烯丙孕素對(duì)照品的研制及標(biāo)定

姜淋潔，甄盼盼，崔志剛，楊雪，于小婷，程雪嬌

(天津市中升挑戰(zhàn)生物科技有限公司，天津 300080)

烯丙孕素(又稱四烯雌酮，Altrenogest)，分子式為C21H26O2，CAS號(hào)：850-52-2，是一種合成的C21甾類孕激素，屬于19-去甲睪丸素類[1-2]。烯丙孕素是一種人工合成的口服型促孕激素[3]，通過抑制促性腺激素分泌而調(diào)整母畜發(fā)情周期[4],最早于1984年在法國(guó)獲得上市許可,在歐盟和美國(guó)被批準(zhǔn)用于犬(母犬黃體不足[5])、馬(母馬同期發(fā)情[6]、孕酮水平不足的母馬妊娠維持[7]、長(zhǎng)期使用抑制賽馬發(fā)情以保持其競(jìng)技狀態(tài)[8-9]))和豬(母豬同期發(fā)情[10-11])。目前，歐美發(fā)達(dá)國(guó)家已將烯丙孕素作為養(yǎng)豬生產(chǎn)中必不可少的同期發(fā)情調(diào)控劑，且無(wú)更好的替代產(chǎn)品[12]。我國(guó)已經(jīng)批準(zhǔn)法國(guó)詩(shī)華動(dòng)物保健公司和法國(guó)維克有限公司的烯丙孕素內(nèi)服溶液在國(guó)內(nèi)注冊(cè)使用[13-14]，同時(shí)國(guó)內(nèi)多家企業(yè)的烯丙孕素及口服液已作為二類新獸藥進(jìn)行注冊(cè)申報(bào)并生產(chǎn)[15-17]。但是目前烯丙孕素對(duì)照品國(guó)內(nèi)和國(guó)外并無(wú)單位提供，多為企業(yè)自制，給烯丙孕素原料及其口服液的質(zhì)量控制帶來了困難，因此本文進(jìn)行了烯丙孕素工作對(duì)照品的研制并建立了標(biāo)定方法。

1 材料與方法

1.1 儀器 安捷倫1260 高效液相色譜儀包括包括G1311C四元泵，G1329B自動(dòng)進(jìn)樣器，G1316A柱溫箱，G1315D DAD檢測(cè)器，C.01.04[35]色譜工作站，美國(guó)安捷倫科技有限公司；安捷倫1260 II 高效液相色譜儀包括包括G7115A四元泵，G7129A自動(dòng)進(jìn)樣器，G1316A柱溫箱，G7111A DAD檢測(cè)器，C.01.07 SR2[255]色譜工作站，美國(guó)安捷倫科技有限公司；ES225SM-DR電子天平，普利賽斯儀器有限公司；超聲波清洗器，昆山儀器有限公司；真空泵，ASL儀器有限公司。

1.2 藥品與試劑 烯丙孕素原料、烯丙孕素對(duì)照品原料均由天津市中升挑戰(zhàn)生物科技有限公司中試制備；正己烷，色譜純，西隴化工科技有限公司；異丙醇，色譜純，西隴化工科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 采用紫外光譜(UV)、紅外光譜(IR)、質(zhì)譜(MS)、核磁共振波譜(NMR)對(duì)烯丙孕素對(duì)照品進(jìn)行結(jié)構(gòu)確認(rèn) 測(cè)試方法及條件：UV 測(cè)定，供試品用甲醇溶解，濃度為0.014 mg/mL，掃描范圍190～400 nm；IR 測(cè)定，采用KBr壓片法，供試品與KBr的比例約為1∶200；1H-NMR測(cè)定為600 MHz，13C-NMR測(cè)定為600 MHz，供試品采用DMSO溶解；MS 測(cè)定，離子化方式為ESI+。

1.3.2 采用X射線單晶衍射法對(duì)烯丙孕素對(duì)照品原料進(jìn)行結(jié)構(gòu)確認(rèn) 單晶培養(yǎng)條件：取烯丙孕素對(duì)照品原料0.5 g，置燒瓶?jī)?nèi)，加乙酸乙酯溶解，過濾，室溫放置，緩慢揮發(fā)溶劑至晶體長(zhǎng)成。

1.3.3 HPLC 純度檢查 參照中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部公告第101號(hào)[16]附件3中烯丙孕素原料質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)項(xiàng)下有關(guān)物質(zhì)測(cè)定的色譜條件，采用ZORBAX CN C18柱(250 mm×4.0 mm, 5 μm)，流動(dòng)相正己烷-異丙醇(98∶2)，流速1.0 mL/min，柱溫35 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)235 nm。稱取烯丙孕素對(duì)照品原料適量，加流動(dòng)相溶解并稀釋制成每1 mL中約含1 mg的烯丙孕素溶液，作為供試品溶液。分別精密量取供試品溶液10 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖色譜圖至主峰保留時(shí)間的2.5倍，按峰面積歸一化法計(jì)算純度。

1.3.4 干燥失重 按《中國(guó)獸藥典》2015 年版一部[18]干燥失重測(cè)定法(附錄0831)測(cè)定，分別精密稱取兩份烯丙孕素對(duì)照品原料1.00 g，在105 ℃干燥至恒重。

1.3.5 熾灼殘?jiān)?按《中國(guó)獸藥典》2015年版一部[18]熾灼殘?jiān)鼫y(cè)定法(附錄0841)測(cè)定，分別精密稱取兩份烯丙孕素對(duì)照品原料1.00 g置已熾灼至恒重的坩堝中，緩緩熾灼至完全炭化，放冷；加硫酸0.5 mL使?jié)駶?rùn)，低溫加熱至硫酸蒸汽除盡后，在700～800 ℃熾灼使完全灰化，移置干燥器內(nèi)，放冷，精密稱定后，再在700～800 ℃熾灼至恒重，即得。

1.3.6 烯丙孕素對(duì)照品原料熔點(diǎn)測(cè)定 按《中國(guó)獸藥典》2015年版一部[18]熔點(diǎn)測(cè)定法(附錄0841)第一法中傳溫液加熱法測(cè)定，記錄對(duì)照品原料初熔至全熔時(shí)的溫度，重復(fù)測(cè)定3次，取平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 結(jié)構(gòu)確證

2.1.1 采用UV、IR、MS、NMR對(duì)烯丙孕素對(duì)照品結(jié)構(gòu)確認(rèn) 結(jié)果如下：UV λmax：239 nm、343 nm；IR v：3370、3070、3017、2968, 2869、2931、1639、992、913 cm-1；ESI-MS m/z：311.2[M+H]+，與烯丙孕素理論分子量吻合；1H NMR(DMSO)：δ6.496(d，1H，J=10.2 Hz，C-11)，6.428(d，1H，J=10.2 Hz，C-12)，5.932(m，1H，C-21)，5.673(s，1H，C-4)，5.046(t，2H，C-22)，4.452-1.534(m，17H)，0.899(s，3H，C-18)；13C NMR(DMSO)：δ197.868(1C，C-3)，156.383(1C，C-5)，143.063(1C，C-12)，142.376(1C，C-7)，136.289(1C，C-3)，126.776(1C，C-6)，123.900(1C，C-11)，123.312(1C，C-4)，117.591(1C，C-22)，80.988，49.412，48.085，42.905，38.274，36.794，33.621，31.203，27.228，24.108，23.223，17.295(12C，C-17，C-13，C-14，C-20，C-8，C-2，C-16，C-10，C-9，C-1，C-15，C-18)。文獻(xiàn)[22]報(bào)道數(shù)據(jù)為1H NMR(500 MHz，CDCl3)：δ6.47(dd，1H，J=10.5 Hz，Hfrom C-11)，6.36(dd，1H，J=10.5 Hz，Hfrom C-12)，5.98-5.96(m，1H，-CH2CH=CH2)，5.78(s，1H，Hfrom C-4),5.23-5.14(m，2H，-CH2CH=CH2),2.80-1.30(m，17H),1.03(s，3H，CH3)；13C NMR(125MHz，CDCl3)：δ199.4(1C，C-3),156.7(1C，C-5),142.2(1C，C-12),141.8(1C，C-10),134.3(1C，C-9),127.2(1C，C-4),124.1(1C，C-11),123.9(1C，-CH2CH =CH2),119.4(1C，-CH2CH=CH2),81.3(1C,C-17)，49.2，48.0，42.9，38.5，36.9，35.2，31.7，27.3，24.5，23.3(10C，C-1，C-2，C-6，C-7，C-8，C-13，C-14，C-15，C-16，-CH2CH=CH2)，16.1 (1C，-CH3)。烯丙孕素的結(jié)構(gòu)式見圖1，分子式為C21H26O2，理論分子量為310.43，上述結(jié)果表明烯丙孕素對(duì)照品原料化學(xué)結(jié)構(gòu)與烯丙孕素相同。

圖1 烯丙孕素結(jié)構(gòu)式

2.1.2 采用X射線單晶衍射法對(duì)烯丙孕素對(duì)照品原料進(jìn)行結(jié)構(gòu)確認(rèn) 結(jié)構(gòu)單元見圖2。

圖2 烯丙孕素對(duì)照品原料結(jié)構(gòu)單元

2.2 HPLC純度檢查 烯丙孕素對(duì)照品原料在兩臺(tái)安捷倫儀器上測(cè)得的純度見表1，兩臺(tái)儀器取平均值，得到烯丙孕素對(duì)照品原料的純度為99.96%，見圖3和表1。

圖3 烯丙孕素對(duì)照品原料純度測(cè)定色譜圖

表1 烯丙孕素對(duì)照品原料純度測(cè)定結(jié)果

2.3 殘留溶劑 本研究中烯丙孕素原料在中試生產(chǎn)中用到的溶劑有乙醚、四氫呋喃、乙酸乙酯、二氯甲烷、丙酮、甲醇和正己烷，且烯丙孕素對(duì)照品原料最后采用乙酸乙酯進(jìn)行精制，通過干燥失重試驗(yàn)可知，對(duì)照品原料在105 ℃下能很快干燥至恒重，說明殘留溶劑在該條件下能很快揮發(fā)除去，故殘留溶劑的結(jié)果可不必單獨(dú)測(cè)定。

2.4 干燥失重 測(cè)得兩份對(duì)照品原料的干燥失重為0.021%和0.030%，取平均值為0.026%。表明烯丙孕素對(duì)照品原料在該溫度下水分和殘留溶劑能很快揮發(fā)出來，可用干燥失重結(jié)果代替水分和殘留溶劑測(cè)定。

2.5 熾灼殘?jiān)?測(cè)得兩份對(duì)照品原料的熾灼殘?jiān)鼮?.017%和0.015%，取平均值為0.016%。表明烯丙孕素對(duì)照品原料中的無(wú)機(jī)不揮發(fā)性雜質(zhì)的含量為0.016%。

2.6 烯丙孕素對(duì)照品原料含量確定 烯丙孕素對(duì)照品定值采用國(guó)際通用的質(zhì)量平衡法確定含量，同時(shí)定量核磁共振波譜法對(duì)質(zhì)量平衡法賦值準(zhǔn)確性進(jìn)行驗(yàn)證。

2.6.1 質(zhì)量平衡法 賦值結(jié)果含量(%)=純度×(1-干燥失重-熾灼殘?jiān)?×100%，結(jié)果為99.96%×(1-0.026%-0.016%)=99.92%

2.6.2 定量NMR法驗(yàn)證結(jié)果 依據(jù)《中國(guó)藥典》2015年版四部[20]通則0441核磁共振波譜法，以馬來酸作為內(nèi)標(biāo)，樣品用氘代二甲基亞砜溶解后，以烯丙孕素H譜中的5.94信號(hào)峰與內(nèi)標(biāo)物H譜中的6.28信號(hào)峰計(jì)算供試品的含量，定量NMR法含量測(cè)定結(jié)果為99.60%(圖4)。

圖4 烯丙孕素定量核磁共振光譜圖

2.7 烯丙孕素工作對(duì)照品穩(wěn)定性考察 烯丙孕素工作對(duì)照品，用安瓿瓶分裝，50 mg/瓶，放入藥品穩(wěn)定性試驗(yàn)箱中，在(40±2)℃、相對(duì)濕度75%±5%條件下放置6個(gè)月，分別于第1、2、3、6 月取樣，對(duì)樣品性狀、熔點(diǎn)、純度進(jìn)行檢查。表2結(jié)果表明，烯丙孕素工作對(duì)照在(40±2)℃、相對(duì)濕度75%±5%條件下放置6個(gè)月穩(wěn)定。

表2 穩(wěn)定性考察結(jié)果

3 討論與結(jié)論

3.1 烯丙孕素結(jié)構(gòu)確證 烯丙孕素為C21甾類孕激素化合物，化學(xué)結(jié)構(gòu)中具有手型碳原子，因此單純采用核磁共振方法難以確定每個(gè)手型中心的絕對(duì)構(gòu)型，本研究通過溶劑結(jié)晶方法培養(yǎng)得到烯丙孕素對(duì)照品原料單晶，采用X-射線單晶衍射方法對(duì)烯丙孕素的構(gòu)型進(jìn)行進(jìn)一步確定。

3.2 質(zhì)量平衡法賦值 本研究按質(zhì)量平衡法對(duì)本批烯丙孕素對(duì)照品原料進(jìn)行了含量定值[21]。根據(jù)質(zhì)量平衡法原理，標(biāo)準(zhǔn)品含量(%)=[100%-水分(%)-殘留溶劑(%)-無(wú)機(jī)雜質(zhì)(%)]×純度(%)，本公式中的水分和殘留溶劑的測(cè)定結(jié)果可用干燥失重結(jié)果代替[22]。烯丙孕素對(duì)照品原料最后采用乙酸乙酯進(jìn)行精制，乙酸乙酯沸點(diǎn)為76 ℃，在105 ℃能全部揮發(fā)出去，說明水分和有機(jī)溶劑能完全揮發(fā)，可用干燥失重結(jié)果代替水分和殘留溶劑的測(cè)定。

3.3 含量定值 為了準(zhǔn)確標(biāo)定烯丙孕素對(duì)照品原料的含量，采用了兩種不同原理的方法進(jìn)行測(cè)定。按中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部公告第101號(hào)[16]附件質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中烯丙孕素原料的有關(guān)物質(zhì)測(cè)定方法測(cè)定對(duì)照品原料的純度，結(jié)果表明質(zhì)量平衡法結(jié)果與定量核磁波譜法結(jié)果相對(duì)偏差為0.25%，兩種方法標(biāo)定結(jié)果一致。

本批烯丙孕素對(duì)照品原料的結(jié)構(gòu)鑒定結(jié)果與其結(jié)構(gòu)式相符合，用質(zhì)量平衡法測(cè)得的烯丙孕素對(duì)照品原料含量為99.92%，用定量核磁共振波譜法法測(cè)得的結(jié)果為99.60%，兩種方法測(cè)定結(jié)果差異較小，說明本批烯丙孕素對(duì)照品原料賦值準(zhǔn)確，可作為烯丙孕素原料及其制劑研制過程中對(duì)照品使用。