冠心七味片的含量測定及揮發(fā)性成分特征圖譜的研究

包順茹 李妍 林燕 韓塔娜

【摘 要】 目的：建立冠心七味片中對甲氧基肉桂酸乙酯的含量測定方法及揮發(fā)性成分的特征圖譜。方法：采用氣相色譜法建立冠心七味片的含量及特征圖譜測定方法。采用DB-FFAP毛細管柱（30m×0.32mm，0.25μm），初始溫度150℃，以每分鐘5 ℃的速率升溫至220℃，保持10min;進樣溫度230℃，檢測器溫度250℃。結(jié)果：含量測定中對甲氧基肉桂酸乙酯在29.447～588.940ng范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系（r=0.9993），平均加樣回收率為97.31%，RSD為1.01%（n=6）;建立以對甲氧基肉桂酸乙酯為參照峰的特征圖譜，共11個特征峰。結(jié)論：建立的含量測定及特征圖譜方法可以從定量、定性兩方面對冠心七味片的揮發(fā)性成分進行控制，該方法準確可靠，可用于冠心七味片的質(zhì)量控制。

【關(guān)鍵詞】 冠心七味片;氣相色譜;含量測定;特征圖譜;對甲氧基肉桂酸乙酯

【中圖分類號】R284 【文獻標志碼】 A【文章編號】1007-8517（2021）1-0020-06

Study on Quantitative Analysis and Characteristics Spectrum of Volatile Components from Guanxinqiwei Tablets

BAO Shunru LI Yan LIN Yan HAN Tana*

Inner Mongolian Institute for Drug Control，Hohhot010010，China

Abstract：Objective To establish the quantitative analysis of Ethyl 4-methoxycinnamate and the determination method of characteristics spectrum of vo1atile components from Guanxinqiwei tablets. Method The quantitative analysis and characteristics spectrum of Guanxinqiwei tablets was performed by gas chromatography. DB-FFAPcapillary column （30m×0.32mm，0.25μm）;the initial column temperature was 150℃，then 5℃·min-1up to 220℃ maintained for 10min;injection port temperatures was 230℃，detector temperatures was 250℃. Results The content of ethyl 4-methoxycinnamate was in the range of 29.447ng to 588.940ng， and the linear relationship was good， r=0.9993. Moreover， the average recovery rate was 97.31%， and RSD was 1.01%（n=6）; The specific chromatogram which comprised eleven common peaks of Guanxinqiwei tablets was established with ethyl 4-methoxycinnamate as the reference peak. Conclusion The established determination method and the GC characteristic chromatogram can be used to control the volatile components in Guanxinqiwei tablets qualitatively and quantificationally.This accurate and reliable method can be used for the quality control of Guanxinqiwei Tablets.

Keywords：Guanxinqiwei Tablets;Gas Chromatography;Content Determination; Characteristics Spectrum;Ethyl 4-methoxycinnamate

冠心七味片由丹參、檀香、降香、山柰、肉豆蔻、廣棗、沙棘七味藥材制備而成，具有活血化瘀、強心止痛的作用，用于冠心病、心煩心悸、心絞痛等癥?，F(xiàn)行標準為《衛(wèi)生部藥品標準》蒙藥分冊1998年版，中文名為“冠心七味片”，蒙文名為“烏蘭·溫都順-7”，收載項目為【處方】【制法】【性狀】【檢查】項[1]。近年來仿制該品種生產(chǎn)企業(yè)增多，各企業(yè)注冊標準均有不同程度提高，但均無對山柰的質(zhì)量控制，故對其進行含量測定以期對其進行質(zhì)量控制。基于處方中有檀香、降香、山柰、肉豆蔻四味藥材含揮發(fā)性成分，單一的對其建立標準項目耗時耗力耗材，而中藥特征圖譜是一種多指標的質(zhì)量控制模式 ，能夠全面、綜合地反映和控制中藥的質(zhì)量[2]。故而建立該品種揮發(fā)性成分的氣相特征圖譜，可以為該制劑的質(zhì)量評價提供參考依據(jù)。

1 儀器與試劑試藥

1.1 儀器 日本島津GC-2010氣相色譜儀、Sartorius ME5型電子天平，Mettler XP205型電子天平; AS 5150A超聲清洗儀;ZHT型自動恒溫電熱套（山東鄄城華魯電熱儀器有限公司）、揮發(fā)油提取器。

1.2 試劑與試藥 對甲氧基肉桂酸乙酯[北京盛世康普化工技術(shù)研究院（批號：Z06J7B17277）];降香[中國藥品生物制品檢定所（批號：120952-201007）];檀香[中國藥品生物制品檢定所（批號：121240-201002）];肉豆蔻[中國藥品生物制品檢定所（批號：120926-20107）];山柰[中國藥品生物制品檢定所（批號：121504-201203）]。乙酸乙酯為分析純試液，無水硫酸鈉為分析純試藥。

2 山柰的含量測定

2.1 色譜條件的選擇

2.1.1 色譜柱 聚乙二醇20000（PEG-20M）毛細管柱（柱長30m，內(nèi)徑0.32mm，膜厚度為0.25μm），本試驗研究用DB-FFAP毛細管柱。

2.1.2 程序升溫 初始溫度150℃，以每分鐘5 ℃的速率升溫至220℃，保持10min;進樣溫度230℃，檢測器溫度250℃。

2.1.3 理論板數(shù)的確定 對供試品測定結(jié)果表明，對甲氧基肉桂酸乙酯的理論板數(shù)在60000以上均能達到與相鄰峰分開，故本試驗規(guī)定理論板數(shù)按對甲氧基肉桂酸乙酯峰計應(yīng)不低于60000。

2.2 供試品溶液制備方法的選擇

2.2.1 提取方法的選擇 參照《中國藥典》2015年版一部山柰鑒別項下提取方法，采用超聲提取方法。

2.2.2 提取效率考察 取本品粉末5份，各約1g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加乙酸乙酯10mL，密塞，稱定重量，分別超聲處理（功率為400W，頻率為40kHz）10min、20min、30min、45min、60min，取出放冷，再稱定重量，用乙酸乙酯補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，按上述色譜條件測定。結(jié)果見表1。

從表中數(shù)據(jù)可見，超聲處理20min后，對甲氧基肉桂酸乙酯含量不再增加，故確定超聲時間為20min。

2.3 試驗溶液的制備

2.3.1 對照品溶液的制備 精密稱取對甲氧基肉桂酸乙酯對照品適量，加乙酸乙酯制成每1mL含0.1mg的溶液，即得。

2.3.2 供試品溶液的制備 取本品粉末約1g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入乙酸乙酯10mL，密塞，稱定重量，超聲處理（功率400W，頻率40kHz）20min，取出，放冷，再稱定重量，用乙酸乙酯補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.4 專屬性考察 按本品處方工藝制備不含山柰的陰性樣品，按供試品溶液的制備方法制備陰性對照溶液（缺山柰）。按上述色譜條件，分別精密吸取對照品溶液、供試品溶液與陰性對照溶液各2μL，注入氣相色譜儀。結(jié)果如圖1所示。

從圖中可見，供試品色譜中在與對照品色譜保留時間相同的位置上有色譜峰出現(xiàn)，陰性對照在與對照品色譜保留時間相同的位置上也有色譜峰出現(xiàn)，但干擾小于5%，表明該含量測定方法陰性無干擾，專屬性好。

2.5 線性考察 取對甲氧基肉桂酸乙酯對照品5.008mg，置10mL量瓶中，加乙酸乙酯使溶解，并稀釋至刻度，搖勻，精密吸取0.3μL、0.5μL、1μL、2μL、3μL、4μL、6μL注入氣相色譜儀，按上述色譜條件測定，以峰面積對進樣量進行回歸分析，結(jié)果對甲氧基肉桂酸乙酯在29.447～588.940ng范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系?；貧w方程為：Y=2499.1X-53066，r=0.9993，標準曲線數(shù)據(jù)見表2。

2.6 精密度試驗 取對照品溶液，按上述色譜條件進行測定，進樣量2μL，連續(xù)進樣6次，記錄峰面積值，其RSD為0.35%，表明儀器精密度良好。

2.7 重復(fù)性試驗 取同一批號供試品（批號：34151110）6份，按“2.1.3.2”下方法制備供試品溶液，分別按上述色譜條件進行測定，進樣量各2μL，結(jié)果見表3。

2.8 穩(wěn)定性試驗 取同一批號供試品（批號：34151110），按“2.1.3.2”下方法制備供試品溶液，分別按上述色譜條件于0h、2h、4h、8h、12h、16h進行測定，結(jié)果見表4。

結(jié)果表明，RSD為0.94%，說明本試驗重復(fù)性良好。

從表中數(shù)據(jù)可見，供試品溶液在16h內(nèi)穩(wěn)定，穩(wěn)定性良好。

2.9 回收率試驗 取同一批號供試品（批號：34151110，含對甲氧基肉桂酸乙酯2.02mg·g-1）6份，各約0.5g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，分別精密加入對甲氧基肉桂酸乙酯對照品溶液10mL（濃度為0.09815mg·mL-1），密塞，稱定重量，超聲處理（功率400W，頻率40kHz）20min，取出，放冷，再稱定重量，用乙酸乙酯補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。按上述色譜條件測定，結(jié)果見表5。

加樣回收試驗的回收率在96.20%～98.81%之間，RSD為1.01%，說明該試驗具有較好的準確性。

2.10 耐用性試驗 換同等極性、不同型號的色譜柱，按確定的色譜條件，取重復(fù)性試驗中的4號樣品進行測定，結(jié)果見表6。

2.11 供試品含量限度確定 根據(jù)模擬樣和投料時所用山柰藥材中對甲氧基肉桂酸乙酯的含量，計算出模擬生產(chǎn)工藝轉(zhuǎn)移率為54%，結(jié)合3家生產(chǎn)企業(yè)提供的山柰原料藥材中對甲氧基肉桂酸乙酯的含量數(shù)據(jù)，詳見表7，以50%的轉(zhuǎn)移率計算，該品種每片含對甲氧基肉桂酸乙酯應(yīng)不得少于0.60mg。

2.12 結(jié)果 按照建立的方法對8家生產(chǎn)企業(yè)71批次冠心七味片樣品進行了含量測定，結(jié)果從0.20mg·片-1到2.53mg·片-1，其中有10批次樣品含量低于擬定的限度值（0.6mg·片-1），可見對其進行含量測定存在必要性。

3 特征圖譜

3.1 色譜條件的選擇

3.1.1 色譜柱 聚乙二醇20000-TPA修飾（PEG-20M-TPA修飾）毛細管柱（柱長30m，內(nèi)徑0.32mm，膜厚度為0.25μm，HP-FFAP或DB-FFAP毛細管柱）。

3.1.2 程序升溫 初始溫度100℃，以每分鐘2 ℃的速率升溫至220℃，保持10min;進樣口溫度230℃，檢測器溫度250℃。

3.1.3 理論板數(shù)的確定 對供試品測定結(jié)果表明，對甲氧基肉桂酸乙酯的理論板數(shù)在60000以上均能達到與相鄰峰分開，故本試驗規(guī)定理論板數(shù)按甲氧基肉桂酸乙酯峰計應(yīng)不低于60000。

3.2 提取效率考察 取本品粉末4份，各取約10g，精密稱定，置1000mL圓底燒瓶中，加水500mL，連接揮發(fā)油測定器，自測定器上端加水使充滿刻度部分，并溢流入燒瓶中為止，再加乙酸乙酯2mL分別加熱回流3h、4h、5h、6h，分取乙酸乙酯層，用鋪有無水硫酸鈉1g的漏斗濾過，濾液置5mL量瓶中，加乙酸乙酯至刻度，搖勻，即得。按上述色譜條件測定，結(jié)果見表8。

從表中數(shù)據(jù)可見，加熱回流5h后，對甲氧基肉桂酸乙酯含量基本不再增加，故確定加熱回流5h。

3.3 試驗溶液的制備

3.3.1 參照物溶液的制備 取肉豆蔻對照藥材3g，降香對照藥材2g，山柰對照藥材1.3g，檀香對照藥材1g，置同一500mL圓底燒瓶中，加水200mL，連接揮發(fā)油測定器，自測定器上端加水使充滿刻度部分，并溢流入燒瓶中為止，再加乙酸乙酯2mL加熱回流5h，分取乙酸乙酯層，用鋪有無水硫酸鈉1g的漏斗濾過，濾液置5mL量瓶中，加乙酸乙酯至刻度，搖勻，作為對照藥材參照物溶液。另精密稱取對甲氧基肉桂酸乙酯對照品適量，加乙酸乙酯制成每1mL含0.1mg的溶液，作為對照品參照物溶液。

3.3.2 供試品溶液的制備 取本品粉末約10g，精密稱定，置1000mL圓底燒瓶中，加水500mL，連接揮發(fā)油測定器，自測定器上端加水使充滿刻度部分，并溢流入燒瓶中為止，再加乙酸乙酯2mL加熱回流5h，分取乙酸乙酯層，用鋪有無水硫酸鈉1g的漏斗濾過，濾液置5mL量瓶中，加乙酸乙酯至刻度，搖勻，即得。

3.4 專屬性試驗 按供試品溶液的制備方法制備檀香、肉豆蔻、山柰、降香對照藥材溶液。按確定的色譜條件，分別精密吸取參照物溶液、檀香、肉豆蔻、山柰和降香對照藥材溶液各2μL，注入氣相色譜儀。結(jié)果如圖2所示。

從圖2可見，1、2、4為降香藥材特征峰;5、11為山柰藥材特征峰，其中11為對甲氧基肉桂酸乙酯;3、6、7、8為肉豆蔻藥材特征峰;9、10為檀香藥材特征峰，表明該方法專屬性好。冠心七味片中揮發(fā)性成分對照特征圖譜如圖3所示。

3.5 精密度試驗 取同一批號供試品（批號：34151110，按“2.2.3.2”下方法制備供試品溶液，按上述色譜條件進行測定，進樣量2μL，連續(xù)進樣6次。結(jié)果，以對甲氧基肉桂酸乙酯為參照峰，各共有峰的相對保留時間的RSD≤0.026%，相對峰面積的RSD≤0.724%，表明儀器精密度良好。

3.6 重復(fù)性試驗 取同一批號供試品（批號：34151110）6份，按“2.2.3.2”下方法制備供試品溶液，分別按上述色譜條件進行測定，進樣量各2μL，結(jié)果，以對甲氧基肉桂酸乙酯為參照峰，各共有峰的相對保留時間的RSD≤0.049%，相對峰面積的RSD≤1.096%，表明本試驗重復(fù)性良好。

3.7 穩(wěn)定性試驗 取同一批號供試品（批號：34151110），按“2.2.3.2”下方法制備供試品溶液，分別按上述色譜條件0h、2h、4h、8h、12h、16h進行測定，進樣量各2μL。結(jié)果，以對甲氧基肉桂酸乙酯為參照峰，各共有峰的相對保留時間的RSD≤0.015%，相對峰面積的RSD≤0.929%，表明該樣品在16h穩(wěn)定性良好。

3.8 結(jié)果 由于原料藥材的產(chǎn)地、采收時間、貯存條件等差異，兼顧特征圖譜適用性，故僅對此次抽驗的8個廠家71批次樣品的色譜圖中是否檢出對照特征圖譜中的11個特征峰進行評價。結(jié)果均檢出相應(yīng)的特征峰。表明該方法可作為“冠心七味片”中揮發(fā)性成分的整體質(zhì)量控制的有效方法。

4 討論

對同一廠家不同批次樣品進行特征圖譜測定，發(fā)現(xiàn)各特征峰峰面積大小存在差異，如圖4所示;對8家生產(chǎn)企業(yè)各取1批次樣品進行特征峰對比分析，結(jié)果各企業(yè)樣品都具有11個特征峰，但各特征峰峰面積差異較大，尤其是檀香藥材的特征峰與對照特征圖譜相比差異較大，如圖5所示。原因可能與原料藥的質(zhì)量及投料量及生產(chǎn)工藝有關(guān)，也不排除實驗過程中提取誤差。

特征圖譜可以有效鑒別和評價產(chǎn)品的質(zhì)量優(yōu)劣，顯示產(chǎn)品質(zhì)量的穩(wěn)定性和批間均一性[3-5]。該檢測方法簡便、易操作、重復(fù)性好，適合作為冠心七味片的質(zhì)量標準對其質(zhì)量進行控制，克服了原有質(zhì)量標準無法全面體現(xiàn)含揮發(fā)性成分的藥材內(nèi)在質(zhì)量的缺點。

參考文獻

[1]中華人民共和國衛(wèi)生部藥典委員會.衛(wèi)生部藥品標準：蒙藥分冊[M].1998：141.

[2]秦紅霖，李永申. 特征圖譜技術(shù)在中藥質(zhì)量分析中的應(yīng)用[J].中國實用醫(yī)藥，2014， 9（7）： 253-255.

[3]馬敏，馬 鑫. 逍遙丸中揮發(fā)性成分氣相特征圖譜的研究[J].光明中醫(yī)，2013， 28（8）：1583-1586.

[4]吳 芳，喬蓉霞，楊瑞瑞，等. 牛黃上清丸（片、膠囊）揮發(fā)油特征圖譜研究[J].中成藥，2012， 34（7）：1388-1390.

[5]陳英紅，羅浩銘，王穎，等. 小兒廣樸止瀉口服液質(zhì)量標準研究[J].中國中醫(yī)藥科技，2018， 25（1）：57-59.

（收稿日期：2020-07-04 編輯：陶希睿）