絲狀真菌代謝組學(xué)研究方法進展

閆震 陳萬權(quán) 張昊 劉太國 劉長仲 馮潔

摘要 代謝組學(xué)研究的是生物體系受到內(nèi)在和外在因素刺激產(chǎn)生的內(nèi)源性代謝變化。近年來，隨著代謝組學(xué)在病原真菌致病機理、真菌與植物互作以及新型生物活性物質(zhì)開發(fā)研究領(lǐng)域的應(yīng)用，真菌代謝組學(xué)越來越受到國內(nèi)外的重視，同時也取得了較大的進展。由于絲狀真菌類型和研究目的的差異，其研究方法不盡相同。本文主要綜述近年來國內(nèi)外絲狀真菌代謝組學(xué)分析方法的研究進展，從絲狀真菌樣品制備、代謝物鑒定、數(shù)據(jù)分析、生物標(biāo)志物發(fā)掘、代謝通路方面進行概述，以期為該領(lǐng)域研究者提供參考，進一步推進代謝組學(xué)在真菌研究領(lǐng)域中的應(yīng)用。

關(guān)鍵詞 絲狀真菌; 代謝組學(xué); 樣品處理; 數(shù)據(jù)分析; 代謝通路

中圖分類號： Q 591.1

文獻標(biāo)識碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2020357

Advances in research methods of filamentous fungal metabolomics

YAN Zhen1， 2， 3， CHEN Wanquan1， 2， 4*， ZHANG Hao2， 4*， LIU Taiguo2， 4， 5*， LIU Changzhong1， FENG Jie2

（1. College of Plant Protection， Gansu Agricultural University， Lanzhou 730070， China; 2. State Key Laboratory

for Biology of Plant Diseases and Insect Pests， Institute of Plant Protection， Chinese Academy of Agricultural

Sciences， Beijing 100193， China; 3. Institute of Pomology， Chinese Academy of Agricultural Sciences，

Xingcheng 125100， China; 4. National Agricultural Experimental Station for Plant Protection at Gangu， Ministry

of Agriculture and Rural Affairs， Tianshui 741200 China; 5. Key Laboratory of Biological Hazard Factors （Plant Source）

Control of Agricultural Products Quality and Safety， Ministry of Agriculture and Rural Affairs， Beijing 100193， China）

Abstract

Metabolomics studies the endogenous metabolic changes in biological systems stimulated by internal and external factors. In recent years， with the application of metabolomics in the pathogenesis of pathogenic fungi and interaction with plants，? the development of novel biologically active substances， more and more attentions have been paid to the study of fungal metabolomics， and great progresses have been made in this area. Due to the differences in the types of filamentous fungi and the purposes of the research， the research methods were diverse. This review summarized the research progresses in the metabolomic analysis methods of filamentous fungi in recent years， including filamentous fungal sample preparation， metabolite identification， data analysis， biomarker discovery and metabolic pathways. It is aimed to provide a reference for the researchers in this field and further promote the application of metabolomics to fungal research.

Key words

filamentous fungus; metabolomics; sample preparation; data analysis; metabolic pathways

代謝組學(xué)是對某一生物或細胞在一特定生理時期內(nèi)所有低分子量（小于1 000）代謝產(chǎn)物進行定性和定量分析的一門學(xué)科，主要包括糖類、脂質(zhì)、核苷酸、氨基酸等初級代謝產(chǎn)物以及萜類、聚酮類、非核糖體多肽、生物堿類等次級代謝產(chǎn)物[1-2]。雖然經(jīng)常被視為轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)的補充技術(shù)，但代謝組學(xué)確實具有明顯的優(yōu)勢[3-5]。 首先，作為基因轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)組表達的下游產(chǎn)物，代謝組與生物系統(tǒng)表型直接相關(guān)，可以直接動態(tài)地反映出細胞的生理生化過程，能夠更準(zhǔn)確直接地反映生命體終端和表型信息[6]。其次，相對于轉(zhuǎn)錄組或蛋白質(zhì)組，代謝組的變化被放大，通過結(jié)果直接突出代謝途徑和不同調(diào)控過程。代謝組學(xué)是功能基因組學(xué)所采用的組學(xué)技術(shù)中最新的一種[7]，已經(jīng)成為生物學(xué)的一個新領(lǐng)域，有望加快對功能未知基因的功能分析。

目前，代謝組學(xué)已擴展到各個領(lǐng)域，例如臨床、制藥、環(huán)境、動物、植物和微生物等[8]。相比于動、植物代謝組學(xué)，真菌代謝組學(xué)起步較晚，在過去的十年中，由于植物病原真菌在微生物系統(tǒng)中的重要性，代謝組學(xué)技術(shù)已被廣泛用于植物病原真菌的研究中[9]，主要側(cè)重于真菌分類[10-12]、致病機理[3，13]以及與植物互作過程中代謝物功能和代謝途徑[14-16]。國內(nèi)外真菌代謝研究相關(guān)領(lǐng)域文獻發(fā)表數(shù)量見圖1，主要側(cè)重于代謝產(chǎn)物、生物活性、抑菌活性、結(jié)構(gòu)鑒定和發(fā)酵等方面的研究。代謝組學(xué)可用于檢測正常的遺傳發(fā)育以及寄主刺激引起的代謝組特征變化，從全局角度反映出真菌的表型變化[17]，也可用于獲得植物在感染病原真菌后產(chǎn)生的小分子代謝物[18-19]。為了研究植物的免疫力，還使用源自植物病原真菌的激發(fā)子來誘導(dǎo)寄主植物的免疫反應(yīng)，進行代謝研究。許多植物病原真菌，例如鐮刀菌Fusarium和曲霉Aspergillus都可以在寄主細胞中產(chǎn)生毒素[20]。因此，代謝組學(xué)還可以很好地檢測毒素誘導(dǎo)的植物代謝途徑的變化。

真菌代謝組分為胞內(nèi)代謝物和胞外代謝物，通常將對胞內(nèi)代謝物的定量定性分析稱為代謝指紋分析（metabolic fingerprinting analysis），將胞外代謝物的定量定性分析稱為代謝足跡分析（metabolic footprinting analysis）[21]。代謝指紋分析相比于代謝足跡分析，樣品取樣和準(zhǔn)備過程較為復(fù)雜，但代謝指紋分析所涵蓋的代謝物種類顯著多于代謝足跡分析，所含信息更加豐富，所以當(dāng)前以微生物為研究對象的代謝組學(xué)研究中，多數(shù)集中于代謝指紋分析。然而，由于真菌培養(yǎng)的樣品中生物質(zhì)濃度較低，限制了對細胞內(nèi)數(shù)量少的代謝物的檢測。以曲霉和青霉Penicillium為例，真菌細胞的次級代謝產(chǎn)物據(jù)估計達到10 000多種，但目前已知的代謝產(chǎn)物不足10%[22];另外，將細胞外和細胞內(nèi)代謝物的分離與細胞內(nèi)代謝的淬滅結(jié)合起來非常困難， 致使真菌代謝組學(xué)的研究面臨很多挑戰(zhàn)[23]。真菌代謝組學(xué)研究方法主要包括樣品制備、代謝物鑒定、數(shù)據(jù)解析、生物標(biāo)志物發(fā)掘、生物學(xué)解釋等一系列關(guān)鍵步驟（圖2），本文主要圍繞這幾方面展開討論闡述。

1 樣品制備

樣品制備是代謝組學(xué)分析的關(guān)鍵步驟，對隨后的數(shù)據(jù)采集和生物學(xué)解釋具有重要的意義[24]。因此，應(yīng)根據(jù)研究目的針對性地選擇樣品處理方法，真實客觀地反映樣品中代謝物的存在信息。理想的樣品制備方法應(yīng)簡單易于重復(fù)、步驟少可變性最低、成本低適用于大樣本量，且能夠保持樣品的完整性[25]。由于細胞對外界環(huán)境變化極其敏感，故代謝產(chǎn)物的含量及水平會隨環(huán)境改變迅速發(fā)生變化[26]。因此，應(yīng)盡快完成采樣并終止細胞代謝（淬滅），以確保分析時樣品的代謝組成分與取樣時一致。真菌樣品制備主要包括菌株培養(yǎng)、快速取樣、代謝淬滅和代謝萃取[27]。通常取樣和淬滅步驟結(jié)合在一起以縮短處理時間。

1.1 菌株培養(yǎng)

菌株需要在一定的可控生物反應(yīng)器中培養(yǎng)。生物反應(yīng)器中的培養(yǎng)基組分、溫度、pH、光照以及溶解于其中的O2、CO2 等必須是確定和易于控制與檢測的，這樣才能獲得標(biāo)準(zhǔn)和重現(xiàn)的培養(yǎng)條件。真菌多采用分批培養(yǎng)和連續(xù)培養(yǎng)方式。Chen等[28]和Palyzov等[29]使用PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)真菌，從中提取代謝產(chǎn)物，但由于PDA培養(yǎng)基中含有具有生物活性的馬鈴薯，其不同批次之間營養(yǎng)成分難以達到統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，僅適用于少量樣品統(tǒng)一處理，對于大量樣本檢測的重復(fù)性操作不可控制，因此，培養(yǎng)基成分適合選擇化學(xué)合成的物質(zhì)，便于控制培養(yǎng)條件的一致性[30-31]。

1.2 快速取樣

快速取樣不僅能夠防止底物濃度發(fā)生巨大變化，而且有助于維持代謝物的穩(wěn)定性。對于真菌最關(guān)鍵的問題是菌絲與生長培養(yǎng)基的有效分離，目前主要分離方式是冷離心或快速過濾[32]。細胞外代謝產(chǎn)物的取樣和樣品制備相對簡單，一般離心或過濾后，取上清液或濾液直接淬滅或冷凍儲存[24]。然而對于胞內(nèi)代謝物， Francisca等[33]研究黑曲霉Aspergillus niger時發(fā)現(xiàn)，通過離心分離菌絲體是不切實際的，因為沒有形成合適的菌絲團沉淀，盡管Seifar等[34]曾嘗試離心后清洗菌絲沉淀，但試管中仍會存在大量的培養(yǎng)基或清洗液，導(dǎo)致細胞外代謝產(chǎn)物殘留。與離心相比，過濾可以更有效地去除菌絲體中的細胞外代謝物[31，33]。Juliana等[35]研究尖孢鐮刀菌F.oxysporum聚酮類代謝物時，采用先離心后真空過濾的方法，但暴露時間過長。Choi等[36]分析釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae胞內(nèi)代謝物時，比較了淬滅后離心和快速過濾對代謝物泄漏的影響，同樣表明快速過濾能夠很大程度上減少代謝物的損失。盡管過濾過程中可能會導(dǎo)致具有快速周轉(zhuǎn)率代謝物（例如，磷酸化的中間體）的數(shù)量在重復(fù)樣品中會有所不同[37]，但可以考慮通過中心代謝產(chǎn)物的變化補償不一致性[26]。比如，磷酸烯醇丙酮酸、NAD+/NADP+和谷氨酸等。所以迄今為止，快速過濾仍然是絲狀真菌的最佳取樣方法[30]。

1.3 代謝淬滅

理想的淬滅技術(shù)應(yīng)實現(xiàn)瞬間淬滅，快速淬滅酶活力并且保持細胞或生物的完整性，避免造成胞內(nèi)代謝物外流[27]。由于真菌細胞壁的結(jié)構(gòu)不同，對滲透壓的耐受程度以及膜通透性也存在差異，通常很難通過單一的提取方法提取全部胞內(nèi)代謝物[38]。針對不同樣品發(fā)展了各類淬滅試劑，液氮、高氯酸、冷甲醇（-40℃）、熱乙醇、冷緩沖鹽（PBS、Tricine、HEPES或碳酸銨）等[39]。也有報道用等滲鹽水（09%m/V NaCl，0.5℃）淬滅能有效防止細胞膜損傷，從而避免不必要的代謝物損失。盡管也有研究者提出采用快速熱休克來使新陳代謝失活，但這可能導(dǎo)致熱不穩(wěn)定代謝產(chǎn)物降解并增加細胞通透性[23，40]。使用60%甲醇（-40℃）的淬滅方法在各種真菌中應(yīng)用最廣泛[7，22，31]。但許多研究證明冷甲醇淬滅會破壞細胞完整性，影響細胞內(nèi)代謝物的回收，從而導(dǎo)致代謝物水平的低估[41-43]。Zheng等[44]研究黑曲霉代謝物時，從綜合淬滅效率、細胞損傷和代謝產(chǎn)物泄漏3個方面評估了3種冷甲醇淬滅方法（-20℃ 40%甲醇，-40℃ 60%甲醇和-40℃純甲醇）與液氮的差異，發(fā)現(xiàn)與冷甲醇淬滅方法相比，液氮對細胞完整性破壞最小，產(chǎn)生的代謝物更穩(wěn)定。當(dāng)測定胞內(nèi)代謝物時，為避免受到胞外代謝物的干擾，有時需要洗滌菌絲以去除細胞外基質(zhì)。洗滌緩沖液應(yīng)符合生理水平，采用比較溫和的溶液，最大程度減少代謝物泄漏，一般是預(yù)冷的PBS、生理鹽水或蒸餾水[30，45-46]。包括洗滌在內(nèi)的整個過濾過程要求在30 s或45 s內(nèi)完成[30，47]。

1.4 代謝萃取

代謝物的提取是樣品前處理過程中又一重要步驟，對于非靶標(biāo)代謝組學(xué)分析，其無偏向性和全覆蓋率的內(nèi)在要求，對代謝物的提取提出了較高的外在要求。理想的方法應(yīng)盡可能提高代謝物的覆蓋率和回收率，保持代謝物的物理化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，減少代謝物損失[48-49]。首要步驟是細胞破碎，使細胞膜可滲透提取劑（例如有機溶劑），從而釋放細胞內(nèi)代謝產(chǎn)物[18]。隨后進行代謝物的提取和樣品濃縮。細胞破碎方法分機械破碎和非機械破碎。機械破碎方法主要有超聲破碎細胞，微波輔助萃取，加壓液體萃取，超臨界流體萃取、手動研磨，球磨機等。非機械破碎包括酶促裂解、物理溶解和化學(xué)溶解。物理溶解常用的是凍融和加熱法，由于樣品中存在熱不穩(wěn)定化合物，加熱法不太適用于全組分?；瘜W(xué)溶解法主要是各類有機溶劑對細胞膜的破壞而使細胞內(nèi)代謝物釋放[39]。

目前，常用的提取劑有冷甲醇、熱乙醇、乙腈、乙酸乙酯、二氯甲烷、高氯酸或堿以及氯仿-甲醇混合液等[27，33，50-51]。Karpe等[52]提取尖孢鐮刀菌胞內(nèi)代謝物時采用乙腈/水/乙酸混合液，雖然乙腈除蛋白的效果比甲醇和乙醇好，但乙腈對代謝物的提取效率最低，可重復(fù)的代謝特征較少[21]。美國Scripps研究所通過聚類分析發(fā)現(xiàn)，100%的甲醇或包含甲醇的混合提取溶劑可以實現(xiàn)高重復(fù)性檢出代謝物。Smart等[26]使用冷甲醇水溶液提取與凍融循環(huán)結(jié)合，提高了細胞的滲透性，增強了代謝產(chǎn)物的化學(xué)提取。Tomas等[48]的研究表明使用甲醇和水混合液對鐮刀菌代謝產(chǎn)物進行提取，能夠兼顧高極性和低極性的化合物。由于真菌微生物樣品內(nèi)代謝物種類多，物理化學(xué)性質(zhì)多元（極性和溶解性等），到目前為止，還未有一種提取體系可實現(xiàn)全覆蓋提取代謝物，因此根據(jù)研究目的有針對性地選取提取劑至關(guān)重要[9]。

2 代謝物鑒定

由于特定的代謝物在每一個含有它的有機體中都是相同的，所以代謝物鑒定技術(shù)是通用的。根據(jù)研究目的和研究技術(shù)不同，代謝組學(xué)主要分為非靶向代謝組學(xué)和靶向代謝組學(xué)兩種典型的方法，前者可利用高分辨率質(zhì)譜（high resolution mass spectrometry，HRMS）獲得樣品中盡可能多的代謝物信息，具有無偏性，但只能相對定量，通常主要用于區(qū)分代謝表型或發(fā)現(xiàn)差異代謝物的研究[21，53];后者則主要通過使用色譜（LC/GC）或串聯(lián)低分辨率質(zhì)譜（MS），針對特定代謝物進行分析，能夠絕對定量，但覆蓋率低。Chen等[54]基于Q-Trap質(zhì)譜儀發(fā)展了“廣泛靶向”代謝組學(xué)技術(shù)，將非靶向代謝組學(xué)高通量的優(yōu)點與靶向代謝組學(xué)高準(zhǔn)確度、高靈敏度的優(yōu)點相結(jié)合，對關(guān)注的某類特定物質(zhì)進行檢測，生物標(biāo)志物篩選更加準(zhǔn)確，顯著提高了信息覆蓋率和定量準(zhǔn)確性。三者的優(yōu)缺點見表1。

代謝物分析鑒定的兩大難點是生物體內(nèi)小分子種類繁多、濃度相差懸殊，從真菌中獲得代謝物化學(xué)成分的精確信息是一項具有挑戰(zhàn)性的任務(wù)[55]。目前還沒有一種代謝組學(xué)分析平臺可以無偏向性地涵蓋所有代謝物。色譜、質(zhì)譜、核磁共振、紅外光譜、紫外吸收、熒光散射、光散射等分離分析手段及其組合都出現(xiàn)在代謝組學(xué)的研究中[23]，當(dāng)前核磁共振（NMR）和質(zhì)譜（MS）是代謝組學(xué)研究領(lǐng)域的主流分析平臺，在代謝組學(xué)中發(fā)揮重要作用[56]。

2.1 核磁共振分析技術(shù)

NMR是一種無損、高通量的檢測技術(shù)，利用生物流體的NMR光譜提供生物中所有小分子代謝物的豐富信息，并通過多變量統(tǒng)計分析和模式識別處理來確定相關(guān)生物的完整代謝圖[9]。當(dāng)前使用的NMR技術(shù)包括氫譜（1H-NMR），碳譜（13C-NMR）和磷譜（31P-NMR），其中最廣泛使用的是1H-NMR[57]。NMR相對于MS的優(yōu)勢在于制備簡單，物質(zhì)的結(jié)構(gòu)易于識別。此外，頻譜上的信號強度與代謝物的濃度直接相關(guān)，可以準(zhǔn)確定量代謝產(chǎn)物[58]。但是，NMR的靈敏度很低，很難同時檢測生物體內(nèi)濃度差異高的代謝物系統(tǒng)，并且無法區(qū)分具有非常相似結(jié)構(gòu)和化學(xué)位移的代謝物，例如肌酸與磷酸肌酸，或尿苷二磷酸鹽與尿苷三磷酸[3，17]，限制了其在真菌代謝組學(xué)中的發(fā)展。

2.2 質(zhì)譜分析技術(shù)

由于靈敏度高，質(zhì)量準(zhǔn)確度高和動態(tài)范圍廣，MS在代謝組學(xué)研究中起著越來越多的作用[59-61]，因為它可以連接不同的色譜分離模式[62-64]，例如氣相色譜-質(zhì)譜（GC-MS）、氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（GC-MS/MS）、液相色譜-質(zhì)譜（LC-MS）、液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）。氣質(zhì)聯(lián)用主要針對具有揮發(fā)性且在高溫下必須穩(wěn)定的化合物。一些非揮發(fā)性代謝物（例如糖，氨基酸）可以通過衍生作用轉(zhuǎn)化成揮發(fā)性化合物。盡管化學(xué)衍生化改善了代謝物的覆蓋范圍，但這可能為代謝組學(xué)研究引入了另一種變異性來源。該方法的最大優(yōu)點是可以使用標(biāo)準(zhǔn)庫進行結(jié)構(gòu)鑒定，并且可以在大量數(shù)據(jù)庫中檢索[65]。與氣質(zhì)聯(lián)用不同，液質(zhì)聯(lián)用主要利用“軟電離”技術(shù)將分析物電離，通過選擇離子監(jiān)測模式（SIM）或多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）模式進行，保留了完整的分子信息，這對于識別至關(guān)重要。由于它有更寬的線性范圍，更好的可重復(fù)性和更高的靈敏度，被更加廣泛地應(yīng)用到靶向代謝組學(xué)研究中。

高分辨質(zhì)譜（HRMS）憑借其普適性、高靈敏度和特異性的特點，逐漸成為非靶向和廣靶代謝組學(xué)研究的主流技術(shù)[66]。目前主流的HRMS有飛行時間質(zhì)譜（TOF-MS）、靜電場軌道阱質(zhì)譜（Orbitrap-MS）、傅立葉變換離子回旋共振質(zhì)譜（FTICR-MS）[67]。相比TOF-MS，Orbitrap-MS具有更低的測量質(zhì)量誤差， 同時在儀器穩(wěn)定性和重現(xiàn)性上顯著優(yōu)于TOF-MS， FTICR-MS結(jié)合了超高的質(zhì)量分辨率和卓越的質(zhì)量精度，是目前測量精度最高的質(zhì)譜，但其掃描速度較前兩者更慢， 在代謝組學(xué)研究中應(yīng)用較少[21]。平行反應(yīng)監(jiān)測（PRM）是在HRMS平臺上開發(fā)的新方法，對準(zhǔn)確量化目標(biāo)代謝物的貢獻越來越大[61]。Zhou等[68]在Q-Exactive LC-MS系統(tǒng)上開發(fā)了基于PRM的目標(biāo)代謝物檢測策略，并進行了PRM和MRM測量的比較，結(jié)果表明，與QTRAP 6500上的MRM測量相比，PRM具有更高的質(zhì)量精度和更全面的二級質(zhì)譜信息。

不同分析工具各具優(yōu)缺點，沒有適合的單一的分析工具可以精確地鑒定和定量數(shù)千個感興趣的小分子，需要組合使用不同的分析技術(shù)才能更好地覆蓋具有廣泛極性和分子量范圍的代謝物[69]。

3 數(shù)據(jù)分析

色譜分離代謝物后，會生成大量光譜數(shù)據(jù)和多變量數(shù)據(jù)，頻譜的每個信號峰都包含有關(guān)代謝物中各種物質(zhì)的定性和定量信息[70]。因此，有必要使用統(tǒng)計學(xué)和化學(xué)計量學(xué)進行分析，具體分析流程見圖3。首先需要對原始數(shù)據(jù)進行預(yù)處理，包括基線校正，特征檢測，噪聲過濾，峰提取，峰對齊，解卷積和歸一化以消除干擾因素?？梢允褂密浖韺崿F(xiàn)這些過程。例如MetAlign，MZmine，XCMS，METIDEA，AMDIS和MSFACTS等。許多儀器制造商還開發(fā)了自己的專有軟件，例如MarkerLynx 和QI（美國Waters公司），AnalyzerPro（英國SpectralWorks公司），Mass Profiler（美國安捷倫公司），ChromsTof（美國Leco公司），MarkerView和SIEVE（美國Thermo公司）等[71]。

預(yù)處理后的數(shù)據(jù)需要進行多元統(tǒng)計分析和生物信息學(xué)分析，包括無監(jiān)督分析和有監(jiān)督分析兩種[3]。無監(jiān)督分析能夠在未知樣品信息的情況下將樣品進行聚類分組，包括多變量數(shù)據(jù)分析（MADA）、主成分分析（PCA）、層次聚類分析（HCA）和自組織映射（SOA）[9，72]等。無監(jiān)督分析方法不能忽略組內(nèi)誤差，如果樣本組之間的差異太小或組內(nèi)差異太大，則很難確定組之間的差異[73-74]。有監(jiān)督分析包括偏最小二乘判別分析（PLS-DA）、正交偏最小二乘判別分析（OPLS-DA）、多元單變量數(shù)據(jù)分析（MUDA），線性判別分析（LDA）、神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)（NN）和支持向量機分析（SVM）等[75]。有監(jiān)督分析方法能夠減少組內(nèi)隨機誤差，突出組間系統(tǒng)誤差[76]。通過這些多元變量統(tǒng)計分析，可以獲得潛在的有效信息，并通過生物標(biāo)志物和代謝途徑找到差異代謝物[77]，其中PLS-DA是使用最多的有監(jiān)督分析方法，用于篩選有標(biāo)記的代謝物[78]。

4 代謝通路分析

生物標(biāo)志物確定以后，需結(jié)合所研究的問題考察其生物學(xué)功能。數(shù)據(jù)的可視化可以展示數(shù)據(jù)集的特性，通常繪制代謝網(wǎng)絡(luò)的某一部分代謝途徑圖使數(shù)據(jù)可視化， 有助于理解代謝物之間的相互關(guān)系， 也能夠與基因表達數(shù)據(jù)相聯(lián)系進行功能基因組學(xué)研究，闡述病理生理作用相關(guān)的作用機制[79]。關(guān)于絲狀真菌代謝通路研究相對較少，目前主要關(guān)注在中心碳代謝和能量轉(zhuǎn)換方面。Liu等[51]探究了海藻糖生物合成基因TPS敲除導(dǎo)致禾谷鐮刀菌F.graminearum基礎(chǔ)代謝的變化，繪制了代謝途徑圖（圖4），證明了TPS基因在糖酵解、TCA循環(huán)、磷酸戊糖途徑中均具有調(diào)節(jié)作用。Vessela等[6]詳細闡述了禾谷鐮刀菌單端孢霉烯毒素的產(chǎn)生與其他中心碳代謝和次級代謝過程的關(guān)系，將收集的代謝物整合到代謝框架圖中（圖5），能夠?qū)⒖赡馨l(fā)生在代謝途徑之間的聯(lián)系可視化，并可以指導(dǎo)與代謝輪廓修飾相關(guān)的生物學(xué)解釋。Gu等[80]剖析了乙酰輔酶A合酶基因在炭疽病菌Colletotrichum higginsianum脂質(zhì)代謝和毒力方面的作用，首次提出了參與病原體毒力的假設(shè)機制和模型（圖6），揭示了脂肪酸β-氧化、肉堿穿梭、乙醛酸的生化途徑，TCA循環(huán)、糖酵解、糖異生和脂肪酸生物合成之間的關(guān)聯(lián)。Cao等[81]證明了轉(zhuǎn)錄因子CRF1在稻瘟病菌Pyricularia oryzae發(fā)育和致病性中的生物學(xué)功能，該因子參與脂肪分解，過氧化物酶體β-氧化、乙醛酸循環(huán)、糖異生和甘油代謝，影響附著胞的滲透性和毒力。Brisson等[82]研究了擬青霉Paecilomyces真菌檸檬酸與中心碳代謝之間的關(guān)系。Aguilar-Pontes等[83]描述了黑曲霉初級碳代謝網(wǎng)絡(luò)途徑，通過對高質(zhì)量黑曲霉基因組的功能預(yù)測，深入挖掘了該途徑中相關(guān)酶基因、反應(yīng)及通路。然而，由于每種代謝物都可以參與多種生物合成途徑[75]，要正確解釋代謝組學(xué)數(shù)據(jù)，繪制的代謝途徑應(yīng)該完整，即包含代謝物相關(guān)的所有反應(yīng)。傳統(tǒng)的代謝途徑圖，如常用的數(shù)據(jù)庫KEGG，可能不包括所有的平行反應(yīng)， 這也增加了代謝組學(xué)數(shù)據(jù)解釋的難度。

Fig.6 Hypothetical model of the function of acetyl-CoA synthase in Colletotrichum higginsianum

5 展望

代謝組學(xué)是進行生物表型研究的主要手段之一，是系統(tǒng)生物學(xué)研究不可或缺的部分。真菌代謝組學(xué)是生物科學(xué)發(fā)展迅速的領(lǐng)域，隨著樣品制備方法的不斷完善以及分析技術(shù)的快速發(fā)展，在真菌領(lǐng)域中將會發(fā)揮更大的作用。然而，與環(huán)境和人類代謝組學(xué)相反，其潛力尚未得到充分利用，從總體來看，它仍然處于發(fā)展階段，目前代謝組學(xué)的最大挑戰(zhàn)是如何克服從大量的代謝產(chǎn)物中找出特異性的生物標(biāo)志物，獲得最佳的生物學(xué)解釋。另一個主要挑戰(zhàn)是亞細胞區(qū)室化，因為代謝組學(xué)數(shù)據(jù)反映了各種細胞器中代謝物的總和。盡管從特定細胞器中分析代謝物是更可取的，但目前在保持這些結(jié)構(gòu)代謝狀態(tài)的同時分離細胞器是非常困難的。由于生物系統(tǒng)的復(fù)雜性，其他組學(xué)的配合和交叉至關(guān)重要。通過組合來自全基因組測序，基因表達譜，蛋白質(zhì)組學(xué)和保守的生化途徑信息，整合高通量、高分辨率的分析技術(shù)與生物信息學(xué)，實現(xiàn)自動分析和可視化，生成標(biāo)準(zhǔn)化代謝組學(xué)數(shù)據(jù)，進而構(gòu)建細胞代謝模型。理想的模型可以預(yù)測生物體中存在的未知代謝途徑，進而推進該領(lǐng)域的快速發(fā)展。

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（責(zé)任編輯：楊明麗）