杜仲補天素丸的HPLC指紋圖譜建立、化學模式識別分析及含量測定

劉敏 曹國瓊 張仕林 葛秋平 劉婭 張永萍

中圖分類號 R284.1 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2021）08-0961-06

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2021.08.11

摘 要 目的：建立杜仲補天素丸的指紋圖譜并進行化學模式識別分析，測定杜仲補天素丸中7個成分的含量，為該制劑的質量控制提供參考。方法：采用高效液相色譜法（HPLC），以Pntulips BP-C18 Plus為色譜柱，以0.2%磷酸水溶液-乙腈為流動相進行梯度洗脫，流速為1.0 mL/min，檢測波長為330 nm，柱溫為35 ℃，進樣量為20 μL。以丹皮酚為參照，使用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)軟件（2012版）》建立12批杜仲補天素丸（S1～S12）的指紋圖譜，確定共有峰并進行相似度評價，通過與對照品比對進行色譜峰指認。采用SPSS 21.0軟件和SIMCA 13.0軟件進行聚類分析和主成分分析，對22個共有峰進行評價。采用上述HPLC法測定12批樣品中指認成分的含量。結果：從12批杜仲補天素丸的HPLC指紋圖譜中標定共有峰22個，相似度均不低于0.960;共指認化學成分7個，分別為沒食子酸（峰1）、綠原酸（峰3）、甘草苷（峰6）、金絲桃苷（峰7）、毛蕊花糖苷（峰8）、淫羊藿苷（峰14）和丹皮酚（峰15）。12批樣品中，S1、S3～S5、S7、S9、S11聚為一類，S2、S10、S12聚為一類，S6聚為一類，S8聚為一類;22個共有峰被分為3個主成分，主成分1的特征值（15.130）和方差貢獻率（68.775%）最大，其中峰3（0.305）和峰4（0.298）對應成分的得分系數(shù)最高。12批樣品中，上述7個成分的含量分別為18.196 2～31.951 3、0.000 6～0.049 4、0.234 8～0.415 9、0.039 5～0.079 1、0.053 5～0.249 3、0.000 5～0.000 8、0.646 4～1.146 9 mg/g。結論：成功建立了杜仲補天素丸的HPLC指紋圖譜。12批樣品被聚類分成4類，峰3（綠原酸）和峰4（未知）可能是造成樣品差異的重要因素。7個成分中沒食子酸的含量最高。

關鍵詞 杜仲補天素丸;高效液相色譜法;指紋圖譜;化學模式識別;含量測定

Establishment of HPLC Fingerprint， Chemical Pattern Recognition Analysis and Content Determination of Duzhong Butiansu Pill

LIU Min1，CAO Guoqiong1，ZHANG Shilin2，GE Qiuping2，LIU Ya2，ZHANG Yongping1（1. School of Pharmacy， Guizhou University of TCM， Guiyang 550025， China; 2. Guiyang Dechangxiang Pharmaceutical Co.， Ltd.， Guiyang 550002， China）

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To establish fingerprint of Duzhong butiansu pills， analyze its chemical pattern recognition， and determine the contents of 7 components in Duzhong butiansu pills， so as to provide reference for the quality control of the preparation. METHODS： HPLC method was adopted. The determination was performed on Pntulips BP-C18 Plus column with 0.2% phosphoric acid water-acetonitrile as mobile phase （gradient elution） at the flow rate of 1.0 mL/min. The detection wavelength was set at 330 nm， and column temperature was 35 ℃. The sample size was 20 μL. With paeonol as the reference， the HPLC fingerprints of 12 batches of Duzhong butiansu pills （S1-S12） were established with Similarity Evaluation System for TCM Chromatographic Fingerprint （2012 edition）; common peaks were determined and the similarity was evaluated. The chromatographic peaks were identified by comparing with the reference substance. SPSS 21.0 and SIMCA 13.0 software were used for cluster analysis and principal component analysis， and 22 common peaks were evaluated. The contents of the identified components in 12 batches of samples was determined by the above HPLC method. RESULTS： A total of 22 common peaks were identified in the HPLC fingerprint of 12 batches of Duzhong butiansu pills， and the similarity was no loss than 0.960. There were 7 chemical components identified， which were gallic acid （peak 1）， chlorogenic acid （peak 3）， liquiritoside （peak 6）， hyperoside（peak 7）， verbascoside （peak 8）， icariin （peak 14） and paeonol （peak 15）. Among the 12 batches of samples， S1， S3-S5， S7， S9 and S11 were classified as one category， S2， S10 and S12 were clustered into one category， S6 was one category and S8 was one category. The 22 common peaks were divided into three principal components. The characteristic value （15.130） and contribution rate （68.775%） of principal component 1 were the largest， and the score coefficients of peak 3 （0.305） and peak 4 （0.298） were the highest. Among 12 batches of samples， the contents of above 7 components were 18.196 2- 31.951 3，0.000 6-0.049 4，0.234 8-0.415 9，0.039 5-0.079 1，0.053 5-0.249 3，0.000 5-0.000 8，0.646 4-1.146 9 mg/g， respectively. CONCLUSIONS： HPLC fingerprint of Duzhong butiansu pills is established successfully. Twelve batches of samples are clustered into 4 category. Peak 3 （chlorogenic acid） and peak 4 （unknown） may be the important factors causing the difference of samples. The content of gallic acid is the highest among the 7 components.

KEYWORDS? ?Duzhong butiansu pills; HPLC; Fingerprint; Chemical pattern recognition; Content determination

杜仲補天素系列制劑是由鹽杜仲、制菟絲子、肉蓯蓉、淫羊藿、牡丹皮等25味中藥組成，具有溫腎養(yǎng)心、壯腰安神的功效，臨床主要用于治療腰脊酸軟、夜多小便、神經(jīng)衰弱等癥[1]。杜仲補天素系列制劑是中藥復方制劑，含多味中藥且化學成分復雜，對其進行有效的質量控制是保證其臨床療效的重要基礎。目前，關于杜仲補天素丸的質量控制報道主要是對芍藥苷的定量分析和對部分組方藥材的定性鑒別[2-3]，其藥效成分尚不明確，同時缺乏有關杜仲補天素丸更為綜合、全面的質量控制研究。

隨著中藥指紋圖譜技術的發(fā)展和廣泛應用，指紋圖譜及多成分檢測能提供豐富的指標成分或藥效成分信息，可較全面地反映藥材和制劑的質量，近年來已被廣泛用于中藥材和中成藥的質量控制[4-5]。杜仲補天素丸含25味中藥，山茱萸中沒食子酸具有抗氧化、抗炎以及保護心腦血管的藥理作用，其同時也是地榆、拳參等中藥的主要有效成分;菟絲子所含金絲桃苷能增強機體免疫功能，改善神經(jīng)衰弱;肉蓯蓉中主要有效成分毛蕊花糖苷具有增強免疫調節(jié)功能、保護神經(jīng)系統(tǒng)以及補腎壯陽的作用;淫羊藿苷是淫羊藿中的黃酮類成分，也是抗骨質疏松的重要藥效物質;牡丹皮的代表性成分丹皮酚具有鎮(zhèn)靜催眠、保護神經(jīng)及抗炎鎮(zhèn)痛的作用;綠原酸廣泛存在于多種中藥（杜仲、金銀花等）中，具有抗菌、抗病毒、保肝利膽、抗腫瘤、降血壓、降血脂和興奮中樞神經(jīng)系統(tǒng)等作用;甘草中甘草苷能有效抑制酪氨酸酶的活性，同時具有抗氧化能力和亞硝酸鹽清除能力，具有保護神經(jīng)和心臟的作用[6-16]。結合杜仲補天素丸的主治病癥，本研究以上述7個成分作為該制劑的有效成分，采用高效液相色譜法（HPLC）建立12批杜仲補天素丸的指紋圖譜，通過與對照品對比指認這7個主要成分，采用聚類分析和主成分分析法對12批樣品進行化學模式識別，并測定上述7個成分的含量，以期為該復方制劑的質量控制提供參考。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器包括e2695-2998型HPLC儀（配備Alliance 2695型自動進樣器、2998型二極管陣列檢測器、Alliance 2695型四元低壓混合泵，美國Waters公司）、FA1004型電子天平（上海舜宇恒平科學儀器有限公司）、AUW120D型電子天平（日本Shimadzu公司）、SK8210LHC型超聲波清洗器（上?？茖С晝x器有限公司）、H2050R型臺式高速大容量冷凍離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司）等。

1.2 主要藥品與試劑

12批杜仲補天素丸（批號11019001、11019002、11019003、11019004、11019005、11019006、11019007、11019008、11019009、11019010、11019011、11019012，編號S1～S12，規(guī)格每瓶100粒、凈質量22 g）均由貴陽德昌祥藥業(yè)有限公司提供;沒食子酸（批號6TGX-H4L9，純度89.9%）、綠原酸（批號99U4-EAPK，純度96.8%）、甘草苷（批號V2F6-HP3F，純度93.7%）、金絲桃苷（批號VKT6-RALP，純度93.3%）、毛蕊花糖苷（批號TTJY- MHVL，純度95.2%）、淫羊藿苷（批號XYGW-CSC4，純度94.2%）、丹皮酚（批號M7FR-KD3F，純度99.8%）對照品均購自中國食品藥品檢定研究院;乙腈（色譜純）購自國藥集團化學試劑有限公司;甲醇（色譜純）和磷酸（優(yōu)級純）均購自天津市科密歐化學試劑有限公司;其余試劑均為分析純，水為超純水。

2 方法與結果

2.1 混合對照品溶液的制備

精密稱取沒食子酸、綠原酸、甘草苷、金絲桃苷、毛蕊花糖苷、淫羊藿苷、丹皮酚對照品各適量，用甲醇溶解、稀釋，制得質量濃度分別為1.856、0.271、0.515、0.456、0.448、0.002、1.390 mg/mL的單一對照品溶液。精密吸取上述單一對照品溶液各適量，加甲醇定容于同一10 mL量瓶中，制得上述7個成分質量濃度分別為0.95、0.01、0.07、0.02、0.04、0.17×10-3、0.10 mg/mL的混合對照品溶液。

2.2 供試品溶液的制備

取杜仲補天素丸適量，粉碎，精密稱定4 g，加入甲醇25 mL溶解，稱定質量，超聲（功率500 W，頻率53 kHz）提取60 min，冷卻后再次稱定質量，用甲醇補足減失的質量，以12 000 r/min離心15 min，取上清液，用0.22 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.3 色譜條件

以Pntulips BP-C18 Plus（250 mm×4.6 mm，5 μm）為色譜柱，以0.2%磷酸水溶液（A）-乙腈（B）為流動相進行洗脫梯度（0～30 min，5%B→17%B;30～33 min，17%B;33～43 min，17%B→21%B;43～53 min，21%B;53～65 min，21%B→28%B;65～75 min，28%B;75～77 min，28%B→31%B;77～98 min，31%B→42%B;98～138 min，42%B→79%B），平衡時間為12 min，流速為1.0 mL/min，檢測波長為330 nm，柱溫為35 ℃，進樣量為20 μL。

2.4 指紋圖譜方法學考察

2.4.1 精密度試驗 精密稱取杜仲補天素丸（編號S6）4 g，按“2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.3”項下色譜條件連續(xù)進樣測定6次。以15號峰丹皮酚為參照，計算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結果，22個共有峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD分別為0.03%～1.77%（n=6）和0.16%～2.93%（n=6）。

2.4.2 重復性試驗 精密稱取杜仲補天素丸（編號S6）6份，每份4 g，按“2.2”項方法制備供試品溶液，再按“2.3”項下色譜條件進樣測定。以15號峰丹皮酚為參照，計算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結果，22個共有峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD分別為0.01%～0.19%（n=6）和0.25%～2.75%（n=6）。

2.4.3 穩(wěn)定性試驗 精密稱取杜仲補天素丸（編號S6）4 g，按“2.2”項下方法制備供試品溶液，分別于室溫下放置0、4、8、12、16、20、24 h時按“2.3”項下色譜條件進樣測定。以15號峰丹皮酚為參照，計算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結果，22個共有峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD分別為0.03%～2.79%（n=7）和0.48%～2.93%（n=7）。

2.5 指紋圖譜建立與相似度評價

2.5.1 指紋圖譜建立與共有峰指認 分別取12批杜仲補天素丸樣品，按“2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.3”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。將所得12批樣品的色譜圖導入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012版）》進行分析，以S6（分離度最好）為參照圖譜，采用中位數(shù)生成法，設置時間窗寬度為0.3 min，對色譜峰進行多點校正和全峰匹配，得到HPLC疊加指紋圖譜和對照指紋圖譜（R），詳見圖1。結果，保留時間穩(wěn)定的共有峰有22個，通過與混合對照品色譜圖（以“2.3”項下色譜條件分析所得，見圖2）比對，指認峰1為沒食子酸、峰3為綠原酸、峰6為甘草苷、峰7為金絲桃苷、峰8為毛蕊花糖苷、峰14為淫羊藿苷、峰15為丹皮酚。因峰15分離度好、峰面積較為穩(wěn)定且保留時間適宜，因此確定丹皮酚為參照峰，計算22個共有峰的相對保留時間及相對峰面積，結果見表1、表2。

2.5.2 相似度評價 采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012版）》對12批杜仲補天素丸樣品進行相似度分析。結果，S1～S12批樣品與對照指紋圖譜的相似度分別為0.976、0.998、0.998、0.998、0.999、0.960、0.998、0.995、0.998、0.980、0.998、0.997，均不低于0.960，表明這12批樣品之間的化學成分基本一致，與對照指紋圖譜有很高的相似度。

2.6 化學模式識別

2.6.1 聚類分析 使用SPSS 21.0軟件，運用組間對比法對12批樣品的共有峰峰面積數(shù)據(jù)進行聚類分析，以平方Euclidean距離計算樣品相似程度。結果，12批樣品可聚為4類，其中S1、S3～S5、S7、S9、S11為一類，S2、S10、S12為一類，S6為一類，S8為一類，其聚類分析樹狀圖見圖3。

2.6.2 主成分分析 使用SPSS 21.0軟件和SIMCA 13.0軟件對12批樣品的共有峰峰面積數(shù)據(jù)進行主成分分析。結果，22個共有峰被分成3個主成分，主成分1～3的特征值分別為15.130、4.944、1.122，方差貢獻率分別為68.775%、22.472%、5.099%，累計方差貢獻率為96.346%，表明其能夠概括樣品數(shù)據(jù)的絕大部分信息，主成分1的特征值最大，所涵蓋信息最多。主成分1主要反映了峰2～4、8～11、13～14的信息，主成分2主要反映了峰5～7、12、16、19的信息，主成分3主要反映了峰1、15、17～18、20～22的信息。主成分1中得分系數(shù)較大的共有峰有峰1～4、8～9、13，其中最大的為峰3，其次為峰4，說明峰3（綠原酸）和峰4（未知）可能是影響樣品差異的重要因素，詳見表3。12批杜仲補天素丸物質基準樣品被分為4類，S1、S3～S5、S7、S9、S11為一類，S2、S10、S12為一類，S6為一類，S8為一類，與聚類分析結果一致，詳見圖4。

2.7 杜仲補天素丸中7個成分的含量測定

2.7.1 對照品溶液的制備 同“2.1”項。

2.7.2 供試品溶液的制備 同“2.2”項。

2.7.3 色譜條件 同“2.3”項。

2.7.4 專屬性試驗 取混合對照品溶液、供試品溶液（編號S6）和空白溶液（甲醇），按“2.7.3”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。結果，供試品溶液在與混合對照品溶液峰相同的位置均出峰，空白溶液對測定無干擾，詳見圖2、圖5。

2.7.5 線性關系考察 取“2.7.1”項下混合對照品溶液，按“2.7.3”項下色譜條件依次進樣10、15、20、25、30 μL，記錄峰面積。以待測成分的質量（x，μg）為橫坐標、峰面積（y）為縱坐標，進行回歸分析。結果，7個成分在相應質量范圍內線性關系良好（r均大于0.999），詳見表4。

2.7.6 精密度試驗 精密稱取杜仲補天素丸（編號S6）4 g，按“2.7.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.7.3”項下色譜條件連續(xù)進樣6次，記錄峰面積。結果，沒食子酸、綠原酸、甘草苷、金絲桃苷、毛蕊花糖苷、淫羊藿苷、丹皮酚峰面積的RSD分別為2.84%、2.85%、0.40%、2.58%、2.67%、2.70%、1.60%（n=6），表明方法精密度良好。

2.7.7 重復性試驗 精密稱取杜仲補天素丸（編號S6）6份，每份4 g，按“2.7.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.7.3”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，代入回歸方程計算含量。結果，沒食子酸、綠原酸、甘草苷、金絲桃苷、毛蕊花糖苷、淫羊藿苷、丹皮酚含量的RSD分別為2.40%、2.20%、1.77%、0.80%、2.17%、1.27%、0.39%（n=6），表明方法重復性良好。

2.7.8 穩(wěn)定性試驗 精密稱取杜仲補天素丸（編號S6）4 g，按“2.7.2”項下方法制備供試品溶液，分別于室溫放置0、4、8、12、16、20、24 h時按“2.7.3”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果，沒食子酸、綠原酸、甘草苷、金絲桃苷、毛蕊花糖苷、淫羊藿苷、丹皮酚峰面積的RSD分別為2.86%、2.97%、2.65%、2.65%、2.48%、2.75%、0.77%（n=7），表明供試品溶液在室溫下放置24 h內穩(wěn)定性良好。

2.7.9 加樣回收率試驗 精密稱取杜仲補天素丸（編號S6）4 g，按“2.7.2”項下方法制備供試品溶液6份，分別加入與樣品中待測成分含量相當?shù)膯我粚φ掌啡芤?，再按?.7.3”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算加樣回收率。結果，沒食子酸、綠原酸、甘草苷、金絲桃苷、毛蕊花糖苷、淫羊藿苷、丹皮酚的平均加樣回收率分別為96.97%、102.28%、98.58%、104.43%、104.59%、100.71%、100.47%，RSD分別為2.86%、2.98%、1.89%、1.21%、2.87%、1.29%、0.37%（n=6）。

2.7.10 含量測定 取12批杜仲補天素丸各4 g，按“2.7.2”項下方法制備供試品溶液，再用甲醇稀釋至線性范圍內，按“2.7.3”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，代入回歸方程計算含量。每樣品重復測定3次，取平均值，結果見表5。

3 討論

3.1 提取方法的考察

本課題組前期分別考察了以70%甲醇、甲醇和水為提取溶劑對杜仲補天素丸有效成分提取率的影響，結果，各提取溶劑的有效成分提取率由高到低為甲醇>70%甲醇>水，故選擇甲醇作為提取溶劑，且提取液易于濾過。此外，本課題組還對超聲時間（20、40、60 min）進行了考察，結果顯示，超聲60 min的有效成分提取率最高，故選擇60 min作為超聲時間。

3.2 色譜條件的考察

通過查閱文獻[17-21]，找出杜仲補天素丸中各味中藥所含主要成分的檢測波長，在此基礎上考察了檢測波長分別為210、230、237、240、277、320、330、360 nm時各色譜峰的出峰情況。結果，在330 nm波長下各峰的峰形較好且響應較強。本課題組前期分別考察了以0.1%磷酸水溶液-乙腈和0.2%磷酸水溶液-乙腈為流動相對各色譜峰分離效果的影響，結果顯示，當以0.2%磷酸水溶液-乙腈作為流動相時，各色譜峰之間的分離度較好，故選擇0.2%磷酸水溶液-乙腈作為流動相。

3.3 化學模式識別結果分析

本研究對12批杜仲補天素丸進行聚類分析，結果可分為4類，S1、S3～S5、S7、S9、S11為一類，S2、S10、S12為一類，S6為一類，S8為一類。主成分分析結果表明，共有峰峰1～4、8～9、13可能在杜仲補天素丸的質量控制中起著較重要的作用，其中峰3（綠原酸）和峰4（未知）是造成樣品差異的重要因素。同時，主成分得分圖分類信息與聚類分析樹狀圖分類信息均顯示將12批杜仲補天素丸分為4類，結果一致。

3.4 含量測定結果分析

本研究結果顯示，沒食子酸等7個有效成分為不同批次杜仲補天素丸的共有成分，但各批次樣品中上述有效成分的含量存在較大差異。因此，建議將這7個有效成分含量納入杜仲補天素丸的質量標準，以提高其整體質量。

綜上所述，本研究成功建立了杜仲補天素丸的HPLC指紋圖譜。12批樣品被聚類分成4類，峰3（綠原酸）和峰4（未知）可能是造成樣品差異的重要因素。7個成分中沒食子酸的含量最高。

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（收稿日期：2021-01-25 修回日期：2021-03-02）

（編輯：鄒麗娟）