民族藥黑骨頭藥材杠柳毒苷含量測定的方法研究

楊勇幫 李健田 白玥

【摘要】目的：建立系統(tǒng)、科學(xué)的黑骨頭中杠柳毒苷的提取和含量測定的方法，為黑骨頭的質(zhì)量控制提供方法。方法：采用高效液相色譜法，色譜柱為Agilent Venusil PLOW-C18柱（4.6mm×150mm，5μm）;流動(dòng)相為水-乙腈;流速為1.0mL/min;檢測波長為220nm;柱溫為25℃。結(jié)果：黑骨頭中杠柳毒苷的峰得到有效的分離，HPLC檢測條件、方法的專屬性、線性、重復(fù)性、精密度、穩(wěn)定性、回收率良好，該方法可以用于杠柳毒苷的含量測定。結(jié)論：該方法為黑骨頭的質(zhì)量控制和評價(jià)提供了參考依據(jù)。

【關(guān)鍵詞】黑骨頭;杠柳毒苷;高效液相色譜法;含量測定

【中圖分類號】R29【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A【文章編號】1007-8517（2021）18-0031-04

Study on the Standard Content Determination of Chinese Herbal Medicine Periploca CalophyllaYANG Yongbang1LI Jiantian1BAI Yue2

1.Yuxi Institute for food and drug control，Yuxi 653100，China;2.Puer college，Puer 665000，ChinaAbstract：Objective To establish a systematic and scientific method for the extraction and determination of periplocin in Periploca calophylla，and to provide a reliable method for scientific evaluation and effective control of the quality of Periploca calophylla.Methods HPLC was used. The column was Agilent venusil plot-c18 （4.6mm×150mm，5 μm）; the mobile phase was water acetonitrile; the flow rate was 1.0mL/min; the detection wavelength was 220nm; the column temperature was 25℃.Results the HPLC detection conditions，specificity，linearity，repeatability，precision，stability and recovery rate were good. The method can be used for the content determination of Periplocoside.Conclusion this method provides a reference for the quality control and scientific evaluation of Periploca calophylla.

Keywords：Periploca calophylla; Periplocin; HPLC; Content Determination

民族民間用藥是中華傳統(tǒng)醫(yī)藥的重要組成部分，其歷史悠久并具很強(qiáng)的地域性。黑骨頭為云南省哈尼族、彝族常用藥材[1]，別名有鐵骨頭、牛尾蕨、青蛇膽、黑龍骨、青風(fēng)藤等。主要用于腰痛、風(fēng)濕麻木、跌打損傷及蛇咬傷的治療。黑骨頭最早是《云南省藥品標(biāo)準(zhǔn)》（1974）[2]収載品種，現(xiàn)為《云南省中藥材標(biāo)準(zhǔn)》（2005年版）[3]収載品種;其植物來源為蘿藦科植物黑龍骨Periploca forrestii Schltr.及青蛇藤Periploca calophylla （Wight） Falc.的干燥老莖和根?！对颇鲜≈兴幉臉?biāo)準(zhǔn)》（2005年版）黑骨頭藥材標(biāo)準(zhǔn)項(xiàng)下初步制訂了名稱、來源、性狀、薄層鑒別、檢查（水分、總灰分）、浸出物等項(xiàng)目，但沒有對其指標(biāo)成分進(jìn)行定性和含量測定;難以控制藥材的質(zhì)量，無法保證臨床用藥的安全性和有效性。因此完善和提高黑骨頭藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)顯得非常有必要。

現(xiàn)代對黑骨頭藥材的研究，更多的是對植物黑龍骨的成分研究[4-6];而對植物青蛇藤的研究非常少見，僅見《青蛇藤化學(xué)成分研究》《青蛇藤正丁醇部分苷類成分的分離與鑒定》等文獻(xiàn)。現(xiàn)有的文獻(xiàn)報(bào)道，黑骨頭的研究多集中在化學(xué)成分、總皂苷、總黃酮及槲皮素-3-O-α-L-吡喃阿拉伯糖苷的含量測定和藥理作用等方面，未見關(guān)于黑骨頭和杠柳毒苷定性鑒別及含量測定方法的研究報(bào)道[7] 。對于黑骨頭藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究，特別是采用HPLC方法測定青蛇藤中杠柳毒苷的含量研究，目前尚無相關(guān)研究的文獻(xiàn)報(bào)道。因此，本實(shí)驗(yàn)確定以強(qiáng)心苷類具有促進(jìn)傷口愈合作用的杠柳毒苷作為控制指標(biāo)，對黑骨頭藥材中杠柳毒苷成分的含量進(jìn)行測定，并對其方法進(jìn)行驗(yàn)證，以便能更全面地分析評價(jià)其藥材質(zhì)量和安全性。為民族藥黑骨頭的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)控制提供參考，同時(shí)也為黑骨頭藥材及相關(guān)制劑進(jìn)一步研究和開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

1儀器與材料

1.1儀器ME403E 103型電子天平（梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司）、CPX5800H-C型超聲清洗儀（必能信超聲（上海）有限公司）、BP211D型電子天平（賽多利斯）、DHG-9140A型鼓風(fēng)干燥箱（上海合恒儀器有限公司）、1260 Infinity型高效液相色譜儀（安捷倫科技）、粉碎機(jī)（瑞安市永歷制藥機(jī)械有限公司）、MS204型電子天平（梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司）、Cavy 60 UV-Vis型紫外可見分光光度計(jì)（安捷倫科技）、DESA6A薄層色譜板成像儀。

1.2材料杠柳毒苷對照品（純度：98%，CAS No.13137-64-9，成都普瑞法科技開發(fā)有限公司）純凈水（杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司），三氯甲烷、丙酮、甲醇、無水乙醇、95%乙醇均為四川西隴科學(xué)有限公司，30%乙醇、45%乙醇、70%乙醇（現(xiàn)配現(xiàn)用，均用無水乙醇和純凈水配制），乙腈（色譜純，四川西隴科學(xué)有限公司），所用試劑除乙腈外均為分析純，并且均在有效期內(nèi)。

云南地產(chǎn)藥材黑骨頭，經(jīng)玉溪市食品藥品檢驗(yàn)所副主任中藥師牟娟鑒定為蘿藦科植物青蛇藤Periploca calophylla（Wight） Falc.的干燥莖切片。

2方法與結(jié)果

2.1薄層色譜鑒別

2.1.1溶液的制備供試品制備：將黑骨頭樣品粉碎成粗粉，過2號篩，取藥材粉末約2g，加入甲醇25mL，超聲提取30min，將濾液過濾后放在恒溫水浴鍋上蒸干，殘?jiān)蛹状?mL使溶解，作為供試品溶液。對照品溶液制備：取杠柳毒苷對照品適量，加入甲醇溶解制成1mg/mL溶液，作為對照品試液。

2.1.2薄層色譜鑒別照薄層色譜法（《中國藥典》2015年版四部[8]）試驗(yàn)，分別吸取供試品溶液10μL，杠柳毒苷對照品溶液20μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，將薄層板置于展開缸中預(yù)飽和15min，以三氯甲烷：丙酮：水（10∶3∶1）為展開劑上行展開，展開，取出，揮干溶劑，噴以5%硫酸乙醇溶液并在105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，分別又置于紫外光燈（365 nm）下視檢。供試品色譜中在與對照品色譜相應(yīng)位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)和熒光斑點(diǎn)?？梢猿醪酱_定黑骨頭藥材中含有杠柳毒苷。結(jié)果見圖1、圖2。

2.2.1色譜條件色譜柱：ZORBAX Eclipse Plus C18（4.6mm×250mm，5μm）;流動(dòng)相：以水為流動(dòng)相A，乙腈為流動(dòng)相B，按表1所示流動(dòng)相洗脫程序;柱溫25℃：檢測波長220nm，流速1mL/min。對照品及供試品色譜圖如圖3、圖4所示。

2.2.2對照品溶液的制備取杠柳毒苷對照品適量，精密稱定，加45%乙醇溶液制成每1mL含0.207mg的溶液，即得。

2.2.3供試品溶液的制備精密稱取黑骨頭粉末約2g，置于錐形瓶中，精密量取45%乙醇25mL加入至錐形瓶，稱定重量。置于超聲提取30min，再次稱重，補(bǔ)足減失的重量后過濾，取續(xù)濾液作供試品溶液備用。

2.2.4檢測波長的確定將制備好的對照品溶液取適量置于比色皿中，放入Cavy 60 UV-Vis型紫外可見分光光度計(jì)中進(jìn)行全波長掃描，最終確定杠柳毒苷最大吸收波長為220nm。

2.2.5線性關(guān)系的考察稱取杠柳毒苷對照品10.57mg至50mL容量瓶中，加入45%乙醇溶液至刻度，即得到濃度為0.207mg/mL的對照品儲(chǔ)備溶液。取杠柳毒苷對照品儲(chǔ)備溶液25mL至100mL量瓶加45%乙醇溶液至刻度，得到濃度為0.052mg/mL杠柳毒苷溶液。取1mL濃度為0.052mg/mL杠柳毒苷溶液至10mL量瓶加45%乙醇溶液至刻度，得到0.0052mg/mL杠柳毒苷溶液;取2mL濃度為0.052mg/mL杠柳毒苷溶液至10mL量瓶加45%乙醇溶液至刻度，得到0.0104mg/mL杠柳毒苷溶液;取5mL濃度為0.052mg/mL杠柳毒苷溶液至10mL量瓶45%乙醇溶液至刻度，得到0.026mg/mL杠柳毒苷溶液;取5mL濃度為0.207mg/mL杠柳毒苷溶液至10mL量瓶加45%乙醇溶液至刻度，得到0.104mg/mL杠柳毒苷溶液;再取0.052、0.207mg/mL的對照品溶液，共計(jì)6個(gè)不同濃度的對照品溶液，按色譜條件：ZORBAX Eclipse Plus C18（4.6mm×250mm，5μm）色譜柱;以水為流動(dòng)相A，乙腈為流動(dòng)相B按表1所示流動(dòng)相洗脫程序;柱溫25℃：檢測波長220nm，進(jìn)行高效液相色譜分析，以進(jìn)樣濃度（mg/mL）為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程Y=6225X+0.2665，R2=0.9999，在0.005mg/mL～0.207mg/mL濃度范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好。

2.2.6精密度試驗(yàn)取“2.2.2”項(xiàng)下對照品溶液按“2.2.1”色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積，結(jié)果杠柳毒苷峰面積RSD值為0.4%，表明儀器精密度良好。

2.2.7重復(fù)性試驗(yàn)按供試品溶液制備方法制備6份供試品溶液，分別精密吸取對照品溶液和供試品溶液各10μL，注入液相色譜儀中進(jìn)行測定峰面積，計(jì)算含量得平均含量為0.5717 mg/g，RSD值為1.4%，表明方法重復(fù)性良好。

2.2.8穩(wěn)定性試驗(yàn)取供試品溶液，分別在室溫0h、4h、6h、8h、12h、18h、24h的時(shí)間下按“2.2.1”色譜條件進(jìn)行測定峰面積，RSD值為0.59%。表明供試品在24h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.9加樣回收率試驗(yàn)精密稱定已知含量（0.5717mg/g）的供試品6份至不同的錐形瓶中，精密加入杠柳毒苷對照品溶液（0.207mg/mL）3mL ，照供試品溶液的制備方法制備。取上述6份供試品溶液分別進(jìn)樣10μL，測定其峰面積并計(jì)算含量。根據(jù)（《中國藥典》2015版四部）分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則準(zhǔn)確度計(jì)算方法（用實(shí)測值與供試品中含有量之差，除以加入對照品量），即計(jì)算加樣回收率=（實(shí)測含量-所取樣品含量）/加入對照品量×100%）及RSD值。結(jié)果：平均回收率為99.1%，RSD為0.94%，表明該HPLC檢測條件、方法的可靠性強(qiáng)。如表2所示。

2.2.10樣品測定取3批樣品，分別取2 g，精密稱定，按供試品溶液的制備方法制備供試品溶液，分別精密吸取對照品溶液和供試品溶液各10 μL，進(jìn)樣。按色譜條件進(jìn)行測定峰面積，計(jì)算含量結(jié)果見表3所示。

3結(jié)論與討論

通過按本試驗(yàn)方法條件進(jìn)樣考察，表明線性關(guān)系良好、儀器精密度良好、方法重復(fù)性良好、供試品溶液在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定，本方法所測的黑骨頭藥材樣品中的杠柳毒苷含量為0.5717mg/g（0.057%），根據(jù)（《中國藥典》2015版四部）中對高效液相色譜法回收率的要求，其在85%～90%至108～110%之間均符合標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定。本次加樣回收試驗(yàn)杠柳毒苷的回收率為99.1%，在標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定允許范圍內(nèi)。表明該方法準(zhǔn)確、可靠，對今后黑骨頭藥材的質(zhì)量控制和科學(xué)評價(jià)提供了參考依據(jù)。通過前期的實(shí)驗(yàn)考察，采用不同的柱溫分別觀察色譜柱的分離能力，最終確定柱溫25℃分離度最好。以水為流動(dòng)相A，乙腈為流動(dòng)相B，不同梯度洗脫程序進(jìn)行驗(yàn)證，最終確定洗脫程序。經(jīng)過多次實(shí)驗(yàn)，最終確定使用C18柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）分離效果好、達(dá)到實(shí)驗(yàn)要求。

通過對黑骨頭藥材的初步研究，發(fā)現(xiàn)云南習(xí)用的黑骨頭藥材來源大多是蘿藦科植物青蛇藤的干燥老莖。通過查閱相關(guān)文獻(xiàn)及采用薄層色譜鑒別方法，并與杠柳毒苷對照物質(zhì)的比較，初步確定了藥材青蛇藤中含有杠柳毒苷，為后續(xù)采用高效液相色譜法測定杠柳毒苷含量奠定了物質(zhì)基礎(chǔ)，同時(shí)為完善及提高黑骨頭藥材標(biāo)準(zhǔn)打下堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)

[1]昆明民間常用草藥[M].昆明：昆明市衛(wèi)生局出版，1970：364-365.

[2]云南省藥品標(biāo)準(zhǔn)（1974）[M].昆明：云南省衛(wèi)生局出版，1974：327.

[3]云南省中藥材標(biāo)準(zhǔn)（2005年版）（第七冊）[M].昆明：云南科技出版社，2013.

[4]田俊生，李天祥，劉虹，等.HPLC法測定不同產(chǎn)地香加皮中杠柳毒苷的含量[J].藥物分析雜志，2002，22（6）：432-435.

[5]張宏，袁德彬，趙愛萍.HPCL法測定不同產(chǎn)地黑骨藤中杠柳苷的含量[J].藥物分析雜志，2012，32（2）：241-244.

[6]甘秀海，周欣，趙超，等.不同產(chǎn)地及不同部位黑龍骨中杠柳毒苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化[J].西南大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2017，39（2）：8.

[7]王強(qiáng)，韓隆胤，魏賑權(quán)，等. 《貴州省中藥材、民族藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》中黑骨藤化學(xué)鑒定方法之商榷[J].湖南中醫(yī)雜志，2019，35（11）：112-114.

[8]中華人民共和國藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典（四部） [M].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015：59-61.（收稿日期：2021-05-19編輯：劉斌）

基金項(xiàng)目：全國中藥特色技術(shù)傳承人培訓(xùn)項(xiàng)目（T20194828003）。

作者簡介：楊勇幫（1978-），男，漢族，副主任藥師，研究方向?yàn)槊褡逅庂|(zhì)量控制及天然藥物鑒定分析。E-mail：122199214@qq.com通信作者：