天然產(chǎn)物合成生物學(xué)關(guān)鍵技術(shù)

匡雪君　鄒麗秋　李瀅　孫超　陳士林

[摘要] 結(jié)構(gòu)復(fù)雜多樣的天然產(chǎn)物是新藥發(fā)現(xiàn)的重要源泉。通過天然產(chǎn)物合成生物學(xué)來實(shí)現(xiàn)天然產(chǎn)物的異源合成，被認(rèn)為是解決復(fù)雜、稀缺天然產(chǎn)物來源問題最具前景的途徑。DNA組裝技術(shù)與基因組編輯技術(shù)是天然產(chǎn)物合成生物學(xué)研究的兩大關(guān)鍵技術(shù)。前者可以將多個元件組裝成超長DNA片段，實(shí)現(xiàn)代謝途徑的重建，后者可以通過底盤基因組的改造，增加底盤與外源途徑的適配性。該文綜述了DNA組裝技術(shù)與基因組編輯技術(shù)的最新研究進(jìn)展，以期為天然產(chǎn)物合成生物學(xué)體系的構(gòu)建和優(yōu)化提供幫助。

[關(guān)鍵詞] 天然產(chǎn)物； 合成生物學(xué)； DNA組裝； 基因組編輯

Key technologies in synthetic biology of natural products

KUANG Xuejun1， ZOU Liqiu1， LI Ying1， SUN Chao1*， CHEN Shilin2*

（1.Institute of Medicinal Plant Development， China Academy of Medical Sciences and Peking Union

Medical College， Beijing 100193， China；

2. Institute of Chinese Materia Medica， China Academy of Chinese Medical Sciences， Beijing 100700， China）

[Abstract] Natural products with complex and diverse structures are the major sources of new drugs. The biosynthesis of natural products is considered to be one of the best ways to solve the problems of complex and scarce natural products. DNA assembly technology and genome editing technology are two key technologies in the emerging interdisciplinary field of synthetic biology. A number of novel DNA assembly methods developed in the last few years have paved the way for the engineering of high molecular weight DNA molecules， including whole genomes， hence， it can realize the reconstruction of the metabolic pathways and speed up optimization process. A wide variety of new tools for microbial genome editing will be applied widely to modify the chassis genome to increase its adaptation with the exogenetic pathways. This article summarized the latest advance with respect to DNA assembly and genome editing， which aims to provide help for reconstruction and optimization of the synthetic biological systems of natural products.

[Key words] natural products； synthetic biology； DNA assembly； genome editing

doi：10.4268/cjcmm20162205

來源于植物、動物、微生物的天然產(chǎn)物往往天然含量低，組分復(fù)雜，提取分離難以得到單一的化合物，采用化學(xué)合成的方法也由于合成路線復(fù)雜，反應(yīng)條件難以控制，合成率低，無法滿足市場需求[12]。因此，采用合成生物學(xué)的方法將外源的代謝途徑引入易于遺傳改造的模式微生物中，實(shí)現(xiàn)復(fù)雜天然產(chǎn)物或其前體的高效生產(chǎn)是目前應(yīng)用前景最廣闊的一種方法[3]。

目前，運(yùn)用天然產(chǎn)物合成生物學(xué)已經(jīng)成功實(shí)現(xiàn)抗瘧藥青蒿素[4]、抗癌藥紫杉醇[5]及長春堿[6]前體的生物合成。要實(shí)現(xiàn)外源途徑在底盤系統(tǒng)中的重建并高效合成目標(biāo)產(chǎn)物離不開2項(xiàng)關(guān)鍵技術(shù)：DNA組裝技術(shù)和基因組編輯技術(shù)。前者有效地彌補(bǔ)了DNA化學(xué)合成長度的不足，可成功實(shí)現(xiàn)長達(dá)1 Mb大片段DNA的組裝[7]，從而保障了含多個元件的外源合成途徑的正確組裝；后者可以對底盤細(xì)胞基因組進(jìn)行改造，提高與外源途徑的適配性，精確調(diào)控外源基因表達(dá)，減少中間產(chǎn)物對宿主的毒性，提高目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)量[8]。

1 DNA組裝技術(shù)

采用DNA從頭合成技術(shù)產(chǎn)生的DNA片段長度大多為500～1 000 bp，當(dāng)合成更長的DNA片段時則需要將DNA小片段按順序組裝起來，這就涉及DNA組裝技術(shù)[910]。將基因元件組裝為可復(fù)制的和表達(dá)的DNA分子對于代謝途徑或基因環(huán)路的構(gòu)建是非常關(guān)鍵的，DNA組裝方法用于基因環(huán)路的設(shè)計(jì)和特征化不僅有助于細(xì)胞內(nèi)及細(xì)胞間調(diào)控機(jī)制的理解，而且能加速途徑優(yōu)化進(jìn)程；此外，DNA組裝方法可以通過激活天然產(chǎn)物生物合成相關(guān)的隱藏或沉默的基因簇來發(fā)現(xiàn)新型天然產(chǎn)物[1112]?；诓煌臋C(jī)制，DNA組裝技術(shù)可分為四大類：基于限制性內(nèi)切酶的組裝、基于寡核苷酸架橋的組裝、基于同源重組的體外組裝和基于同源重組的體內(nèi)組裝。

1.1 基于限制性內(nèi)切酶的方法

1.1.1 依賴于同尾酶的BioBrick/BglBrick 同尾酶（如BglⅡ和BamHⅠ，XbaⅠ和SpeⅠ等）是一類識別DNA分子中不同核苷酸序列，但能產(chǎn)生相同黏性末端的限制性內(nèi)切酶[13]。Biobrick是首個實(shí)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)生物元件（如啟動子、核糖體結(jié)合位點(diǎn)、開放閱讀框、編碼序列和終止子等）順序組裝的DNA組裝方法[14]。該法運(yùn)用限制酶切和連接不僅能完成標(biāo)準(zhǔn)生物元件的平臺構(gòu)建，由于元件之間兼容，也能對形成的元件重新裝配，組裝成大型DNA片段。每個DNA元件上游與EcoRⅠ和XbaⅠ酶切位點(diǎn)相鄰，下游與SpeⅠ和PstⅠ酶切位點(diǎn)相鄰。同尾酶XbaⅠ和SpeⅠ識別不同的酶切位點(diǎn)，產(chǎn)生相同的黏性末端，一旦2個DNA元件連接，元件之間產(chǎn)生疤痕序列（ACTAGA），原來的酶切位點(diǎn)將不復(fù)存在，也就不能被原有的限制酶所識別，所以連接產(chǎn)物用XbaⅠ或SpeⅠ酶切均不能將其消化[15]。需要注意的是元件與質(zhì)粒骨架上不能有同尾酶酶切位點(diǎn)。Biobrick連接后的疤痕序列（ACTAGA）翻譯后為蘇氨酸精氨酸，不會產(chǎn)生移框突變和提前終止，可用于融合蛋白的表達(dá)。近來出現(xiàn)的BglBrick[16]改進(jìn)了原始的BioBrick法，DNA元件側(cè)翼相鄰的是甲基化的不敏感的酶BglⅡ和BamHⅠ，大大提高了連接效率，疤痕序列（GGATCT）編碼甘氨酸絲氨酸，故BioBrick也能用于蛋白融合。BioBrick和BglBrick 1次連接2個DNA片段，僅利用一對同尾酶，就可以實(shí)現(xiàn)DNA片段的多次組裝[13]。

1.1.2 Golden gate 克隆法 Golden gate 克隆法利用Ⅱ型限制性內(nèi)切酶（ⅡS型酶，如BsaⅠ和AarⅠ）對DNA識別序列的相鄰的特定位置進(jìn)行剪切，利用同種限制酶產(chǎn)生不同的黏性末端（4個核苷酸的懸突），消化片段連接的產(chǎn)物沒有初始的酶切位點(diǎn)[17]。此方法允許37°酶切消化和16°連接環(huán)化一步完成，且克服傳統(tǒng)多片段組裝時限制酶種類的限制，還可進(jìn)行無縫連接[18]。由于Golden gate 克隆可用于重復(fù)序列的組裝，基因組編輯工具轉(zhuǎn)錄激活樣效應(yīng)子核酶（TALENs）蛋白的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域是由序列差異很小的多個模塊組成，所以可以對TALENs進(jìn)行人工設(shè)計(jì)組裝[19]；該方法也可用于基因環(huán)路的構(gòu)建，陳威華等[20]使用可識別甲基化序列mCNNR（R=A或G）的內(nèi)切酶MspJⅠ開發(fā)MASTER（methylationassisted tailorable ends rational），并利用該方法成功克隆了29 kb的天藍(lán)色鏈霉菌放線紫紅素生物合成基因簇。MASTER用含有5甲基胞嘧啶的引物擴(kuò)增需要組裝的片段，限制性內(nèi)切酶僅消化目標(biāo)終端序列，更適于組裝長的DNA片段，但是甲基化引物相對昂貴，并且長片段DNA的擴(kuò)增可能會引入錯誤。

1.2 基于寡核苷酸的架橋法

連接酶循環(huán)反應(yīng)（the ligase cycling reaction， LCR）利用熱穩(wěn)定的連接酶和寡核苷酸進(jìn)行組裝[21]。LCR使用架橋寡核苷酸連接不具有重復(fù)序列的片段，每個架橋寡核苷酸含有與待連接DNA片段末端互補(bǔ)的序列，使上游片段的3′與下游片段的5′連接，從而使2個DNA片段組裝成單個的線性片段[22]。近來，De 等運(yùn)用這項(xiàng)技術(shù)將12個DNA片段組裝到一個20 kb的質(zhì)粒上[23]。

1.3 基于體外同源重組的組裝

1.3.1 重疊延伸PCR技術(shù) 重疊延伸PCR技術(shù)（splicing by overlapping extension PCR，SOEPCR），又稱交錯延伸剪接PCR技術(shù)或套疊PCR技術(shù)[24]。該技術(shù)采用具有互補(bǔ)末端的引物，使PCR產(chǎn)物形成相互重疊的鏈，在隨后的擴(kuò)增反應(yīng)中通過重疊鏈的延伸，將不同來源的擴(kuò)增片段拼接起來[25]。不需要限制性內(nèi)切酶消化和連接酶處理就可實(shí)現(xiàn)任意2個目的基因的連接，同時由于不引入目的基因以外的其他序列，可避免因加入連接序列導(dǎo)致的表達(dá)蛋白功能異常[24] 。Tan等[26]利用此技術(shù)和長片段PCR結(jié)合使用，并且在實(shí)驗(yàn)中采用高保真聚合酶 pfu 的校正功能，成功地組裝了不同的長度DNA 分子，拼接長度可達(dá)20 kb，融合的錯誤率僅有1/16 600。此技術(shù)可用于2個或2個以上異源基因DNA片段的拼接，并且在插入大片段的定點(diǎn)突變、敲除基因片段以及基因的體外分子進(jìn)化研究上具有獨(dú)特的優(yōu)勢[26]。

1.3.2 序列及連接非依賴性克隆 序列及連接非依賴性克隆法（sequence and ligationindependent cloning，SLIC）利用T4DNA聚合酶，產(chǎn)生獨(dú)特的互補(bǔ)末端，然后采用單鏈退火或RecA介導(dǎo)的體外重組，從而實(shí)現(xiàn)DNA片段的拼接[2728]。SLIC法雖然1次可組裝超過10個片段，但需要很長的DNA重疊區(qū)，如組裝4個片段需要至少40 bp長的重疊區(qū)[27]。為了減少重疊區(qū)的DNA長度，降低引物合成費(fèi)用，Zhang等隨后開發(fā)出SLiCE （seamless ligation cloning extract）方法，采用廉價的大腸桿菌細(xì)胞提取物驅(qū)動同源重組介導(dǎo)的DNA組裝，極大的減少了花費(fèi)[29]。

1.3.3 USER克隆法 采用USER（uracilspecific excision reagent）克隆法可以實(shí)現(xiàn)DNA序列與載體的連接[30]。首先在載體上加上一小段cassette，cassette區(qū)域含有載體上不存在的限制性內(nèi)切酶識別位點(diǎn)，且在識別位點(diǎn)兩端加上2個不同的堿基對控制方向，反方向的鏈上加上2個切口酶識別位點(diǎn)[31]。改造后的質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶和切口酶處理后，產(chǎn)生8個堿基對的懸突。組裝片段之間共有的重疊片段均以腺嘌呤起始，并以胸腺嘧啶結(jié)束，長度為6～17 bp。采用特定的寡核苷酸來擴(kuò)增連接片段，重疊區(qū)域3′的胸腺嘧啶殘基被尿嘧啶替換，校對聚合酶能讀取尿嘧啶堿基（如Pfu Turbo Cx或Phusion U），然后將質(zhì)粒骨架、雙鏈DNA片段與USER混合酶混合[32]。混合酶中含有尿嘧啶DNA糖苷酶（催化尿嘧啶的刪除，形成一個脫堿基位點(diǎn)）、DNA糖苷酶裂解酶（斷裂磷酸二酯骨架，釋放無堿基的脫氧核糖單糖），所有的片段形成互補(bǔ)的5′懸突，自退火形成帶有單鏈裂痕的環(huán)狀分子，然后轉(zhuǎn)化到宿主進(jìn)行修復(fù)[33]。組裝的DNA片段之間是無痕連接，但是用來改造載體的cassette會給DNA片段與載體之間帶來13個堿基的疤痕[31]。

1.3.4 Gibson組裝 Gibson組裝要求將多個具有重復(fù)序列的DNA片段和線性化的載體混合，同時加入3個酶的混合物，分別為：T5核酸外切酶（使所有DNA片段產(chǎn)生一個3′的懸突，重疊的部分自動退火）、Phusion聚合酶（填補(bǔ)和連接縫隙）和Taq連接酶（修復(fù)裂痕，產(chǎn)生完整的目標(biāo)產(chǎn)物）[34]。Gibson等運(yùn)用此方法2 d內(nèi)可將75個284 bp的DNA片段組裝成整個的老鼠線粒體基因組（16.3 kb）[35]。Gibson組裝方法不僅可實(shí)現(xiàn)無縫拼接，而且組裝尺度也十分可觀，不僅適用于以寡核苷酸鏈為起始的DNA合成，也適用于構(gòu)建長的DNA片段，甚至是基因組[36]。該法具有快速、簡便、易行等特點(diǎn)，但因其中酶的造價較高，在大規(guī)模使用時，不得不考慮成本。T5核酸外切酶可以完全破壞<250 bp的DNA片段，所以組裝的片段長度需>250 bp。如果片段長度<250 bp可以在Gibson組裝之前使用重疊延伸PCR等技術(shù)使其長度達(dá)到要求[37]。

1.4 基于體內(nèi)同源重組的組裝

為了組裝得到更長的DNA序列，除了體外的Gibson組裝等方法，科學(xué)家們將注意力轉(zhuǎn)移到了體內(nèi)同源重組，包括枯草芽孢桿菌、大腸桿菌和釀酒酵母重組系統(tǒng)。

1.4.1 酵母體內(nèi)組裝 酵母同源重組頻率高，并且擁有精確的DNA修復(fù)機(jī)制，使其成為同時組裝多個DNA片段理想的底盤細(xì)胞[38]。酵母同源重組可以有效連接有40 bp重疊序列的DNA片段，Kuijpers等[39]改進(jìn)了這一方法，通過使用60 bp與酵母基因組不同源的重組序列將9個DNA片段組裝到一個21 kb的質(zhì)粒上，裝配成功率達(dá)到95%。近來，出現(xiàn)了一個改進(jìn)的RADOM（rapid assembly of DNA overlapping multifragments） 組裝方法[40]， RADOM法將酵母同源重組與大腸桿菌的藍(lán)白斑篩選結(jié)合起來，大大減少了組裝時間。通過提取酵母轉(zhuǎn)化株中的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌，借助藍(lán)白斑篩選可以區(qū)分?jǐn)y帶組裝DNA片段的載體與空載體，所以能快速地完成大規(guī)模的陽性菌株的篩選，已經(jīng)被成功用于3 kb和10 kb酵母染色體的組裝。

除了DNA組裝，酵母同源重組也常用于將外源DNA整合到基因組上，用于代謝工程與復(fù)雜酶途徑的構(gòu)建[41]。最近發(fā)展起來的CasEMBLR法能將沒有標(biāo)記的DNA片段插入酵母染色體多個位點(diǎn)，利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)在基因組目標(biāo)插入位點(diǎn)引入雙鏈DNA斷裂，通過同源重組極大的提高了染色體插入效率，此法已被用于將類胡蘿卜素途徑中的15個基因整合到酵母中3個目標(biāo)位點(diǎn)和將酪氨酸合成途徑中的10個酶基因整合到2個目標(biāo)位點(diǎn)[42]。

1.4.2 枯草芽胞桿菌體內(nèi)組裝 桿狀的革蘭氏陽性菌枯草芽胞桿菌Bacillus subtilis也是合成生物學(xué)研究中是一個頻繁使用的宿主。Hao等[43]在芽胞桿菌中建立了一套較為完善的不同尺度DNA組裝體系，“Culture mix method”用于上百kb的直接克隆，“Domino method”用于幾kb到上百kb的組裝，“Inchworm method”用于幾Mb基因組的拼接。枯草芽胞桿菌基因組（B. subtilis genome，BGM）載體系統(tǒng)是一個新型的克隆系統(tǒng)，使用整個枯草芽胞桿菌的基因組作為載體，引入的外源DNA可以以一種單鏈的形式轉(zhuǎn)化進(jìn)入枯草芽胞桿菌細(xì)胞質(zhì)，通過RecA介導(dǎo)的同源重組將多個大型DNA片段整合到枯草芽胞桿菌染色體上。BGM含有4.2 Mb枯草芽胞桿菌全基因組，允許大型DNA片段的整合。2005年，Itaya等采用“inchworm method”法成功將集胞藻Synechocystis基因組（3.5 Mb）導(dǎo)入到枯草芽胞桿菌中，構(gòu)建了1個7.7 Mb的集成基因組[44]。然而，該方法需要100 kb以上的DNA片段作為模板，其應(yīng)用受到了限制。于是，相繼開發(fā)了“Domino method”，借助BGM載體系統(tǒng)，利用同源重組原理與逐級添加模式，已經(jīng)被用于克隆16.3 kb的老鼠線粒體基因組和134.5 kb的大米葉綠體基因組[45]?！癉omino method”不要求純化長鏈DNA模板，并且促進(jìn)DNA穩(wěn)定的插入BGM，但由于比較耗時，組裝過程需長的同源臂，目前還未得到普遍使用。2010年，Itaya及其同事們[46]發(fā)現(xiàn)，含有大質(zhì)粒（>100 kb）的大腸桿菌被噬菌體侵染后，其中的大質(zhì)粒仍能夠穩(wěn)定存在。當(dāng)直接混合大腸桿菌裂解液與芽胞桿菌感受態(tài)細(xì)胞，可以將DNA大片段穩(wěn)定整合到芽胞桿菌的基因組上，隨即開發(fā)了“culture mix method”，利用這種天然轉(zhuǎn)化方式，實(shí)現(xiàn)了DNA大片段的直接克隆。

1.4.3 大腸桿菌體內(nèi)組裝 和釀酒酵母和枯草芽胞桿菌不同的是，不能轉(zhuǎn)化線性的DNA片段進(jìn)入大腸桿菌Escherichia coli，因?yàn)榫€性的dsDNA會被依賴于ATP的核酸外切酶RecBCD分解[47]?；讦耸删wRed重組酶的同源重組系統(tǒng)頻繁被用于將DNA整合到大腸桿菌中，介導(dǎo)線性DNA分子與環(huán)狀的質(zhì)粒發(fā)生同源重組[48]。λ噬菌體主管同源重組的重組酶系統(tǒng)稱為Red，包含3種蛋白質(zhì)分子，分別稱為Exo，Beta和Gam。Exo蛋白是具有5′3′活性的核酸外切酶，結(jié)合到dsDNA末端，通過消化5′ DNA末端產(chǎn)生3′ ssDNA懸突；Beta蛋白與ssDNA懸突結(jié)合，退火與ssDNA結(jié)合；Gam蛋白抑制核酸外切酶RecBCD結(jié)合到dsDNA的末端[47]。Ssbri等用該系統(tǒng)的KIKO（knockin/knockout）載體成功將5.4，7.3，11.3 kb的DNA片段整合到大腸桿菌基因組中[49]。近來，λ噬菌體Red重組酶介導(dǎo)的同源重組與噬菌體80Int介導(dǎo)的位點(diǎn)特異性同源重組結(jié)合的技術(shù)也被運(yùn)用于染色體整合，如將8 kb的DNA片段整合到大腸桿菌染色體上[50]。

Rac原噬菌體也可用于大片段DNA在大腸桿菌中組裝。Rac原噬菌體的RecE/RecT重組系統(tǒng)功能上與噬菌體λ的Red蛋白重組酶系統(tǒng)類似（RecE 和RecT分別與Exo 和 Beta類似）[51]。研究顯示噬菌體λ的Red蛋白重組酶系統(tǒng)適用于線性和環(huán)狀DNA分子的結(jié)合，而Rac的RecE/RecT 系統(tǒng)更適用于2個線性DNA分子的連接[52]。

2 底盤基因組的編輯技術(shù)

采用基因組編輯技術(shù)幾乎可以對任意基因進(jìn)行編輯和修飾[8]。近年來，基因組范圍的高效編輯技術(shù)發(fā)展迅速，對宿主基因組的改造效率也不斷提升，能更加有效地解決宿主菌株改造中的許多瓶頸問題，例如：大片段基因組的改造、復(fù)雜表型的改造、基因組上多重位點(diǎn)的組合優(yōu)化和不需抗生素進(jìn)行輔助篩選的高效基因組修飾等[53]。此外，對宿主基因組進(jìn)行適當(dāng)精簡，只保留存活所需的“必須基因”，能大大改善宿主細(xì)胞對底物、能量的利用效率[54]。

2.1 ZFNs

鋅指核酸酶（zincfinger nucleases， ZFNs）是第一種通過人工改造并成功應(yīng)用的核酸內(nèi)切酶，由負(fù)責(zé)DNA特異識別的鋅指蛋白 （zinc finger protein，ZFP）和FokⅠ核酸內(nèi)切酶融合而成[55]。其N末端為鋅指蛋白DNA結(jié)合域，由一系列Cys2His2鋅指蛋白串聯(lián)而成，識別并結(jié)合特異的三聯(lián)體堿基；C末端為非特異性核酸內(nèi)切酶FokⅠ結(jié)構(gòu)域，只有當(dāng)2個ZFN單體同時與各自的DNA位點(diǎn)結(jié)合時才能形成有切割活性的FokⅠ二聚體，從而在靶位點(diǎn)將DNA切斷。由于 FokⅠ內(nèi)切酶需要形成二聚體方能發(fā)揮活性，所以由隨意剪切產(chǎn)生的脫靶幾率會大為減少。使用者只需針對目的基因設(shè)計(jì)8～10個鋅指結(jié)構(gòu)域， 再將這些鋅指結(jié)構(gòu)域與核酸內(nèi)切酶結(jié)合，就構(gòu)建好了靶向特定位點(diǎn)的 ZFNs[56] 。ZFNs的應(yīng)用研究開始較早，目前以其為基礎(chǔ)的基因治療藥物已經(jīng)進(jìn)入臨床研究階段，同時，在生物制藥領(lǐng)域的應(yīng)用也比較成熟，但是ZFNs的設(shè)計(jì)篩選費(fèi)時費(fèi)力，而且可能存在一定的脫靶率，使其未能成為廣泛應(yīng)用的常規(guī)技術(shù)[57]。

2.2 TALENs

轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)因子核酸酶（transcription activatorlike effector nucleases， TALENs）與ZFNs類似，由轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物（transcription activatorlike effector， TALE）和FokⅠ核酸酶組成[58]。TALE蛋白以重復(fù)可變雙殘基RNDs對應(yīng)1個堿基的識別模式結(jié)合到靶標(biāo)DNA序列上。FokⅠ核酸酶只有形成二聚體時才能發(fā)揮其剪切酶的活性，所以，為了便于FokⅠ核酸酶的切割結(jié)構(gòu)形成二聚體，通常設(shè)計(jì)2個結(jié)合位點(diǎn)接近的TALEN單體。Christian等[59]研究發(fā)現(xiàn)，2個TALEN單體的靶點(diǎn)間距在13～30 bp時活性比較高，其中間距為15 bp時該核酸酶的活性最高。目前，TALENs已經(jīng)在植物、動物、酵母細(xì)胞中得到應(yīng)用，有潛力成為一種操作方便、特異性強(qiáng)的基因組定點(diǎn)修飾技術(shù)[60]。

2.3 CRISPR/Cas9

規(guī)律成簇間隔短回文重復(fù)（clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR）/Cas9系統(tǒng)能進(jìn)行基因組的高效修飾[61]。該系統(tǒng)由蛋白質(zhì)和RNA 2個部分組成，蛋白質(zhì)即切割DNA的Cas9核酸內(nèi)切酶，RNA指導(dǎo)Cas9核酸內(nèi)切酶定位到基因組的靶標(biāo)位點(diǎn)[62]。CRISPRCas9系統(tǒng)屬于細(xì)菌適應(yīng)性免疫系統(tǒng)，不同的CRISPRCas9系統(tǒng)分為3種類型，類型Ⅰ和類型Ⅲ利用多個Cas9蛋白引起靶標(biāo)DNA的斷裂，類型Ⅱ只需利用1個Cas9內(nèi)切酶就能在目標(biāo)基因組序列引入雙鏈DNA斷裂，通過與經(jīng)過特殊設(shè)計(jì)的小向?qū)NA（single guide RNA）共表達(dá)發(fā)揮作用[63]。CRISPRCas9系統(tǒng)是基因組編輯的一個重要的工具，已經(jīng)被成功地用于鏈霉菌中放線菌紫素合成途徑基因簇的失活。對該技術(shù)進(jìn)行改造產(chǎn)生了CRISPRdCas9技術(shù)，CRISPRdCas9不切割DNA，而是與轉(zhuǎn)錄激活劑或抑制劑蛋白結(jié)構(gòu)域結(jié)合，靶標(biāo)基因組中相關(guān)基因的啟動子來激活或抑制基因的表達(dá)，故可以使用這項(xiàng)技術(shù)來進(jìn)行異源宿主中途徑產(chǎn)量的優(yōu)化[64]。CRISPR/Cas9系統(tǒng)與ZFNs和CRISPR/Cas9相比，具有更好的擴(kuò)展性，且更加經(jīng)濟(jì)高效、易于構(gòu)建。目前此項(xiàng)技術(shù)已經(jīng)成功地用于天然產(chǎn)物紫色桿菌素合成途徑中中間產(chǎn)物和終產(chǎn)物的優(yōu)化[61]。

2.4 基于位點(diǎn)特異性重組酶的同源重組

基于位點(diǎn)特異性重組酶的基因組編輯是一個有效的工具?，F(xiàn)在大多利用來源于P1噬菌體的Cre/loxP位點(diǎn)和來源于酵母的Flp/FRT位點(diǎn)催化2個特異DNA序列發(fā)生重組[65]。Cre和Flp都屬于酪氨酸重組酶類，分別識別34 bp的目標(biāo)位點(diǎn)——loxP和FRT，并且催化發(fā)生位點(diǎn)特異性重組[66]。應(yīng)用這些重組酶進(jìn)行基因組編輯，其原理是在基因組上和目的 DNA 上均插入特異性識別序列，在相應(yīng)的重組酶作用下進(jìn)行重組，實(shí)現(xiàn)大片段 DNA 的插入、刪除或替換。在基因組上目的片段兩端分別插入2個重組酶識別位點(diǎn)；同樣地，外源片段含有相應(yīng)重組酶識別位點(diǎn)；通過重組酶的過量表達(dá)，即可實(shí)現(xiàn)2個特異識別位點(diǎn)之間基因組 DNA 的替換操作[67]。CreloxP重組系統(tǒng)在釀酒酵母中已經(jīng)使用得比較成熟，已被成功用于引起單基因或者雙基因的刪除，也能用于大腸桿菌中基因的刪除[66]。

2.5 基于轉(zhuǎn)座子的同源重組

轉(zhuǎn)座子（transposon）是存在于DNA上可自主復(fù)制和移位的基本單位[68]。轉(zhuǎn)座子分為簡單轉(zhuǎn)座子和復(fù)合式轉(zhuǎn)座子。簡單轉(zhuǎn)座子因沒有任何宿主基因，被直接稱為插入序列，是染色體或質(zhì)粒DNA的正常組成部分[69]。插入序列都是可以獨(dú)立存在的單元，帶有協(xié)助自身移動的蛋白；復(fù)合式轉(zhuǎn)座子是另一類帶有某些抗藥性基因或其他宿主基因的轉(zhuǎn)座子，其兩翼往往是2個相同或高度同源的插入序列?；蜣D(zhuǎn)座時發(fā)生的插入作用有一個普遍的特征，那就是受體分子中有一段3～12 bp的靶序列DNA會自我復(fù)制，使插入的轉(zhuǎn)座子位于2個重復(fù)的靶序列之間[70]。不同轉(zhuǎn)座子的靶序列長度不同，但對于一個特定的轉(zhuǎn)座子來說，所復(fù)制的靶序列長度都是一樣的。對于序列已知的目的基因，可利用轉(zhuǎn)座子將該片段引入宿主細(xì)胞內(nèi)，然后篩選突變的DNA序列替換野生型親本DNA序列，通過對突變基因的測試來研究相關(guān)基因的功能[71]。

3 展望

近年來，DNA合成與組裝技術(shù)發(fā)展迅速，已在合成生物學(xué)、遺傳網(wǎng)絡(luò)設(shè)計(jì)和基因組合成方面獲得了廣泛的應(yīng)用。但是目前的DNA合成與組裝技術(shù)也存在一些問題，例如通量低、錯誤率高、自動化程度低、成本高等，通過學(xué)科間的交叉合作，開發(fā)新的合成策略，研制新的試劑或酶，有望加快DNA組裝技術(shù)的研究進(jìn)程。同時，新型基因組編輯技術(shù)也不斷推陳出新，在基因組改造和優(yōu)化方面表現(xiàn)出巨大的潛力和廣闊的應(yīng)用前景。但這些技術(shù)的快速發(fā)展也面臨一些問題，如一些高效的基因組編輯技術(shù)只能在少數(shù)遺傳操作的模式菌中應(yīng)用，難以應(yīng)用到其他微生物。隨著DNA組裝技術(shù)和基因組編輯技術(shù)的不斷發(fā)展和完善，兩者將會在合成生物學(xué)和其他生命科學(xué)領(lǐng)域研究與應(yīng)用中發(fā)揮更重要的作用。

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