比色法輔助下紫外分光光度法測(cè)定蘆山藤總黃酮含量

陳惠媚 黃穎 劉夢(mèng)君 吳鴻羽 張倚瑋 黎蔚玲

【摘 要】 目的：利用文獻(xiàn)已有方法進(jìn)行測(cè)定蘆山藤中總黃酮含量，為蘆山藤全面發(fā)展質(zhì)量問題分析提供理論依據(jù)。方法：在NaNO3-Al（NO3）3-NaOH比色法輔助下，用紫外分光光度法測(cè)定蘆山藤中總黃酮的含量。結(jié)果：在條件為5%NaNO3-8%Al（NO3）3-5%NaOH，最大吸收波長(zhǎng)為406nm，蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品在18.4～53.6g/mL范圍有較好線性關(guān)系（r=0.9998），線性方程為A=0.01288C+0.01587，總黃酮平均回收率為99.0%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為2.50%。結(jié)論：此方法操作比較簡(jiǎn)便、精密度高、回收率高、重現(xiàn)性好，可用于蘆山藤總黃酮的含量測(cè)定。

【關(guān)鍵詞】 瑤藥;蘆山藤;總黃酮

【中圖分類號(hào)】R284 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A【文章編號(hào)】1007-8517（2021）1-0038-03

Determination of Total Flavonoids in Lushan Vine by UItraviolet Spectrophotometry Assisted by Colorimetry

CHEN Huimei HUANG Ying* LIU Mengjun WU Hongyu ZHANG Yiwei LI Weiling

FacultyofChineseMedicine Science Guangxi University ofChinese medicine，Nanning 530000，China

Abstract：Objective To determine the content of total flavonoids in rattan by the method of literature，so as to provide the basis for the total quality analysis of Lushan vine. Methods The content of total flavonoids in Lushan vine was determined by Ultraviolet Spectrophotometry with the aid of NaNO3-Al（NO3）3-NaOH colorimetry method. Results Under the condition of 5% NaNO3-8% Al （NO3）3-5% NaOH， the maximum absorption wavelength was 406nm， the linear rangeofrutin had a good linear in the range of 18.4～53.6g/mL（r=0.9998）， the linear equation is A=0.01288c+0.01587， the recovery of total flavonoids was 99.0%， and the relative deviation （RSD）was 2.50%.Conclusion Themethod？Is simpie in operation，high in precision，recovery and reproducibility. It can be used for the determination of total flavonoids in rattan.

Keywords：Yao Medicine; Lushan Vine; Total Flavonoids

蘆山藤是菊科植物巖穴千里光Cissamp-elopsis spelaeicola（Vant）C.Jeffrey et Y.L.Chen的干燥莖葉，具有活血、止痛、祛風(fēng)除濕等功效，用于治療跌打損傷、風(fēng)濕骨痛、小兒驚風(fēng)等癥[1]。早記載于《中國(guó)高等植物圖鑒》。而在《貴州植物志》中記載的蘆山藤別名為巖生藤菊。產(chǎn)于四川、貴州、云南、廣西[2]。據(jù)前期的瑤藥調(diào)查發(fā)現(xiàn)，蘆山藤除了友誼關(guān)分布外，廣西壯族自治區(qū)金秀瑤族自治縣的大多數(shù)地方也有分布。但是通過查閱國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)，發(fā)現(xiàn)瑤藥蘆山藤的化學(xué)成分、藥理活性、質(zhì)量控制等方面的相關(guān)報(bào)道、研究較少。梁爽等[3]從糯米風(fēng)75%乙醇提取物中共分離鑒定出12個(gè)化合物。為了進(jìn)一步研究蘆山藤的化學(xué)成分，本實(shí)驗(yàn)利用已有的測(cè)定總黃酮方法，如陳凌霆等[4]采用超聲輔助顯色測(cè)定黃芪總黃酮含量對(duì)廣西瑤藥蘆山藤的總黃酮含量測(cè)定進(jìn)行研究?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 儀器與試劑

1.1 儀器 SHIMADZU電子天平（AUY220）;紫外分光光度儀（北京普析通用儀器有限公司-TU-1901）;昆山市超聲儀器有限公司（KQ5200DE型數(shù)控超聲波清洗器）。

1.2 藥品 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)買于上海詩丹德標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)服務(wù)有限公司，批號(hào)：5981;藥材及鑒定蘆山藤：2019年購(gòu)于廣西金秀縣，經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)壯醫(yī)藥學(xué)院韋松基教授鑒定為菊科植物巖穴千里光Cissampelopsisspelaeicola（Vant）C.Jeffrey et Y.L.Chen的干燥莖葉。實(shí)驗(yàn)室常用藥品，試劑，本實(shí)驗(yàn)中所用試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 提取總黃酮 準(zhǔn)確稱取被粉碎蘆山藤2.000g后于干燥錐形瓶中用70%乙醇（料液比1∶[KG-*3/5]30），60℃溫度下超聲提取30min，超聲輔助乙醇提取法冷卻過濾，制得供試品溶液。

2.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品10mg，放入容量瓶（100mL）中，加70%乙醇溶解后定容，即配成蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液（0.1mg/mL），放入冰箱備用。

2.3 確定最大吸收波長(zhǎng) 顯色劑（5%NaNO3-8%Al（NO3）3-5%NaOH）顯色，顯色時(shí)間參考李敏等[5]研究，在空白組對(duì)照下，測(cè)得供試品溶液的最大吸收波長(zhǎng)，在360～700nm范圍內(nèi)最大吸收波長(zhǎng)為406nm。如圖1所示。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 分別精密量取標(biāo)準(zhǔn)溶液3.0、5.0、7.0、9.0、11.0、13.0mL，置于容量瓶（25mL），用70%乙醇稀釋至25mL，加1.00mLNaNO2溶液（5%），搖勻，放置6min，加入8%Al（NO3）3溶液1.00mL，搖勻，放置6min，再加入10mL5%NaOH溶液，用70%乙醇定容，放置15min用 0.0mL標(biāo)準(zhǔn)溶液組作為空白對(duì)照組，在406nm波長(zhǎng)中測(cè)定其吸光度，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖2所示，結(jié)果表明蘆丁在18.4～53.6g/mL范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系。A=0.01288 C+0.01587，r=0.9998。

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 精密性實(shí)驗(yàn)的測(cè)定 精確量取上述供試品溶液2mL，參照“2.4”項(xiàng)顯色及測(cè)定吸光度的方法制備，連續(xù)測(cè)定5次，RSD為0.90（n=5），結(jié)果表明，該方法具有良好的精密度見表1。

2.5.2 重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn) 取同一批蘆山藤藥材，按照供試品溶液制備的方法制備5份供試品溶液，各取2mL，并按照“2.4”項(xiàng)的顯色方法制備后測(cè)定其吸光度，計(jì)算測(cè)得總黃酮的平均含量為13.48mg/g，RSD為1.75，實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明該方法的重復(fù)性良好。見表2。

2.5.3 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)的測(cè)定 在室溫條件下，精確吸取供試品溶液1mL并參照“2.4”項(xiàng)的方法制備顯色后測(cè)定其吸光度，分別在有光和無光的條件下，靜置不同時(shí)間后分別測(cè)定吸光度，結(jié)果見表3、表4。

由表3、表4可見，在有光和無光的條件下RSD（%）分別為2.4和2.85，結(jié)果表明該實(shí)驗(yàn)在室溫條件中40min內(nèi)具有良好的穩(wěn)定性。

2.5.4 加樣回收率 實(shí)驗(yàn)精密吸取已知含量的蘆山藤供試品溶液6份，每份1mL分別添加0.1mg/mL蘆丁對(duì)照品溶液4mL按照“2.4”項(xiàng)的方法制備，顯色后測(cè)定其吸光度，并計(jì)算回收率。試驗(yàn)結(jié)果平均回收率為99.0%，RSD為2.50%，表明該方法具有良好的回收率。見表5。

2.6 樣品含量的測(cè)定 準(zhǔn)確稱取蘆山藤藥材粉末1g，將這藥材分成3組，配制成供試品溶液按照“2.4”的顯色方法制備成供試品溶液：各精密量取2mL上述制備成的供試溶液置于容量瓶（25mL）中，加70%乙醇定容，加入顯色劑按（5%Na- NO2-8% Al（NO3）-5%NaOH），在406nm的波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度，并計(jì)算出蘆山藤總黃酮的含量。見表6。

根據(jù)整個(gè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)分析表明，在顯色條件為5%NaNO2-8%Al（NO3）3-5%NaOH下，得廣西金秀縣蘆山藤總黃酮的平均含量為1.28%，實(shí)驗(yàn)回收率為99.0%。實(shí)驗(yàn)中精密度，重現(xiàn)性以及加樣回收率的RSD分別為0.90、1.75、2.50，穩(wěn)定性在有光和無光下的RSD為2.40、2.85都符合要求。

3 討論

瑤藥種類繁多，但是目前對(duì)瑤藥研究以及開發(fā)利用相對(duì)較少，而蘆山藤的研究更是缺乏，梁爽等[3]從糯米風(fēng)75%乙醇提取物中共分離鑒定出12個(gè)化合物，主要為萜類、酚酸類、黃酮類等，其成分及藥理作用的研究尚未見相關(guān)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)主要對(duì)蘆山藤的總黃酮進(jìn)行含量測(cè)定;而總黃酮具有較多功效和作用，李磊等[6]研究表明黃芩總黃酮具有顯著的降血脂作用;對(duì)缺血再灌注損傷的保護(hù)作用， 如紀(jì)影實(shí)等[7]研究表明山楂葉總黃酮能夠降低細(xì)胞膜的損傷，具有膜穩(wěn)定性的作用，其能夠提高機(jī)體清除自由基的能力，而且能顯著降低血清中的肌酸激酶以及乳酸脫氫酶的活性。其還具有抗炎作用，柴玲等[8]研究表明擬草果可顯著下調(diào)炎癥因子IL-6的表達(dá)。所以該實(shí)驗(yàn)的研究不但能夠促進(jìn)瑤藥的發(fā)展，而且能促進(jìn)蘆山藤在降血脂、抗炎等方面開發(fā)和利用。本實(shí)驗(yàn)在已有的測(cè)定總黃酮實(shí)驗(yàn)的條件下測(cè)定吸光度，其最大吸收波長(zhǎng)為406nm，線性方程為A=0.01288C+0.01587，總黃酮的回收率為99.0%，相對(duì)偏差RSD為2.50。實(shí)驗(yàn)表明，該方法重復(fù)性、穩(wěn)定性、回收率、精密度均符合含量測(cè)定要求，操作簡(jiǎn)單，結(jié)果可靠。該研究可以為蘆山藤開發(fā)與利用提供進(jìn)一步的理論依據(jù)。

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（收稿日期：2020-07-17 編輯：陶希睿）