化風(fēng)丹藥母指紋圖譜的建立及不同發(fā)酵時間樣品中7種核苷類成分的含量測定

曹國瓊 游珊麗 徐劍 張永萍

摘 要 目的：建立化風(fēng)丹藥母的指紋圖譜，并測定不同發(fā)酵時間樣品中7種核苷類成分的含量。方法：采用高效液相色譜法（HPLC），色譜柱為Pntulips BP-C18，流動相為甲醇-水（梯度洗脫），流速為0.8 mL/min，檢測波長為260 nm，柱溫為35 ℃，進樣量為10 μL。以黃嘌呤為參照，繪制12批化風(fēng)丹藥母的HPLC指紋圖譜;采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012版）》進行相似度評價，確定共有峰;同法測定不同發(fā)酵時間（0、1、2、3、4周）樣品中尿嘧啶、次黃嘌呤、黃嘌呤、尿苷、肌苷、鳥苷、胸苷的含量。結(jié)果：12批化風(fēng)丹藥母共有8個共有峰，相似度為0.712～0.954;指認了7種成分，分別為尿嘧啶、次黃嘌呤、黃嘌呤、尿苷、肌苷、鳥苷、胸苷。不同發(fā)酵時間樣品中上述7種成分檢測質(zhì)量濃度的線性范圍分別為0.87～8.7 μg/mL（r=0.999 6）、1.51～15.1 μg/mL（r=0.999 7）、6.08～60.8 μg/mL（r=0.999 5）、1.52～15.2 μg/mL（r=0.999 6）、1.82～18.2 μg/mL（r=0.999 6）、1.48～14.8 μg/mL（r=0.999 6）、1.63～16.3 μg/mL（r=0.999 3）;定量限分別為 0.027 4、0.076 3、0.250 4、0.172 3、0.101 1、0.078 3、0.084 2 μg/mL，檢測限分別為0.008 7、0.025 5、0.007 9、0.084 1、0.035 7、0.026 9、0.027 5 μg/mL;精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性（12 h）試驗的RSD均小于3%;加樣回收率分別為94.16%～100.16%（RSD=2.24%，n=6），93.87%～100.65%（RSD=2.67%，n=6），93.52%～99.66%（RSD=2.30%，n=6），93.67%～98.24%（RSD=1.89%，n=6），96.00%～102.18%（RSD=1.96%，n=6），94.62%～101.54%（RSD=2.82%，n=6），97.72%～104.56%（RSD=2.97%，n=6）。發(fā)酵0～4周時，上述7種成分及總核苷的含量分別為0.042～0.232、0.027～0.181、0.039～0.651、0.026～0.225、0.034～0.111、0.009～0.124、0.079～0.099 、0.647～1.292 mg/g;發(fā)酵1～4周時的尿嘧啶、次黃嘌呤、黃嘌呤及總核苷的含量均較發(fā)酵0周時顯著升高，而尿苷、肌苷、鳥苷的含量較發(fā)酵0周時顯著降低。結(jié)論：所建指紋圖譜特征性強且操作簡便，可用于化風(fēng)丹藥母的質(zhì)量控制;含量測定方法準確、可靠，可用于同時測定其中7種核苷類有效成分的含量;化風(fēng)丹藥母中的核苷類成分含量受發(fā)酵時間的影響。

關(guān)鍵詞 化風(fēng)丹藥母;高效液相色譜法;指紋圖譜;核苷類成分;含量測定

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To establish fingerprint of Huafengdan yaomu， and to determine the contents of 7 nucleosides in samples of different fermentation time. METHODS： HPLC method was adopted. The determination was performed on Pntulips BP-C18 column with mobile phase consisted of methanol-water （gradient elution） at the flow rate of 0.8 mL/min. The detection wavelength was set at 260 nm， and column temperature was 35 ℃. The sample size was 10 μL. Using xanthine as reference， HPLC fingerprint of 12 batches of Huafengdan yaomu was drawn. The similarity of samples were evaluated with Similarity Evaluation System of TCM Chromatographic Fingerprints （2012 edition）. Common peaks were confirmed. The contents of uracil， hypoxanthine， xanthine， uridine， inosine， guanosine and thymidine were determined in samples of different fermentation time （0， 1， 2， 3， 4 weeks） by the same method. RESULTS： There were 8 common peaks in 12 batches of Huafengdan yaomu， with similarities ranging from 0.712 to 0.954; 7 components were identified， namely uracil， hypoxanthine， xanthine， uridine， inosine， guanosine and thymidine. The linear ranges of mass concentrations of above 7 components in samples at different fermentation time were 0.87-8.7 μg/mL （r=0.999 6）， 1.51-15.1 μg/mL（r=0.999 7）， 6.08-60.8 μg/mL（r=0.999 5）， 1.52-15.2 μg/mL（r=0.999 6）， 1.82-18.2 μg/mL（r=0.999 6）， 1.48-14.8 μg/mL（r=0.999 6）， 1.63-16.3 μg/mL（r=0.999 3）. The limits of quantification were 0.027 4， 0.076 3， 0.250 4， 0.172 3， 0.101 1， 0.078 3， and 0.084 2 μg/mL， and the detection limits were 0.008 7， 0.025 5， 0.007 9， 0.084 1， 0.035 7， 0.026 9， 0.027 5 μg/mL， respectively. RSDs of precision， repeatability and stability tests （12 h） were all less than 3%. The sample recovery rates were 94.16%-100.16% （RSD=2.24%， n=6）， 93.87%-100.65% （RSD=2.67%， n=6）， 93.52%-99.66% （RSD=2.30%， n=6）， 93.67%-98.24% （RSD=1.89%， n=6）， 96.00%-102.18% （RSD=1.96%， n=6）， 94.62%-101.54% （RSD=2.82%， n=6）， 97.72%-104.56% （RSD=2.97%， n=6）. After fermentation for 0-4 weeks， the contents of the above 7 components and total nucleosides were 0.042-0.232， 0.027-0.181， 0.039-0.651， 0.026-0.225， 0.034-0.111， 0.009-0.124， 0.079-0.099， 0.647-1.292 mg/g， respectively. After fermentation for 1-4 weeks， the contents of uracil， hypoxanthine， xanthine and total nucleosides were significantly increased， compared with 0 week of fermentation; the contents of uridine， inosine and guanosine were significantly lower than those in 0 weeks. CONCLUSIONS： The established fingerprint has strong characteristics and simple to operate， which can be used for the quality control of Huafengdan yaomu; the content determination method is accurate and reliable， and can be used to simultaneously determine the contents of 7 active nucleosides; the content of nucleosides in Huafengdan muyao is affected by fermentation time.

KEYWORDS? ?Huafengdan yaomu; HPLC; Fingerprint; Nucleosides; Content determination

中圖分類號 R283.1;R917 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2021）02-0158-06

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2021.02.06

化風(fēng)丹是貴州省傳統(tǒng)名藥，具有息風(fēng)鎮(zhèn)痙、豁痰開竅的功效，臨床用于治療風(fēng)痰閉阻、中風(fēng)偏癱、癲癇等癥，療效顯著[1-2]?；L(fēng)丹的制備分為藥母制備和成藥制備。其中，藥母是將川烏、半夏、天南星、白附子、郁金等藥材粉碎，再加入六神曲和牛膽汁混勻，于自然條件下發(fā)酵，經(jīng)陰干后即得[3-5]。含有毒性成分的中藥是中藥重要組成部分，在中藥復(fù)方制劑中的應(yīng)用十分廣泛，在臨床實踐中發(fā)揮了重要治療作用[6]?；L(fēng)丹藥母中含有川烏、半夏、天南星等多種含毒性成分的中藥，有研究認為，發(fā)酵可以減弱藥物毒副作用，增強療效，改變藥物的原有性能，有利于成分溶出并產(chǎn)生新的活性成分和治療作用[7]。而化風(fēng)丹藥母采用發(fā)酵法進行炮制，目的就在于減少副作用、增強療效。

目前，關(guān)于化風(fēng)丹藥母質(zhì)量檢測僅有藥母中毒性生物堿烏頭堿、新烏頭堿、次烏頭堿、苯甲酰烏頭堿、苯甲酰新烏頭堿、苯甲酰次烏頭堿的報道[8]，暫無有關(guān)其藥母中有效成分含量的研究，且關(guān)于化風(fēng)丹藥母質(zhì)量控制及發(fā)酵前后主要化學(xué)成分或指標性成分的變化也未見相關(guān)文獻報道。因此，建立綜合評價化風(fēng)丹藥母質(zhì)量的方法尤為重要?；L(fēng)丹藥母中的天南星、半夏、白附子為天南星科植物，化學(xué)成分相似，都含有生物堿、核苷、揮發(fā)油、氨基酸、有機酸等成分[9-11]。其中，核苷類如肌苷、尿苷、鳥苷、黃嘌呤、尿嘧啶、次黃嘌呤、胸苷等成分具有廣泛的藥理活性，如調(diào)節(jié)免疫、調(diào)節(jié)腦細胞代謝、鎮(zhèn)靜中樞神經(jīng)、抗血小板聚集等[12-15]。有文獻報道，半夏、天南星和白附子均含有肌苷、尿苷、鳥苷、黃嘌呤等成分[16]，因此核苷類成分可以作為化風(fēng)丹藥母的指標性成分。

指紋圖譜及多成分檢測能提供豐富的指標成分或藥效成分信息，可全面反映藥品的質(zhì)量，近年來已被廣泛應(yīng)用于中藥材和中成藥的質(zhì)量控制領(lǐng)域[17-18]。為此，本研究建立了化風(fēng)丹藥母的高效液相色譜（HPLC）指紋圖譜，同時采用HPLC法測定不同發(fā)酵時間樣品中尿嘧啶、次黃嘌呤、黃嘌呤、尿苷、肌苷、鳥苷、胸苷等7種核苷類成分的含量，旨在為化風(fēng)丹藥母的整體質(zhì)量評價和質(zhì)量控制提供參考。

1 材料

1.1 儀器

本研究所用的儀器有：LC-20AT型HPLC儀（包括LC-20AT型二元泵、SPD-20A型紫外-可見光檢測器，日本Shimadzu公司）、METTLER AE240型萬分之一電子分析天平（瑞士Mettler Toledo公司）、KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）、SHZ-D（Ⅲ）型循環(huán)水真空泵[邦西儀器科技（上海）有限公司]、HSX-250型恒溫恒濕培養(yǎng)箱（上海海向儀器設(shè)備廠）。

1.2 藥品與試劑

尿嘧啶對照品（批號100469-201302，純度99.6%）、次黃嘌呤對照品（批號140661-201704，純度100%）、黃嘌呤對照品（批號140662- 201606，純度100%）、尿苷對照品（批號110887-201802，純度99.5%）、肌苷對照品（批號140669-201606，純度98.6%）、鳥苷對照品（批號111977- 201501，純度93.6%）、胸苷對照品（批號101215-201401，純度100%）均購自中國食品藥品檢定研究院;藥材樣品天南星、半夏、白附子、川烏、郁金（批號分別為20190506、20190412、 20190215、20190116、20190309）和六神曲（批號190207）均購自亳州康美中藥城，5種藥材經(jīng)貴州中醫(yī)藥大學(xué)中藥民族藥資源研究院肖承鴻高級實驗師鑒定分別為天南星科植物天南星Arisaema erubescens （Wall.） Schott的干燥塊莖，天南星科植物半夏Pinellia ternata （Thunb.） Breit.的干燥塊莖，天南星科植物獨角蓮Typhonium giganteum Engl.的干燥塊莖，毛茛科植物烏頭Aconitum carmichaelii Debx.的干燥母根，姜科植物溫郁金Curcuma zvenyujin Y. H. Chenet C. Ling的干燥塊根;牛膽汁收集自屠宰場（按前期研究篩選pH值為6.27～7.29）;甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 化風(fēng)丹藥母的制備

按化風(fēng)丹藥母處方比例（生川烏 ∶ 白附子 ∶ 生半夏 ∶ 生南星 ∶ 郁金 ∶ 六神曲=1 ∶ 1 ∶ 1 ∶ 1 ∶ 0.5 ∶ 0.005，g/g，下同）稱取川烏、白附子、半夏、天南星、郁金和六神曲，置于研缽中混勻，加入與上述藥材總質(zhì)量相等的牛膽汁攪拌均勻，置于密閉容器內(nèi)，于35 ℃、濕度60%的恒溫恒濕培養(yǎng)箱中發(fā)酵4周，取出，干燥，即得化風(fēng)丹藥母。

2.2 化風(fēng)丹藥母發(fā)酵樣品的制備

按化風(fēng)丹藥母處方比例稱取川烏、白附子、半夏、天南星、郁金和六神曲，共12份，按“2.1”項下方法制備發(fā)酵1周樣品（編號S1～S12），用于指紋圖譜的建立及含量測定的方法學(xué)考察（前期預(yù)試驗發(fā)現(xiàn)，無論發(fā)酵幾周，所得樣品均可用于指紋圖譜的建立及含量測定的方法學(xué)考察，故本研究選擇發(fā)酵時間最短的樣品）。另按化風(fēng)丹藥母處方比例稱取川烏、白附子、半夏、天南星、郁金和六神曲，共15份，按“2.1”項下方法分別于發(fā)酵0、1、2、3、4周時取出，每周平行取出3份，置于- 80 ℃冰箱中保存，用于不同發(fā)酵時間樣品的含量測定。

2.3 指紋圖譜的建立

2.3.1 色譜條件 以Pntulips BP-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）為色譜柱;以甲醇（A）-水（B）為流動相，梯度洗脫（0～24 min，100%B;24～48 min，100%B→80%B;48～55 min，80%B→100%B）;流速為0.8 mL/min，檢測波長為260 nm，柱溫為35 ℃，進樣量為10 μL。

2.3.2 供試品溶液的制備 精密稱取“2.2”項下化風(fēng)丹藥母發(fā)酵1周樣品（編號S3），約3 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，加入水20 mL，精密稱定，超聲（功率100 W，頻率53 kHz）處理30 min，放冷，再次稱定質(zhì)量，用水補足減失的質(zhì)量，以20 000? r/min離心10 min，取上清液，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3.3 混合對照品溶液的制備 精密稱定尿嘧啶、次黃嘌呤、黃嘌呤、尿苷、肌苷、鳥苷、胸苷對照品適量，加水制成上述成分質(zhì)量濃度分別為0.174、0.151、0.152、0.152、0.182、0.148、0.163 mg/mL的單一對照品貯備液。分別精密吸取上述單一對照品貯備液0.5、1、4、1、1、1、1 mL，置于10 mL量瓶中，用水定容，混勻，制得尿嘧啶、次黃嘌呤、黃嘌呤、尿苷、肌苷、鳥苷、胸苷質(zhì)量濃度分別為0.008 7、0.015 1、0.060 8、0.015 2、0.018 2、0.014 8、0.016 3 mg/mL的混合對照品溶液。

2.3.4 精密度試驗 取“2.3.2”項下供試品溶液（編號S3）適量，按“2.3.1”項下色譜條件連續(xù)進樣測定6次，以4號峰為參照，記錄各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結(jié)果，8個共有峰相對峰面積的RSD為1.65%～2.24%（n=6），相對保留時間的RSD為0.42%～1.73%（n=6），表明方法精密度良好。

2.3.5 穩(wěn)定性試驗 取“2.3.2”項下供試品溶液（編號S3）適量，分別于室溫下放置0、1、2、4、6、8、12 h時按“2.3.1”項下色譜條件進樣測定，以4號峰為參照，記錄各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結(jié)果，8個共有峰相對峰面積的RSD為1.09%～2.85%（n=7）、相對保留時間的RSD為0.49%～1.67%（n=7），表明供試品溶液于室溫下放置12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.6 重復(fù)性試驗 取“2.2”項下化風(fēng)丹藥母發(fā)酵1周樣品（編號S3），約3 g，共6份，按“2.3.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.3.1”項下色譜條件進樣測定，以4號峰為參照，記錄各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結(jié)果，8個共有峰相對峰面積的RSD為1.37%～2.65%（n=6），相對保留時間的RSD為0.53%～1.64%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

2.3.7 HPLC指紋圖譜的建立 取12批“2.2”項下化風(fēng)丹藥母發(fā)酵1周樣品（編號S1～S12）適量，按“2.3.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.3.1”項下色譜條件進樣測定，采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012 版）》，以S1樣品（隨機選?。┥V圖作為參照色譜，對照指紋圖譜采用中位數(shù)法，設(shè)定時間窗為 0～47 min，時間寬度為 0.3 min，經(jīng)多點校正后自動匹配，采用平均值法生成HPLC 疊加指紋圖譜和對照指紋圖譜，詳見圖1、圖2。

2.3.8 共有峰的指認 12批化風(fēng)丹藥母發(fā)酵1周樣品共有8個共有峰，通過與混合對照品溶液（圖3 A）色譜峰比對，共指認7個色譜峰，分別為尿嘧啶（1號峰）、次黃嘌呤（3號峰）、黃嘌呤（4號峰）、尿苷（5號峰）、肌苷（6號峰）、鳥苷（7號峰）、胸苷（8號峰）。其中，4號峰黃嘌呤色譜峰保留時間適中，與其余色譜峰分離良好，故以其為參照峰（S），計算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積，結(jié)果見表1、表2。

2.3.9 相似度評價 采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012版）》，以S1為對照，對12批化風(fēng)丹藥母發(fā)酵1周樣品進行整體相似度評價。結(jié)果，12批化風(fēng)丹藥母指紋圖譜與對照指紋圖譜的相似度為0.712～0.954，詳見表3。

2.4 7種核苷類成分的含量測定

2.4.1 色譜條件 同“2.3.1”項下色譜條件。

2.4.2 溶液的制備 供試品溶液制備同“2.3.2”項下，混合對照品溶液制備同“2.3.3”項下方法，以水為陰性對照溶液。

2.4.3 系統(tǒng)適用性試驗 取上述混合對照品溶液、供試品溶液、陰性對照溶液各適量，按“2.4.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。結(jié)果，各待測成分色譜峰與相鄰色譜峰的分離度均大于1.5，理論板數(shù)均不低于10 000，詳見圖3。

2.4.4 線性關(guān)系考察 取“2.4.2”項下混合對照品溶液1、2、4、6、8、10 mL，分別置于10 mL量瓶中，加水定容，混勻，得系列線性工作溶液;精密吸取上述系列線性工作溶液，按“2.4.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖，以待測成分質(zhì)量濃度（X，μg/mL）為橫坐標、峰面積（Y）為縱坐標進行線性回歸，結(jié)果見表4。

2.4.5 定量限與檢測限考察 取“2.4.2”項下混合對照品溶液適量，用水逐級稀釋，按“2.4.1”項下色譜條件進樣測定，分別以信噪比10 ∶ 1、3 ∶ 1計算定量限、檢測限。結(jié)果，尿嘧啶、次黃嘌呤、黃嘌呤、尿苷、肌苷、鳥苷、胸苷的定量限分別為0.027 4、0.076 3、0.250 4、0.172 3、0.101 1、0.078 3、0.084 2 μg/mL，檢測限分別為0.008 7、0.025 5、0.007 9、0.084 1、0.035 7、0.026 9、0.027 5 μg/mL。

2.4.6 精密度試驗 取“2.4.2”項下混合對照品溶液，按“2.4.1”項下色譜條件連續(xù)進樣測定6次，記錄峰面積。結(jié)果，尿嘧啶、次黃嘌呤、黃嘌呤、尿苷、肌苷、鳥苷、胸苷峰面積的RSD分別為1.57%、0.92%、2.20%、1.16%、1.15%、1.39%、1.42%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.4.7 重復(fù)性試驗 取化風(fēng)丹藥母發(fā)酵1周樣品（編號S3），約3 g，共6份，按“2.4.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.4.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并按外標法計算樣品含量。結(jié)果，尿嘧啶、次黃嘌呤、黃嘌呤、尿苷、肌苷、鳥苷、胸苷的含量分別為0.169、0.081、0.324、0.161、0.037、0.009、0.098 mg/g，RSD分別為1.25%、1.97%、1.18%、2.03%、2.94%、2.77%、2.02%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

2.4.8 穩(wěn)定性試驗 取“2.4.2”項下供試品溶液（編號S3），分別于室溫下放置0、1、2、4、6、8、12 h時按“2.4.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結(jié)果，尿嘧啶、次黃嘌呤、黃嘌呤、尿苷、肌苷、鳥苷、胸苷峰面積的RSD分別為2.00%、2.13%、2.46%、1.58%、2.43%、1.27%、2.78%（n=7），表明供試品溶液于室溫放置12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.9 加樣回收率試驗 取已知含量的化風(fēng)丹藥母發(fā)酵1周樣品（編號S3），約1.5 g，共6份，精密稱定，分別精密加入各單一對照品溶液（精密稱定尿嘧啶、次黃嘌呤、黃嘌呤、尿苷、肌苷、鳥苷、胸苷對照品各12.85、6.20、12.35、12.25、13.75、3.25、7.45 mg，加水制成上述成分質(zhì)量濃度分別為0.257、0.124、0.494、0.245、0.055、0.013、0.149 mg/mL的單一對照品溶液）1 mL，按“2.4.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.4.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算加樣回收率，結(jié)果見表5。

2.4.10 樣品含量測定 精密稱取“2.2”項下不同發(fā)酵時間的化風(fēng)丹藥母樣品，約3 g，按“2.4.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.4.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并按外標法計算樣品含量，結(jié)果見表6。

由表6可知，發(fā)酵0周（未發(fā)酵）時，化風(fēng)丹藥母中尿嘧啶、次黃嘌呤、黃嘌呤及總核苷的平均含量分別為0.042、0.027、0.039、0.647 mg/g;發(fā)酵不同時間（1～4周）后，上述3種成分及總核苷的平均含量均明顯高于發(fā)酵0周時，平均含量分別為0.160～0.232、0.070～0.181、0.298～0.651、0.845～1.292 mg/g。發(fā)酵0周時，化風(fēng)丹藥母中尿苷、肌苷、鳥苷的平均含量分別為0.225、0.111、0.124 mg/g;發(fā)酵不同時間（1～4周）后，上述3種成分的平均含量均明顯低于發(fā)酵0周時，平均含量分別為0.026～0.162、0.034～0.071、0.009～0.032 mg/g。發(fā)酵0周時，胸苷的平均含量為0.079 mg/g;發(fā)酵不同時間（1～4周）后，其含量稍有增加，為0.084～0.099 mg/g。

3 討論

中藥復(fù)方制劑化學(xué)成分復(fù)雜，選擇梯度洗脫能有利于不同極性成分的分離[19]。本研究參考相關(guān)文獻方法[20]，選擇甲醇-水為流動相，對不同流動相梯度洗脫程序[（0～6 min，100%B;6～60 min，100%B→80%B）、（0～30 min，100%B;30～60 min，100%B→80%B）、（0～24 min，100%B;24～48 min，100%B→80%B;48～55 min，80%B→100%B）]、柱溫（25、30、35 ℃）、流速（8.0、1.0 mL/min）等進行比較。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，采用本研究“2.3.1”項下色譜條件時各色譜峰分離良好，能達到指紋圖譜及定量分析的要求。

指紋圖譜技術(shù)能全面反映中藥的內(nèi)在化學(xué)特征，具有整體性和模糊性特點，已成為控制中藥質(zhì)量的最有效手段[21]。本研究首先建立了化風(fēng)丹藥母的HPLC指紋圖譜，結(jié)果顯示共有8個共有峰，并指認了其中7個共有峰，分別為尿嘧啶、次黃嘌呤、黃嘌呤、尿苷、肌苷、鳥苷和胸苷。

中藥發(fā)酵是指藥物在一定的溫度和濕度條件下，借助微生物和酶的催化分解作用，使藥材發(fā)泡，并生成黃白色霉衣，從而改變藥材原有藥性，以更好地滿足臨床用藥的需要[22]。本研究結(jié)果顯示，不同發(fā)酵時間化風(fēng)丹藥母中核苷類成分含量存在顯著差異，其中不同發(fā)酵時間（1～4周）樣品中尿嘧啶、次黃嘌呤、黃嘌呤及總核苷含量與發(fā)酵0周時比較均顯著增加，其原因可能為未發(fā)酵的化風(fēng)丹藥母中存在其他大分子核苷（酸）類成分等，這些成分在發(fā)酵條件下進行降解，產(chǎn)生小分子的核苷類成分，從而導(dǎo)致部分核苷及總核苷成分含量顯著增加，提示化風(fēng)丹藥母發(fā)酵具有增加有效成分的作用。而尿苷、肌苷、鳥苷的含量與發(fā)酵0周時比較均顯著降低，其原因可能為發(fā)酵過程中微生物對這幾種成分進行分解或轉(zhuǎn)化，也可能為發(fā)酵時加入的牛膽汁呈弱酸性，核苷呈堿性，發(fā)酵過程中發(fā)生了化學(xué)反應(yīng)。

綜上所述，所建指紋圖譜特征性強且操作簡便，可用于化風(fēng)丹藥母的質(zhì)量控制;含量測定方法準確、可靠，可用于同時測定其中7種核苷類有效成分的含量;化風(fēng)丹藥母中的核苷類成分含量受發(fā)酵時間的影響。

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（收稿日期：2020-07-19 修回日期：2020-10-26）

（編輯：陳 宏）