麻杏石甘口服液、楊樹花口服液中非法添加黃芩苷HPLC-PDA檢測方法的建立

龔旭昊，楊星，張璐，范強，汪霞

(中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081)

麻杏石甘口服液由石膏、麻黃、苦杏仁、甘草四味中藥制備而成，具有清熱、宣肺、平喘等功效，主治肺熱咳喘[1]。楊樹花口服液由楊樹花藥材制備而成，具有清熱解毒、化濕止瀉等功效，主治痢疾、腸炎[2]。兩種口服液在臨床上均有較好療效而被廣泛使用。黃芩苷是從黃芩藥材中提取分離出的一種黃酮類化合物，具有顯著的生理活性，可瀉實火，除濕熱，主治壯熱煩渴、肺熱咳喘、濕熱瀉痢等癥[3]。由此可見，黃芩苷和以上兩種口服液的在功效主治方面有較多相似之處。近來，在監(jiān)督檢驗工作中，通過篩查發(fā)現(xiàn)某企業(yè)的一批麻杏石甘口服液樣品中非法添加了處方外成分黃芩苷，但目前尚沒有現(xiàn)行的標準和方法可用于該項檢測。因此，參考《中國獸藥典》2015年版二部黃芩藥材質(zhì)量標準及相關(guān)文獻，選擇黃芩苷為測試藥物，麻杏石甘口服液和楊樹花口服液為目標制劑，建立了麻杏石甘口服液和楊樹花口服液中非法添加黃芩苷的檢查方法。

1 儀器與試藥

1.1 儀器與試劑 高效液相色譜儀(Waters e2695，2998 PDA檢測器，Empower3色譜工作站軟件)，分析天平(Mettler XS205，十萬分之一)，昆山KQ-300型超聲波清洗器，Millipore超純水儀。甲醇(德國Merck公司，色譜純)，磷酸(國藥集團化學試劑有限公司，分析純)，超純水(Millipore超純水儀制備)。

1.2 試藥 黃芩苷對照品(批號：Z0271705，中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，96.8%)；麻杏石甘口服液和楊樹花口服液供試品空白：均為經(jīng)檢測合格的相關(guān)監(jiān)督抽檢樣品；麻杏石甘口服液供試品：某企業(yè)生產(chǎn)的經(jīng)檢測含有黃芩苷非法添加的樣品；楊樹花口服液供試品：上述楊樹花口服液供試品空白中添加黃芩苷測試藥物(陽性模擬)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗 色譜柱：Shiseido MGⅡ C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動相：甲醇-水-磷酸(V:V:V=45:55:0.2)，柱溫：30 ℃，流速：1.0 mL/min，進樣量：10 μL。二極管陣列檢測器，采集波長范圍為210～400 nm，分辨率為1.2 nm，記錄278 nm波長處的色譜圖。供試品溶液中黃芩苷色譜峰和相鄰色譜峰的分離度應(yīng)符合要求。

2.2 溶液制備

2.2.1 對照品溶液 稱取黃芩苷對照品10 mg，置100 mL量瓶中，加甲醇使溶解并稀釋至刻度，搖勻，得濃度為100 μg/mL的黃芩苷對照品溶液。按2.1方法測定，結(jié)果見圖1。

圖1 黃芩苷對照品溶液色譜圖

2.2.2 空白溶液 取麻杏石甘口服液和楊樹花口服液供試品空白各1 mL，分別置100 mL量瓶中，加50%甲醇溶液稀釋至刻度，搖勻，即得兩種供試品空白溶液。按2.1方法測定，結(jié)果見圖2～圖3，表明兩種供試品基質(zhì)對待測物黃芩苷沒有干擾。

圖2 麻杏石甘口服液空白溶液色譜圖

圖3 楊樹花口服液空白溶液色譜圖

2.2.3 供試品溶液 取麻杏石甘口服液供試品1 mL，照2.2.2項下操作制備成麻杏石甘口服液供試品溶液；取楊樹花口服液供試品1 mL，置100 mL量瓶中，再稱取10 mg黃芩苷對照品置同一量瓶中，加50%甲醇溶液使溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得楊樹花口服液供試品溶液。結(jié)果見圖4～圖5。

圖4 麻杏石甘口服液供試液色譜圖

圖5 楊樹花口服液供試液(陽性模擬)色譜圖

2.2.4 建立光譜數(shù)據(jù)庫的溶液 以黃芩苷對照品溶液作為建立光譜數(shù)據(jù)庫的溶液。

2.3 峰純度與光譜相似度檢查 取兩種供試品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，按2.1色譜條件測定。對兩種供試品溶液色譜圖中黃芩苷色譜峰進行峰純度檢查，結(jié)果見表1，顯示黃芩苷峰的純度角度均小于純度閾值，說明未包裹共流出物。表明在此色譜條件下，黃芩苷的出峰處均無其他干擾峰，為單一物質(zhì)峰，方法可行。

對兩種供試品溶液中黃芩苷峰的色譜圖及光譜圖與對照品溶液進行匹配，結(jié)果見表1～表2與圖1、圖4～圖5。數(shù)據(jù)顯示，麻杏石甘口服液及楊樹花口服液供試品溶液中保留時間18.948 min和18.596 min的色譜峰與黃芩苷對照品的保留時間均一致，且均與對照品的光譜圖及最大吸收波長一致，匹配角度均小于匹配閾值。表明兩種供試品溶液中相應(yīng)色譜峰的色譜、光譜與黃芩苷對照品的均一致，為同一物質(zhì)。

表1 峰純度及光譜相似度檢查結(jié)果表

表2 供試品與對照品色譜、光譜結(jié)果表

2.4 方法學考察

2.4.1 專屬性 通過兩種供試品空白試驗排除了樣品基質(zhì)對待測物黃芩苷的干擾。同時，峰純度檢查結(jié)果顯示在此色譜條件下，兩種供試品色譜圖中黃芩苷峰均為單一物質(zhì)峰。

2.4.2 檢測限 檢測限溶液的配制：分別取麻杏石甘口服液和楊樹花口服液供試品空白各1 mL，各置100 mL量瓶中，分別精密加入黃芩苷對照品溶液適量(0.5、1、1.5 mL)，用50%甲醇溶液稀釋至刻度，搖勻，即得。經(jīng)光譜相似度檢查結(jié)果顯示，測試藥物光譜指數(shù)圖發(fā)生輕微變形時仍能實現(xiàn)與光譜庫中對照品光譜的匹配，但考慮到獸藥非法添加量一般都較大，因此，本檢驗方法以光譜圖失真的最大濃度作為方法的檢測限。兩種制劑中黃芩苷檢測限均為50 mg/L。

2.4.3 準確度 以兩種供試品空白中添加被測物對照品(檢測限濃度的10倍)做回收率試驗來考察方法的準確度，每種供試品重復制備6份，以2.2.1中的對照品溶液作為對照進樣，以外標法按峰面積計算回收率。結(jié)果顯示麻杏石甘口服液中黃芩苷的回收率為99.6%，RSD為0.6%；楊樹花口服液中黃芩苷回收率為100.2%，RSD為0.8%。

2.4.4 耐用性 從柱溫、色譜柱兩個方面考察方法的耐用性。調(diào)節(jié)柱溫分別為25 ℃、30 ℃和35 ℃，結(jié)果顯示，兩種制劑的供試液中黃芩苷保留時間隨柱溫升高，保留時間有所提前，但測試藥物黃芩苷在三種柱溫下和相鄰色譜峰分離度均大于1.5，且峰面積、拖尾因子、理論塔板數(shù)基本沒有變化。選擇三款不同品牌色譜柱，對兩種制劑的供試溶液進樣測定，考察不同色譜柱對測定的影響。結(jié)果顯示，三種品牌色譜柱均可用于該項檢查，方法耐用性較好，見表3。

表3 三種色譜柱耐用性考察結(jié)果表

3 討論與結(jié)論

3.1 提取溶劑選擇 根據(jù)藥典及文獻相關(guān)方法，分別考察了水、50%甲醇、甲醇對測試藥物黃芩苷的提取效率。即精密量取麻杏石甘口服液供試品1 mL置100 mL量瓶中，分別加入水、50%甲醇、甲醇稀釋至刻度，搖勻，進樣測定。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，測試藥物黃芩苷在50%甲醇中的提取效果優(yōu)于其他溶劑，最終選擇50%甲醇為供試品提取溶劑。

3.2 提取方式選擇 為了解提取方式對口服液中測試藥物提取效率的影響，精密量取麻杏石甘口服液供試品1 mL置100 mL量瓶中，加50%甲醇適量，分別采取不超聲直接稀釋至刻度并振搖，超聲10 min、超聲30 min后放置至室溫并稀釋至刻度，搖勻，進樣測定。結(jié)果上述三種提取方式所得測試藥物黃芩苷峰面積RSD為0.42%，小于2%。該結(jié)果表明，振搖、超聲10 min、30 min的提取效率基本一致，為方便實驗操作，選擇振搖作為本方法測試藥物的提取方式。

3.3 非法添加物篩查合理性分析 在以往的中獸藥非法添加檢查中，發(fā)現(xiàn)的添加物多為化學藥物成分，而現(xiàn)在市場又出現(xiàn)一種新的極其隱蔽的獸藥造假行為，一些不法企業(yè)為了提高療效，私自調(diào)整中藥處方，在原中藥處方中添加處方外的中藥成分[4]。該行為不但給動物安全帶來很多潛在危害，而且也給檢驗檢測工作帶來了更大挑戰(zhàn)。本文研究的目標制劑麻杏石甘口服液和楊樹花口服液在功效主治方面和黃芩苷有諸多相似之處，但這兩種口服液中均不含有黃芩苷[4-7]，而有資料顯示[8-9]，黃芩中成分對兩種制劑療效的發(fā)揮有一定的協(xié)同作用，且市場中已發(fā)現(xiàn)楊樹花口服液中非法添加黃芩苷的案例。因此上述兩種目標制劑中非法添加黃芩苷符合邏輯規(guī)律。

3.4 檢查方法的擴充使用 除麻杏石甘口服液和楊樹花口服液外，其他獸藥制劑亦可能非法添加黃芩苷。當采用該檢查方法用于其他獸藥制劑中非法添加黃芩苷檢查時，要注意目標分析物以外的成分是否會對測定產(chǎn)生干擾和添加量是否達到藥物發(fā)揮藥效的可能濃度，需進行空白試驗、系統(tǒng)適用性試驗及檢測限的測定，進而滿足檢驗檢測的要求。

試驗所建立的方法中，麻杏石甘口服液和楊樹花口服液各有效成分對檢測無干擾，通過與對照品色譜峰的保留時間進行比對，以及峰純度及光譜相似度檢查來判定兩種制劑中是否添加了黃芩苷，方法操作簡單、專屬性強、靈敏度高、易于推廣，能為獸藥質(zhì)量安全監(jiān)管提供一定的技術(shù)保障。