高效液相色譜法檢測豬肉、羊肉中阿托品殘留量的研究

薄永恒，李淑煥，楊修鎮(zhèn)，陳 玲，魏茂蓮，李有志*，章安源，侯云峰，張 勇

(1.山東省獸藥質(zhì)量檢驗(yàn)所，山東省畜產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)測與風(fēng)險(xiǎn)評估重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，濟(jì)南 250022；2.山東省農(nóng)業(yè)工程學(xué)院食品科學(xué)與工程學(xué)院，濟(jì)南 250100；3.山東金鑄基藥業(yè)有限公司，濟(jì)南 271100)

阿托品(atropine)是一種M膽堿受體阻斷藥,具有解除平滑肌的痙攣、抑制腺體分泌、解除迷走神經(jīng)對心臟的抑制、興奮呼吸中樞等藥理活性, 在臨床醫(yī)學(xué)上，阿托品主要用來解除平滑肌痙攣、緩解內(nèi)臟絞痛、改善循環(huán)和抑制腺體分泌，并擴(kuò)大瞳孔，升高眼壓，興奮呼吸中樞。而在獸醫(yī)臨床上主要作為解毒藥,緩解有機(jī)磷中毒的癥狀[1]。

但近年來，不法商販利用阿托品的以上藥理特點(diǎn)，在長途運(yùn)輸前或宰前注射阿托品，利用其抑制腺體分泌的作用特點(diǎn)在短時(shí)間內(nèi)引起動物口渴自主大量飲水，有效減少長途運(yùn)輸?shù)膿p失、提高屠宰率和保持短時(shí)間內(nèi)豬肉、羊肉的持水性能, 從而獲得非法高額利潤,己經(jīng)成為業(yè)內(nèi)公開的秘密[2-3]。若食用含有阿托品殘留的動物性食品后，人會出現(xiàn)瞳孔擴(kuò)大、神志模糊、狂躁不安、抽搐、昏迷等癥狀，因食用含有阿托品的豬肉、羊肉而產(chǎn)生的人群集體中毒事件在近30年來也在報(bào)紙和雜志上有報(bào)道。我國目前暫未制定阿托品在動物源性食品中相關(guān)殘留限量，歐盟也僅僅對嬰幼兒食品中阿托品殘留設(shè)有1 ng/g 的最高殘留限量標(biāo)準(zhǔn)[4-5]。

為了保障食品安全和公共衛(wèi)生安全，必須加強(qiáng)對運(yùn)輸活豬、活羊屠宰后肉品中阿托品殘留的監(jiān)控，本文對豬肉、羊肉中阿托品殘留量的檢測方法進(jìn)行研究，選擇普及廣且操作簡單高效液相色譜儀進(jìn)行檢測，分別對試樣前處理、色譜方法等條件摸索優(yōu)化，保證了檢測方法快速、準(zhǔn)確，可以滿足大批量樣品高靈敏測定，為豬肉、羊肉的安全檢測提供可靠的確證檢測方法。

1 材料與方法

1.1 儀器 高效液相色譜儀(配紫外檢測器)waters公司；MP200B天平；臺式高速冷凍離心機(jī)(貝克曼公司)；氮吹儀(美國Organomation公司)；固相萃取裝置；XW-80A渦旋混合器(上海精科實(shí)業(yè)有限公司)；HY-4調(diào)速多用振蕩器。

1.2 試劑 阿托品對照品(純度為99.9%,Dr.Ehrenstorfer公司)；甲醇、乙腈、正己烷為色譜純(Fisher公司)；磷酸、三乙胺、氯化鈉均為分析純；實(shí)驗(yàn)用水均為超純水。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制 標(biāo)準(zhǔn)儲備液：精密稱取阿托品對照品10 mg，用甲醇定容至100 mL，制成100 μg/mL的溶液，作為標(biāo)準(zhǔn)儲備液，-20 ℃標(biāo)箱保存,在3個(gè)月內(nèi)使用。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法[6]

1.4.1 色譜條件 色譜柱：C18柱，250 mm×4.6 mm(i.d.),粒徑5 μm；流動相為0.025 mol/L磷酸溶液(用三乙胺調(diào)PH=3)-乙腈(87+13，v/v)；流速1.0 mL /min；進(jìn)樣量20 μL；柱溫30 ℃。

1.4.2 樣品前處理

1.4.2.1 提取[7]稱取均質(zhì)的豬肉或羊肉組織 2.00 g(精確至0.01 g)置于50 mL具塞離心管中，加乙腈10 mL，渦旋震蕩1 min，震蕩提取15 min，8000 r/min離心5 min，吸取上清液。向殘?jiān)屑尤胍译?0 mL，重復(fù)提取1次，合并2次提取液，氮吹至近干，用4%氯化鈉溶液5 mL，加正己烷5 mL，渦旋1 min，靜置分層，棄去正己烷溶液，重復(fù)除脂一次，取4%氯化鈉溶液層，置于10 mL具塞離心管中，備用。

1.4.2.2 凈化[1]取HLB固相萃取柱，依次使用3 mL甲醇、3 mL水依次活化，將備用液全部過柱，分別用水3 mL和5%甲醇溶液3 mL淋洗，抽干。用乙腈3 mL洗脫，洗脫液于50 ℃下氮?dú)獯蹈?。?zhǔn)確加入流動相1.00 mL，溶解定容，渦旋混勻，過0.22 μm微孔濾膜，進(jìn)高效液相色譜儀測定。

1.4.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 分別精密量取標(biāo)準(zhǔn)儲備液適量，用流動相稀釋成濃度分別為：0.5、1.0、2.0、4.0、8.0、16.0、20.0 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液，經(jīng) 0.45 μm濾膜過濾后，用高效液相色譜檢測，外標(biāo)法定量。以阿托品峰面積為縱坐標(biāo)，相應(yīng)濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.4.4 靈敏度 在空白豬肉、羊肉中添加阿托品標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別制成0.25、0.5、1.0、5 mg/kg等4個(gè)濃度的空白添加樣品，按確定的提取凈化方法處理后，經(jīng)高效液相色譜檢測，觀察阿托品色譜峰信噪比和對應(yīng)的藥物濃度，確定其檢測限和定量限。

1.4.5 準(zhǔn)確度與精密度 采用標(biāo)準(zhǔn)添加法，在豬肉、羊肉的勻漿組織中添加3個(gè)不同濃度的阿托品進(jìn)行回收率試驗(yàn)。各濃度進(jìn)行 5個(gè)樣品平行試驗(yàn),重復(fù) 3次，求批內(nèi)、批間相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線 阿托品濃度在0.5～20.0 μg /mL范圍內(nèi)，色譜峰面積有良好的線性關(guān)系，標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。

圖1 阿托品溶液的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 方法靈敏度 按上述方法進(jìn)行處理,豬肉、羊肉空白組織中添加濃度為0.25 mg /kg時(shí)，阿托品峰信噪比(S/N)均>3，確定為方法的檢測限，添加濃度為 0.5 mg /kg時(shí)，信噪比(S/N)均>10，確定為方法的最低定量限。豬肉、羊肉空白組織中添加0.5 mg/kg阿托品及相應(yīng)的空白組織的高效液相色譜圖，見圖2～圖5。阿托品標(biāo)準(zhǔn)品色譜見圖6。

圖2 空白豬肉液相色譜圖

圖3 空白豬肉中添加阿托品液相色譜圖(0.5 mg/kg)

圖4 空白羊肉液相色譜圖

圖5 空白羊肉中添加阿托品液相色譜圖(0.5 mg/kg)

圖6 阿托品標(biāo)準(zhǔn)品(1.0 μg /mL)色譜圖

2.3 方法準(zhǔn)確度與精密度 空白組織中阿托品在0.5、1.0、5 mg/kg三個(gè)添加水平，平均回收率為80%～110%，批內(nèi)相對標(biāo)準(zhǔn)偏差≤10 %, 批間相對標(biāo)準(zhǔn)偏差≤20 %。結(jié)果見表1。

表1 豬肉、羊肉中阿托品的相對回收率和精密度

3 討論與結(jié)論

3.1 色譜條件的優(yōu)化 在前期摸索條件的基礎(chǔ)上優(yōu)化了流動相條件。首先，甲醇+0.2 mol/L磷酸二氫鈉(pH=3.5)=(45+55)[1],由于流動相鹽較多，容易堵塞儀器通道及色譜柱，且柱壓太高，棄用。其次，改為甲醇∶0.1%三乙胺(pH=5.8)=35∶65[8-9]，發(fā)現(xiàn)出峰時(shí)間為4 min左右，與文獻(xiàn)不一致，且由于測定樣品是肌肉組織，出峰時(shí)間早，容易出現(xiàn)分離度太小，目標(biāo)物與雜質(zhì)不易分離現(xiàn)象，棄用。最后改為，0.025 mol/L磷酸溶液(pH=3.0)∶乙腈=85∶15[6]，出峰時(shí)間在9 min左右，但是在做添加回收時(shí)，豬肉和羊肉中在8 min時(shí)有一高含量雜質(zhì)與目標(biāo)峰分離度小于1.5，最后調(diào)整流動相為0.025 mol/L磷酸溶液(pH=3.0)∶乙腈=87∶13，出峰時(shí)間在12 min左右，所有雜質(zhì)與目標(biāo)物均有效分離。其中用三乙胺調(diào)節(jié)pH值，三乙胺可有效提高峰形。

通過對阿托品標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行的紫外光譜掃描，發(fā)現(xiàn)在波長為210～202 nm區(qū)間有強(qiáng)吸收，而在多個(gè)參考文獻(xiàn)中都是以210 nm作為測定波長，選擇210和202兩個(gè)波長進(jìn)行了對比實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在本法所采用的流動相下，210 nm處的測定結(jié)果較好，故確定210 nm為檢測波長。

色譜柱采用了C18柱，250 mm×4.6 mm(i.d.),粒徑5 μm，柱子較長，對多雜質(zhì)的分離效果較好。柱溫在25～30 ℃時(shí)，對分離影響不大，條件定為室溫，有利于節(jié)能。進(jìn)樣量20 μL，有利于降低檢出限。

3.2 樣品處理方法的優(yōu)化

3.2.1 提取條件 本研究在李偉妮等研究基礎(chǔ)上[1]，提取條件共優(yōu)化了2次。第一次增加了冰箱-20 ℃冷凍時(shí)間為5 min，用于除脂肪；用水提取體積為10 mL提取2次，精簡了實(shí)驗(yàn)步驟。但在凈化時(shí)，出現(xiàn)過柱困難的情況，凈化效率嚴(yán)重降低，原因在于超聲后，細(xì)胞碎片過多，細(xì)小雜質(zhì)更容易堵住HLB小柱，其次離心轉(zhuǎn)速及時(shí)間不夠，細(xì)胞碎片沒有沉淀，也容易堵住HLB小柱。第二次提取優(yōu)化，更換了提取條件，改為乙腈提取2次，正己烷除脂，減少了超聲后細(xì)胞碎片的產(chǎn)生，同時(shí)脂肪有效去除[7]。用4 %氯化鈉溶解氮吹后的殘?jiān)?，能減少正己烷與水的乳化作用，使之更容易分層。經(jīng)改進(jìn)后的提取條件，提取徹底，雜質(zhì)更少，脂肪顆粒減少，為后續(xù)凈化步驟奠定了基礎(chǔ)。

3.2.2 凈化條件 凈化條件改善了淋洗步驟，將丙酮淋洗，改為水和5 %的甲醇水淋洗。水和5 %甲醇的極性比較大，能將保留在小柱中的雜質(zhì)大多數(shù)沖洗出來，為液相的分離效果以及保護(hù)液相色譜柱提供了保障。

3.3 結(jié)論 通過對樣品的提取條件、凈化條件、色譜條件的優(yōu)化，最后設(shè)定阿托品在豬肉、羊肉中的檢測限為0.25 mg/kg，定量限為0.5 mg/kg。本方法在0.5～5 mg/kg添加濃度范圍內(nèi)，阿托品回收率為80%～110%，符合獸藥殘留實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范[10]。該方法簡單快速,靈敏度高,重現(xiàn)性好,適合豬肉、羊肉中阿托品殘留的測定。