(chǔ)存、運(yùn)輸、細(xì)胞結(jié)構(gòu)、疾病/防御和未知蛋白。2012年Wu等[16]比較了黃花蒿腺分泌毛和葉的蛋白質(zhì)組的差異，鑒定了93個(gè)蛋白，超過(guò)70%的蛋白在腺分泌毛中高表達(dá)，其中多數(shù)參與植物代謝，如電子傳遞、轉(zhuǎn)錄和翻譯過(guò)程。2014年Rai等[17]采用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)研究不同濃度的砷刺激的黃花蒿的蛋白質(zhì)組的差異，結(jié)果顯示ATP合成酶、ferredoxinNADP氧化還原酶和鐵硫蛋白可能參與黃花蒿的解毒作用。2015年Bryant等[18]分析了黃花蒿的腺分泌腺和葉的蛋白質(zhì)組的差異，鑒定了319個(gè)蛋白，發(fā)現(xiàn)了多種與青蒿素生物合成相關(guān)的蛋白如HMGR、細(xì)胞色素P450、青蒿醛 A還原酶等在腺分泌毛中高表達(dá)。2015年Zhu等[19]利用蛋白質(zhì)非標(biāo)記定量（labelfree）技術(shù)對(duì)誘導(dǎo)前后長(zhǎng)春花葉片進(jìn)行差異蛋白質(zhì)組學(xué)分析，結(jié)合光酶誘導(dǎo)下長(zhǎng)春花中吲哚生物堿合成途徑上關(guān)鍵基因的表達(dá)分析驗(yàn)證，探索長(zhǎng)春花植株中生物堿含量增加的分子機(jī)制。

4.2 利用蛋白質(zhì)組學(xué)尋找中藥作用靶點(diǎn) 目前大部分中藥蛋白質(zhì)組學(xué)的應(yīng)用實(shí)例都是關(guān)于利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)尋找中藥作用靶點(diǎn)的，該方法在研究中藥單體、單味藥及中藥復(fù)方中都多有應(yīng)用（表2）。例如2008 年和2010 年，Yue 等[2021]分別利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)研究了中藥?kù)`芝單體化合物靈芝酸 D，B，F(xiàn)，K，AM1（ganoderic acid D，B，F(xiàn)，K，AM1） 對(duì)于人宮頸癌HeLa 細(xì)胞毒性的作用機(jī)制，發(fā)現(xiàn)了多種與靈芝酸類(lèi)化合物作用相關(guān)的靶點(diǎn)蛋白。2013年P(guān)an等[2223]利用蛋白組學(xué)技術(shù)分析丹參酮ⅡA對(duì)宮頸癌Caski細(xì)胞的抑制作用，發(fā)現(xiàn)C/EBP同源蛋白和細(xì)胞凋亡信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1參與丹參酮ⅡA的抑癌作用。小檗堿又稱(chēng)黃連素，具有多種藥理活性，如調(diào)血脂、降血糖、防治神經(jīng)病變甚至抗癌。2012年Chou等[24]利用二維電泳結(jié)合質(zhì)譜探索小檗堿抗乳腺癌的作用，至少96種參與蛋白質(zhì)折疊，蛋白質(zhì)水解、氧化還原調(diào)控、蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)、細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、電子傳遞失調(diào)，代謝和中心體的結(jié)構(gòu)等多種功能的蛋白質(zhì)調(diào)節(jié)小檗堿的抗癌作用。2011年Feng等[25]研究丹酚酸B對(duì)心肌保護(hù)的作用，采用2維電泳結(jié)合質(zhì)譜的方法發(fā)現(xiàn)EGFR可能是丹酚酸B的作用靶點(diǎn)。同年Ma等[26]研究丹酚酸B對(duì)血小板的作用靶點(diǎn)發(fā)現(xiàn)Hsp70，CLP36的蛋白可能是其在血液中的作用靶點(diǎn)。9，11脫羥基麥角固醇來(lái)源于赤芝，2010年Cui等[27]利用蛋白質(zhì)組學(xué)研究其細(xì)胞毒性發(fā)現(xiàn)9，11脫羥基麥角固醇的細(xì)胞毒性可能與6種蛋白有關(guān)，其中包括stathmin 1，一種主要的細(xì)胞骨架蛋白。藤黃能明顯抑制肝癌細(xì)胞的增殖，1，3，6，7四羥基氧雜蒽酮是藤黃中的一種有效成分，2012年Fu等[28]采用蛋白組學(xué)研究其抑制肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)的作用機(jī)制，發(fā)現(xiàn)1433δ和P16蛋白表達(dá)明顯上調(diào)，而抑制1433δ的表達(dá)則明顯減少這種化合物的抑癌作用，表明1433δ可能是其作用靶點(diǎn)。

也有許多關(guān)于利用蛋白質(zhì)組學(xué)研究單味藥的報(bào)道，如2008 年，Yao 等[2930]分別利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)探討了與三七總皂苷和丹參總酚酸抑制大鼠血小板聚集作用相關(guān)的靶點(diǎn)蛋白。天麻是蘭科天麻屬多年生草本植物，其根莖入藥用以治療頭暈?zāi)垦?、肢體麻木等癥。2012年Umamaheswari等[31]采用定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)對(duì)體外SHSY5Y細(xì)胞模型中受到天麻調(diào)控的因子進(jìn)行表達(dá)譜測(cè)定，結(jié)果表明伴侶蛋白/蛋白酶通路相關(guān)蛋白影響天麻的神經(jīng)保護(hù)作用。而同時(shí)Manavalan等[32]則利用體內(nèi)大鼠灌胃天麻模型并采用定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)研究天麻對(duì)大鼠腦組織蛋白質(zhì)組學(xué)的影響，結(jié)果顯示天麻長(zhǎng)期治療可以改善大腦神經(jīng)生長(zhǎng)和突觸活動(dòng)相關(guān)的蛋白的表達(dá)變化，如Gnao1和Dctn2蛋白。同時(shí)，天麻還誘導(dǎo)上調(diào)分子伴侶和錯(cuò)誤折疊相關(guān)蛋白，如Anxa5等。南蛇藤是衛(wèi)矛科南蛇藤屬落葉藤狀灌木，其根、藤祛風(fēng)活血，消腫止痛。2014年Zhu等[33]研究南蛇藤抗胃癌的作用，利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)發(fā)現(xiàn)TGFβ1介導(dǎo)的HSP27信號(hào)通路可能參與其抗癌作用。刺五加是一種灌木，在中國(guó)醫(yī)藥學(xué)中作為藥物廣泛應(yīng)用已有悠久的歷史，具有“補(bǔ)中益精、堅(jiān)筋骨、強(qiáng)志意”的作用，久服“輕身耐老”，與他藥配伍亦可“進(jìn)飲食、健氣力、不忘事”。2014年Li等[34]研究刺五加的神經(jīng)保護(hù)作用，采用定量蛋白質(zhì)組學(xué)發(fā)現(xiàn)了3 425個(gè)差異蛋白，其中16種可能是其潛在靶點(diǎn)，這些蛋白與路易小體的形成、線(xiàn)粒體能量代謝、蛋白質(zhì)合成等相關(guān)。

另外，有許多關(guān)于利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)研究中藥復(fù)方，尋找中藥復(fù)方相關(guān)作用靶點(diǎn)都文獻(xiàn)報(bào)道。例如，2009 年，NquyenKhuong等[35]探討了由栝樓、大豆、中藥五味子和西地格絲蘭提取物組成的混合物作用于人膀胱癌細(xì)胞后蛋白質(zhì)組的表達(dá)譜變化，鑒定了多種與能量代謝、細(xì)胞骨架、蛋白質(zhì)降解以及腫瘤抑制相關(guān)的蛋白。2011年Huang等[36]利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)探索了扶正增效方治療肺腺癌作用的蛋白質(zhì)表達(dá)譜變化，結(jié)果鑒定了蛋白S100A9和親環(huán)素A可能是扶正增效方放射增敏作用的靶點(diǎn)蛋白。2010年Fan等[37]研究雙龍方對(duì)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化為心肌樣細(xì)胞的影響，發(fā)現(xiàn)至少36種參與細(xì)胞骨架、細(xì)胞組織能量代謝和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的蛋白質(zhì)能影響雙龍方的功能。2016年P(guān)an等[38]采用二維電泳結(jié)合質(zhì)譜技術(shù)研究黃芩和大黃復(fù)方提取物對(duì)二甲基亞硝胺誘導(dǎo)肝損傷模型治療后的蛋白質(zhì)組差異，結(jié)果發(fā)現(xiàn)黃芩和大黃復(fù)方提取物對(duì)氧化應(yīng)激和細(xì)胞骨架的紊亂具有明顯的改善作用。痹祺膠囊是由馬錢(qián)子、地龍、黨參、茯苓等中藥配制而成，主治益氣養(yǎng)血，祛風(fēng)除濕，活血止痛。2011年Wang等[39]研究其對(duì)巨噬細(xì)胞的抗炎作用，采用蛋白質(zhì)芯片技術(shù)評(píng)價(jià)40種細(xì)胞因子的表達(dá)變化，發(fā)現(xiàn)iNOS，COX2，TNFα，IL6 和 IL1β等明顯減少，其可能參與痹祺膠囊的抗炎作用。同樣是這個(gè)課題組，2012年[40]又對(duì)左金丸抗炎作用進(jìn)行評(píng)價(jià)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)iNOS， COX2， IL6， IL1β，TNFα等細(xì)胞因子也參與左金丸的抗炎作用，但不同的是， NFκB也是參與左金丸抗炎作用的重要靶點(diǎn)。2016年Li等[41]研究補(bǔ)腎益肺方對(duì)慢性阻塞性肺疾病的作用及機(jī)制，發(fā)現(xiàn)補(bǔ)腎益肺方的長(zhǎng)期作用療效顯著，抑制慢性阻塞性肺疾病的炎癥細(xì)胞因子的高表達(dá)、膠原沉積和蛋白酶與抗蛋白酶的失衡等，作者利用結(jié)合蛋白質(zhì)組學(xué)、代謝組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)的數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)許多基因、蛋白質(zhì)、代謝物參與補(bǔ)腎益肺方調(diào)節(jié)的脂質(zhì)代謝、炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激等信號(hào)通路。

4.3 中藥作用靶點(diǎn)的預(yù)測(cè)及驗(yàn)證 利用分子對(duì)接技術(shù)高通量篩選中藥單體化合物，再通過(guò)體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證中藥單體的藥效是目前尋找中藥有效成分的較好的一種高通量藥物篩選方式。該方法的有效進(jìn)行得益于日漸完善的蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(kù)，目前常用的蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(kù)包括PDB，ISSD，SCOP，MMDB等，其中以PDB（Protein Data Bank）數(shù)據(jù)庫(kù)收錄最為詳盡。PDB數(shù)據(jù)庫(kù)由美國(guó)Brookhaven實(shí)驗(yàn)室于1971年建立[42]，收錄了通過(guò)X射線(xiàn)晶體衍射、核磁共振和電子顯微鏡方法測(cè)定的生物大分子的三維結(jié)構(gòu)。分子對(duì)接技術(shù)包括正向?qū)蛹胺聪驅(qū)?，正向?qū)邮侵竿ㄟ^(guò)蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)搜索與其特異性結(jié)合的小分子，而反向?qū)觿t是根據(jù)其提供的蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)采用小分子配體搜索潛在結(jié)合蛋白的方法，2種技術(shù)都可以預(yù)測(cè)中藥單體化合物與靶點(diǎn)蛋白的相互作用。目前用于分子對(duì)接的軟件有Discovery Studio，AutoDock，Surflex，F(xiàn)lexX，MVD，INVDOCK等。例如Yue等采用反向INVDOCK尋找能夠分別與靈芝酸D和丹酚酸B直接結(jié)合的靶點(diǎn)蛋白，結(jié)果表明，1433蛋白可能是靈芝酸 D 直接結(jié)合的靶點(diǎn)蛋白[20]，而EGFR蛋白可能是丹酚酸B直接結(jié)合的靶點(diǎn)蛋白[25]。然而分子對(duì)接的實(shí)驗(yàn)結(jié)果必須利用實(shí)驗(yàn)技術(shù)來(lái)驗(yàn)證，常用的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證手段包括體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，Elisa試劑盒驗(yàn)證以及采用BIAcore生物大分子相互作用儀通過(guò)體外表面等離子體共振技術(shù)對(duì)中藥單體化合物與靶點(diǎn)蛋白的結(jié)合活性進(jìn)行驗(yàn)證[43]。

4.4 中藥靶點(diǎn)蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的研究 隨著蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的發(fā)展，人們?cè)絹?lái)越認(rèn)識(shí)到蛋白質(zhì)相互作用的重要性。每一個(gè)蛋白都是一個(gè)重要的個(gè)體，通過(guò)相互作用的網(wǎng)絡(luò)將這些個(gè)體聯(lián)系起來(lái)從而發(fā)揮功能。中藥常是多成分體系，對(duì)蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)的影響更能表明中藥體系的實(shí)際藥效。目前研究蛋白質(zhì)相互作用的技術(shù)包括酵母雙雜交、Pulldown、免疫共沉淀、親和色譜和表面等離子共振等。目前的蛋白質(zhì)相互作用數(shù)據(jù)庫(kù)有STRING數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//string.embl.de）、DIP數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//dip.doembi.Ucla.edu）、BIND數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//bind.ca）等。例如2011年Feng[25]和Ma等[26]分別采用該方法繪制了丹酚酸B的靶點(diǎn)蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。而對(duì)于網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中的一些關(guān)鍵蛋白，可以采用基因敲除或過(guò)表達(dá)的方式來(lái)驗(yàn)證其相互作用。盡管中藥靶點(diǎn)蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的研究非常重要，但由于中藥體系的復(fù)雜性以及蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的多樣性，使得這一工作進(jìn)展緩慢，相關(guān)報(bào)道仍然較少，也極少有突出性的成果。

4.5 中藥體系靶點(diǎn)蛋白修飾譜的研究 隨著質(zhì)譜技術(shù)的發(fā)展，許多蛋白修飾的研究成為可能。如2006 年，美國(guó)的Kim 等[44]首次使用在全蛋白質(zhì)組學(xué)水平進(jìn)行乙?；揎椦芯康姆椒?，用賴(lài)氨酸乙?；禺愋钥贵w富集乙?；亩?，然后nanoHPLCMS/MS 進(jìn)行鑒定，在200多個(gè)蛋白質(zhì)中鑒定出大約 400 個(gè)賴(lài)氨酸乙?；稽c(diǎn)。Liu等[45]在對(duì)人血漿 N糖蛋白質(zhì)進(jìn)行研究時(shí)，采用免疫親和的方法結(jié)合肼化學(xué)法富集糖基化蛋白質(zhì)，采用FTICR對(duì)鑒定的糖基化位點(diǎn)的可靠性進(jìn)行評(píng)估，總共鑒定了 303個(gè)N糖蛋白質(zhì)的2 053個(gè)N糖肽。Peng 等[46]運(yùn)用親和標(biāo)簽富集泛素化蛋白，再結(jié)合強(qiáng)陽(yáng)離子交換色譜（SCX）、RPLC分離泛素化肽段，通過(guò) LCQ 串聯(lián)質(zhì)譜鑒定酵母中的1 075個(gè)泛素化蛋白質(zhì)，110個(gè)泛素化位點(diǎn)。而磷酸化修飾通常包括絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸磷酸化三類(lèi)，分離富集技術(shù)包括：金屬親和磷酸化蛋白質(zhì)磷酸化肽段（IMAC）、免疫沉淀、 SCX、強(qiáng)陰離子交換色譜（SAX）、反相色譜等。如Hayduk等[47]采用一種可專(zhuān)門(mén)針對(duì)磷酸化蛋白質(zhì)進(jìn)行染色的熒光染料 ProQ Diamond 并結(jié)合雙向電泳對(duì)中國(guó)倉(cāng)鼠卵細(xì)胞的磷酸化蛋白質(zhì)進(jìn)行了觀測(cè)，在1 877個(gè)總蛋白點(diǎn)中觀測(cè)到了672個(gè)磷酸化蛋白質(zhì)點(diǎn)，約占總蛋白質(zhì)的36%。

盡管翻譯后修飾蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)條件還不完全成熟，而比較中藥體系靶點(diǎn)蛋白翻譯后修飾譜的研究更是少之又少，但由于翻譯后修飾是蛋白質(zhì)功能的主要方式，因此翻譯后修飾是未來(lái)蛋白質(zhì)組學(xué)的主要的發(fā)展方向，那么中藥蛋白質(zhì)組學(xué)的研究方向也必然需要向這一方面發(fā)展。

5 結(jié)語(yǔ)

中藥是人們經(jīng)過(guò)數(shù)千年的努力累積起來(lái)的寶貴資源，其安全性、有效性和科學(xué)性毋庸置疑。采用新近發(fā)展的各種組學(xué)技術(shù)來(lái)認(rèn)識(shí)中藥的作用機(jī)制、作用物質(zhì)基礎(chǔ)和安全性是值得提倡的。而蛋白質(zhì)組學(xué)在中藥體系的研究中，其合理性和可行性獲得廣大中藥研究者的認(rèn)可。同時(shí)，蛋白質(zhì)組學(xué)在中藥復(fù)雜體系中的應(yīng)用為中藥的現(xiàn)代化發(fā)展帶來(lái)巨大的機(jī)遇。但是蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)來(lái)中藥作用機(jī)制的研究中仍然處于初級(jí)階段，往往流于蛋白質(zhì)表達(dá)譜的變化，卻沒(méi)有更深入的對(duì)機(jī)制的探索。筆者認(rèn)為未來(lái)中藥研究者需要從兩方面提升中藥蛋白質(zhì)組學(xué)的發(fā)展，一是應(yīng)用更先進(jìn)的外部技術(shù)，如開(kāi)發(fā)適用于中藥復(fù)雜體系作用機(jī)制研究的高通量蛋白質(zhì)組學(xué)研究方法，中藥復(fù)雜體系對(duì)翻譯后修飾的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的應(yīng)用，蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的研究等。二是提升中藥作用機(jī)制的研究深度，各種組學(xué)技術(shù)更多的是提供新發(fā)現(xiàn)和探索未知的工具，而中藥作用機(jī)制的深度研究是未來(lái)中藥走向世界的必經(jīng)之路。相信隨著技術(shù)的不斷進(jìn)步，中藥現(xiàn)代化和走向世界指日可待。

[參考文獻(xiàn)]

[1] 劉昌孝. 對(duì)中藥現(xiàn)代化及中藥國(guó)際化發(fā)展的思考[J]. 中國(guó)藥房，2016，27（11）：1441.

[2] Wang X， Zhang A， Wang P， et al. Metabolomics coupled with proteomics advancing drug discovery toward more agile development of targeted combination therapies[J]. Mol Cell Proteomics，2013， 12（5）：1226.

[3] Dove A. Proteomics：translating genomics into products？[J]. Nat Biotechnol，1999， 17（3）：233.

[4] Walsh B J， Molloy M P， Williams K L. The australian proteome analysis facility （APAF）：assembling large scale proteomics through integration and automation[J]. Electrophoresis，1998，19（11）：1883.

[5] Geisow M J. Proteomics：one small step for a digital computer， one giant leap for humankind[J]. Nat Biotechnol，1998，16（2）：206.

[6] Rudert F. Genomics and proteomics tools for the clinic[J].Curr Opin Mol Ther，2000，2（6）：633.

[7] Nelson R W， Nedelkov D，Tubbs K A. Biosensor chip mass spectrometry：a chipbased proteomics approach[J]. Electrophoresis，2000，21（6）：1155.

[8] Lu C L， Qu X Y， Jiang J G. Proteomics and syndrome of Chinese medicine[J]. J Cell Mol Med，2010，14（12）：2721.

[9] Wang Y， Shen Y， Shen Z， et al. Comparative proteomic analysis of the response to silver ions and yeast extract in Salvia miltiorrhiza hairy root cultures[J]. Plant Physiol Biochem，2016，107：364.

[10] Mohamad Ansor N， Abdullah N， Aminudin N. Antiangiotensin converting enzyme （ACE） proteins from mycelia of Ganoderma lucidum （Curtis） P. Karst[J]. BMC Complement Altern Med，2013，13：256.

[11] Raharjo T J， Widjaja I， Roytrakul S， et al. Comparative proteomics of Cannabis sativa plant tissues[J]. J Biomol Tech，2004， 15（2）：97.

[12] Ma R， Sun L， Chen X， et al. Proteomic changes in different growth periods of ginseng roots[J]. Plant Physiol Biochem，2013， 67：20.

[13] Colzani M， Altomare A， Caliendo M， et al. The secrets of Oriental panacea：Panax ginseng[J]. J Proteomics，2016， 130：150.

[14] Sun H， Liu F， Sun L， et al. Proteomic analysis of amino acid metabolism differences between wild and cultivated Panax ginseng[J]. J Ginseng Res，2016， 40（2）：113.

[15] Tian N， Liu S， Li J， et al. Metabolic analysis of the increased adventitious rooting mutant of Artemisia annua reveals a role for the plant monoterpene borneol in adventitious root formation[J]. Physiol Plant，2014， 151（4）：522.

[16] Wu T， Wang Y， Guo D. Investigation of glandular trichome proteins in Artemisia annua L. using comparative proteomics[J]. PLoS ONE，2012， 7（8）：e41822.

[17] Rai R， Pandey S， Shrivastava A K， et al. Enhanced photosynthesis and carbon metabolism favor arsenic tolerance in Artemisia annua， a medicinal plant as revealed by homologybased proteomics[J]. Int J Proteomics，2014， 2014：163962.

[18] Bryant L， Flatley B， Patole C， et al. Proteomic analysis of Artemisia annua——towards elucidating the biosynthetic pathways of the antimalarial prodrug artemisinin[J]. BMC Plant Biol，2015， 15：175.

[19] Zhu W， Yang B， Komatsu S， et al. Binary stress induces an increase in indole alkaloid biosynthesis in Catharanthus roseus[J]. Front Plant Sci，2015， 6：582.

[20] Yue Q X， Cao Z W， Guan S H， et al. Proteomics characterization of the cytotoxicity mechanism of ganoderic acid D and computerautomated estimation of the possible drug target network[J]. Mol Cell Proteomics，2008， 7（5）：949.

[21] Yue Q X， Song X Y， Ma C， et al. Effects of triterpenes from Ganoderma lucidum on protein expression profile of HeLa cells[J]. Phytomedicine，2010， 17（8/9）：606.

[22] Pan T L， Wang P W， Hung Y C， et al. Proteomic analysis reveals tanshinone ⅡA enhances apoptosis of advanced cervix carcinoma CaSki cells through mitochondria intrinsic and endoplasmic reticulum stress pathways[J]. Proteomics，2013， 13（23/24）：3411.

[23] Pan T L， Hung Y C， Wang P W， et al. Functional proteomic and structural insights into molecular targets related to the growth inhibitory effect of tanshinone ⅡA on HeLa cells[J]. Proteomics，2010， 10（5）：914.

[24] Chou H C， Lu Y C， Cheng C S， et al. Proteomic and redoxproteomic analysis of berberineinduced cytotoxicity in breast cancer cells[J]. J Proteomics，2012， 75（11）：3158.

[25] Feng L X， Jing C J， Tang K L， et al. Clarifying the signal network of salvianolic acid B using proteomic assay and bioinformatic analysis[J]. Proteomics，2011， 11（8）：1473.

[26] Ma C， Yao Y， Yue Q X， et al. Differential proteomic analysis of platelets suggested possible signal cascades network in platelets treated with salvianolic acid B[J]. PLoS ONE，2011， 6（2）：e14692.

[27] Cui Y J， Guan S H， Feng L X， et al. Cytotoxicity of 9，11dehydroergosterol peroxide isolated from Ganoderma lucidum and its targetrelated proteins[J]. Nat Prod Commun，2010， 5（8）：1183.

[28] Fu W M， Zhang J F， Wang H， et al. Apoptosis induced by 1，3，6，7tetrahydroxyxanthone in Hepatocellular carcinoma and proteomic analysis[J]. Apoptosis，2012， 17（8）：842.

[29] Yao Y， Liu A H， Wu W Y， et al. Possible targetrelated proteins of salvianolic acids in rat platelets[J]. Phytochem Lett，2008， 1（3）：135.

[30] Yao Y， Wu W Y， Guan S H， et al. Proteomic analysis of differential protein expression in rat platelets treated with notoginsengnosides[J]. Phytomedicine，2008， 15（10）：800.

[31] Ramachandran U， Manavalan A， Sundaramurthi H， et al. Tianma modulates proteins with various neuroregenerative modalities in differentiated human neuronal SHSY5Y cells[J]. Neurochem Int，2012， 60（8）：827.

[32] Manavalan A， Feng L， Sze S K， et al. New insights into the brain protein metabolism of Gastrodia elatatreated rats by quantitative proteomics[J]. J Proteomics，2012，75（8）：2468.

[33] Zhu Y， Liu Y， Qian Y， et al. Research on the efficacy of Celastrus orbiculatus in suppressing TGFbeta1induced epithelialmesenchymal transition by inhibiting HSP27 and TNFalphainduced NFkappa B/Snail signaling pathway in human gastric adenocarcinoma[J]. BMC Complement Altern Med，2014，14：433.

[34] Li X Z， Zhang S N， Wang K X， et al. iTRAQbased quantitative proteomics study on the neuroprotective effects of extract of Acanthopanax senticosus harm on SHSY5Y cells overexpressing A53T mutant alphasynuclein[J]. Neurochem Int，2014， 72：37.

[35] NguyenKhuong T， White M Y， Hung T T， et al. Alterations to the protein profile of bladder carcinoma cell lines induced by plant extract MINA05 in vitro[J]. Proteomics，2009，9（7）：1883.

[36] Huang J C， Zhao P C， Zhang H Z， et al. A proteomical study on the radiosensitized target molecules of Fuzheng Zengxiao formula in pulmonary adenocarcinoma nude mice model[J]. J Tradit Chin Med，2011，31（1）：3.

[37] Fan X， Li X， Lv S， et al. Comparative proteomics research on rat MSCs differentiation induced by Shuanglong formula[J]. J Ethnopharmacol，2010，131（3）：575.

[38] Pan T L， Wang P W， Huang C H， et al. Herbal formula， Scutellariae Radix and Rhei Rhizoma attenuate dimethylnitrosamineinduced liver fibrosis in a rat model[J]. Sci Rep，2015，5：11734.

[39] Wang Q S， Cui Y L， Wang Y F， et al. Effects of compounds from biqi capsule on the expression of inflammatory mediators in lipopolysaccharidestimulated RAW 264.7 macrophages[J]. J Ethnopharmacol，2011，136（3）：480.

[40] Wang Q S， Cui Y L， Dong T J， et al. Ethanol extract from a Chinese herbal formula， "Zuojin Pill"， inhibit the expression of inflammatory mediators in lipopolysaccharidestimulated RAW 264.7 mouse macrophages[J]. J Ethnopharmacol，2012，141（1）：377.

[41] Li J， Zhao P， Yang L， et al. System biology analysis of longterm effect and mechanism of Bufei Yishen on COPD revealed by system pharmacology and 3omics profiling[J]. Sci Rep，2016，6：25492.

[42] Meyer E F. The first years of the Protein Data Bank[J]. Protein Sci，1997， 6（7）：1591.

[43] Moll D， Prinz A， Gesellchen F， et al. Biomolecular interaction analysis in functional proteomics[J]. J Neural Transm （Vienna），2006， 113（8）：1015.

[44] Kim J E， Tannenbaum S R， White F M. Global phosphoproteome of HT29 human colon adenocarcinoma cells[J]. J Proteome Res，2005，4（4）：1339.

[45] Liu T， Qian W J， Gritsenko M A， et al. Human plasma Nglycoproteome analysis by immunoaffinity subtraction， hydrazide chemistry， and mass spectrometry[J]. J Proteome Res，2005， 4（6）：2070.

[46] Peng J， Schwartz D， Elias J E， et al. A proteomics approach to understanding protein ubiquitination[J]. Nat Biotechnol，2003， 21（8）：921.

[47] Hayduk E J， Choe L H， Lee K H. A twodimensional electrophoresis map of Chinese hamster ovary cell proteins based on fluorescence staining[J]. Electrophoresis，2004， 25（15）：2545.

[責(zé)任編輯 孔晶晶]