加米霉素的合成及其晶體結(jié)構(gòu)測(cè)定

崔志剛,王建,甄盼盼,余貴菊,楊雪,王猛,姜淋潔,婁艷華,程雪嬌

(天津市中升挑戰(zhàn)生物科技有限公司, 天津 300380)

加米霉素[1](Gamithromycin) 化學(xué)名(IUPAC)：13-[(2,6-二脫氧-3-C-甲基-3-O-甲基-α-L-吡喃核糖基) 氧 ]-2-乙基-3,4,10-三脫氧3,5,8,10,12,14-六甲基-7-丙基-11-[[3,4,6-三脫氧-3-(二甲氨基)-β-D-吡喃木糖基]氧]-(2R,3S,4R,5S,8R,10R,11R,12S,13S,14R)-1-氧雜-7-氮雜環(huán)-15-單環(huán)。分子式：C40H76N2O12，CAS號(hào)：145435-72-9，是一種新型的第二代大環(huán)內(nèi)酯類獸用抗生素。法國梅里亞公司(MERIAL.CO)生產(chǎn)的以加米霉素為主要有效成分的注射劑ZACTRAN，經(jīng)歐盟藥品監(jiān)督管理局獸藥署的審核，已經(jīng)實(shí)現(xiàn)市場(chǎng)化生產(chǎn)和銷售，加米霉素結(jié)構(gòu)和功效已經(jīng)得到了歐盟藥監(jiān)局獸藥署的認(rèn)可，可用于食用動(dòng)物的食用，具有吸收快、體內(nèi)分布廣泛、體內(nèi)殘留低、安全性高等優(yōu)點(diǎn)，暫無不良反應(yīng)報(bào)道，是一種明確可以使用的獸用抗生素，在獸醫(yī)臨床具有廣闊的應(yīng)用前景，目前國內(nèi)很多廠家已成功申報(bào)二類新獸藥。對(duì)于作為藥物或保健食品成分使用的化合物而言，晶體結(jié)構(gòu)對(duì)化合物的穩(wěn)定性，生物利用度等指標(biāo)有重要影響。目前，研究晶體結(jié)構(gòu)最常見和比較準(zhǔn)確的方法是X-射線單晶衍射法。文獻(xiàn)中已有報(bào)道該化合物的合成[2]，通常以9-脫氧-9-同型紅霉素 A (E)肟為原料，經(jīng)過構(gòu)型轉(zhuǎn)化反應(yīng)，貝克曼重排反應(yīng)，還原反應(yīng)，還原胺化反應(yīng)得到加米霉素，但是仍存在工藝不適合放大生產(chǎn)、不利于環(huán)保、生產(chǎn)成本高等問題。基于以上問題，對(duì)加米霉素的合成工藝進(jìn)行優(yōu)化改進(jìn)，改變中間體的純化方法，更換一些反應(yīng)試劑，從而獲得一種更適合放大生產(chǎn)的工藝，并且使整個(gè)反應(yīng)過程更加安全環(huán)保，成本更加低廉。同時(shí)，首次獲得加米霉素單晶，通過X - 射線衍射單晶結(jié)構(gòu)測(cè)定其結(jié)構(gòu)，并確定其構(gòu)型。

1 材 料

1.1 儀器與試劑 XT-4A顯微熔點(diǎn)儀，上海濟(jì)成分析儀器有限公司；ARX 400 MHz核磁共振儀，瑞士Bruker公司；Bruker Smart Apex 單晶衍射儀，德國Bruker AXS 公司。

1.2 主要藥品及試劑 氫氧化鋰(純度：98%)，無水乙醇(AR)，二氯甲烷(AR)，丙酮(AR)，對(duì)甲苯磺酰氯(AR)，碳酸氫鈉(AR)，硼氫化鈉(AR)，正丙醛(AR,97%)，鈀碳(含鈀5%)(純度：95%)，甲醇(AR)，甲基叔丁醚(AR)，以上試劑均購于國藥集團(tuán)(天津)有限公司；9 - 脫氧 - 9 - 同型紅霉素A(E)肟，批號(hào)：130603，純度：95%，購于浙江國邦藥業(yè)有限公司；TLC展開劑：二氯甲烷：無水甲醇：氨水 = 20∶1∶0.1。

2 方法與結(jié)果

2.1 加米霉素合成路線[3-4]

2.1.1 9-脫氧-9-同型紅霉素A(Z)肟的制備[5-7]向500 mL三口瓶中加入9-脫氧-9-同型紅霉素 A (E) 肟50.0 g、氫氧化鋰4.8 g和無水乙醇500 mL，混合攪拌，室溫反應(yīng)4 h；向反應(yīng)體系中滴加稀鹽酸調(diào)節(jié)pH至8 ～ 9，然后加水100 mL，析出固體，過濾，烘干；所得固體用150 mL二氯甲烷打漿1 h,過濾，烘干得產(chǎn)品43.5 g，收率: 87%；熔點(diǎn): 158～162 ℃；1HNMR(CDCl3):5.01(dd，H-13),4.87(d，H-1″),4.40(d，H-1′),3.98(m，H-5″),3.80(s，H-11),3.49(m，H-5),3.27(s，OCH3),3.21(dd，H-2′),2.99(t，H-4″),2.87(m， H-2,H-8,H-10),2.74(m，H-10),2.43(m，H-3′),2.32(d，H-2″),2.27(s，N(CH3)2),1.91(m，H-4),1.87(m，H-14),1.63(m，H-4′),1.37(m6-CH3),1.28(d，10-CH3),1.24(d，5″-CH3),1.18(d-5′-CH3),1.12(d，2-CH3),1.11(s，12-CH3),1.08(d，8-CH3),1.04(d，4-CH3),0.79(t，CH2CH3)。

2.1.2 9-去氧-12-脫氧-9，12-環(huán)氧-8a，9-二脫氫-8a-氮雜-8a-高紅霉素A的制備 向500 mL三口瓶中加入9-脫氧-9-同型紅霉素A(Z)肟40.0 g和200 mL丙酮,攪拌，溶解，降溫至-5～5 ℃，滴加含對(duì)甲苯磺酰氯20.4 g的丙酮溶液100 mL，攪拌，反應(yīng)0.5 h，然后滴加三乙胺10 mL，攪拌，反應(yīng)1.5 h，TLC檢測(cè)反應(yīng)完成，過濾，濾餅用200 mL二氯甲烷溶解，無水硫酸鈉干燥，過濾，濃縮得到產(chǎn)品37.2 g，收率95.4%，熔點(diǎn):105～110 ℃；1HNMR(CDCl3):5.17(dd，H-13),4.73(d，H-1″),4.47(d，H-1′),4.15(dq，H-5″),4.09(dd，H-3),3.99(brs，H-5),3.81(t，H-11),3.68(m，H-8),3.65(m，H-5′),3.40(ddd，H-2′),3.23(s，OCH3),2.96(t，H-4″),2.70(m，H-2,H-8,H-10),2.70(OH-10),2.68(m，H-3′),2.57(brd，11-OH),2.45(p，H-2),2.31(s，N(CH3)2),2.28(d，H-2″),2.20(d，4″-OH),2.07(ddq，H-14a),1.90(brd，H-7a),1.75(dd，H-7b),1.74(m，H-4),1.70(m，H-4′),1.69(m，H-14b),1.46(dd，H-2′′),1.40(S，6-CH3),1.29(m，H-4′),1.27(d.10-CH3),1.27(d，5″-CH3),1.25(d，2-CH3),1.24(d，5′-CH3),1.21(S，3″-CH3),1.18(s，12-CH3),1.07(d，8-CH3),1.01(d，4-CH3),0.88(t，CH2CH3)。

圖1 加米霉素合成路線

2.1.3 9-去氧-8a-氮雜-8a-高紅霉素A的制備[8-9]

向500 mL三口瓶中加入9-去氧-12-脫氧-9,12-環(huán)氧-8a-氮雜-8a-高紅霉素A 35.0 g，甲醇175 mL，攪拌溶解，降溫-5～5 ℃，分批加入硼氫化鈉9.0 g，加畢，攪拌反應(yīng)2 h，滴加稀鹽酸，調(diào)節(jié)pH至6～7，攪拌反應(yīng)0.5 h，過濾，濃縮得到粗品9-去氧-8a-氮雜-8a-高紅霉素A；將粗品加入到280 mL甲基叔丁醚中，滴加三氟乙酸6.6 g成鹽，攪拌1 h，過濾，濾餅加入到200 mL的10%的碳酸鉀溶液中，攪拌，加入175 mL二氯甲烷，萃取，無水硫酸鈉干燥，濃縮，得到純品32.9 g；收率：93.5%；熔點(diǎn)：176～180 ℃；1HNMR(CDCl3)5.00(d,H-1″),4.75(dd,H-13),4.48(br,d,H-3),4.34(d,H-1′),4.02(dq,H-5″),3.56(br,H-11),3.52(m,H-5),3.31(s,OCH3),3.16(dd,H-2′),3.01(brd,H-4″),2.78(m,H-8),2.69(dq,H-2),2.59(dd,H-9a),2.42(brt,H-9b),2.30(d,H-2″),2.26(s,N(CH3)2),1.91(m,H-14a),1.77(brp,H-4),1.61(brd,H-4′),1.55(dd,H-2′),1.44(m,H-14b),1.38(m,H-7),1.36(s.6-CH3),1.21(s,3″-CH3),1.20(d,5′-CH3),1.18(d,2-CH3),1.06(s,12-CH3),1.10(d,8-CH3),1.04(d,4-CH3),0.94(d,10-CH3),0.86(d,CH2CH3)。

2.1.4 加米霉素的合成[10]向500 mL高壓釜中分別加入9-去氧-8a-氮雜-8a-高紅霉素A25 g，正丙醛100 g，冰醋酸3.0 g，攪拌至溶解，加入鈀/碳催化劑8.0 g，密封高壓釜，釜內(nèi)用氮?dú)庵脫Q三次，氫氣置換三次，充入氫氣至壓力1.4～1.6 MPa，35～45 ℃保溫反應(yīng)，觀測(cè)壓力不再下降。卸壓，取樣點(diǎn)板，檢測(cè)原料反應(yīng)完全，開啟釜蓋，加入純化水200 mL，過濾，濾液加入150 mL二氯甲烷，降溫至20 ℃以下，用20%鹽酸調(diào)節(jié)pH≤4，萃取分液；水相再加入二氯甲烷150 mL，用20%氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH≥10，萃取分液，無水硫酸鈉干燥，濃縮，得到加米霉素成品20.0 g，收率：80%；1HNMR(CDCl3)：5.00(d,H-1″),4.75(dd,H-13),4.48(br,d,H-3),4.34(d,H-1’),4.02(dq,H-5″),3.56(br,H-11),3.5(m,H-5),3.31(s,OCH3),3.16(dd,H-2′),3.01(brd,H-4″),2.78(m,H-8),2.69(dq,H-2),2.59(dd,H-9a),2.42(brt,H-9b),2.30(d,H-2″),2.26(s,N(CH3)2),1.91(m,H-14a),1.77(brp,H-4),1.61(brd,H-4′),1.55(dd,H-2′),1.44(m,H-14b),1.38(m,H-7),1.36(s.6-CH3),1.21(s,3″-CH3),1.20(d,5′-CH3),1.18(d,2-CH3),1.06(s,12-CH3),1.10(d,8-CH3),1.04(d,4-CH3),0.94(d,10-CH3),0.86(d,CH2CH3)。

2.2 加米霉素的單晶培養(yǎng)及晶體結(jié)構(gòu)測(cè)定[11]將1.0 g純度99%的加米霉素白色固體加入到20 mL乙腈中，70 ℃加熱溶解，冷卻，靜止放置，析出晶體。選取大小為0.22 mm×0.18 mm×0.18 mm的單晶，用Bruker Smart ApexII CCD衍生儀收集衍生數(shù)據(jù)。

2.2.1 晶體結(jié)構(gòu)描述[12]晶體屬于單斜晶系，C2空間群，具有手性，純度大于99%，晶胞參數(shù)如表1和圖2所示。

表1 加米霉素晶體結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)

aR1= Σ || Fo|-| Fc||/| Fo|.bwR2= [ Σw(Fo2-Fc2)2/Σw(Fo2)2]1/2

圖2 加米霉素的分子立體構(gòu)型

3 討 論

本研究以9-脫氧-9-同型紅霉素 A (E) 肟為原料，通過構(gòu)型轉(zhuǎn)化反應(yīng)，貝克曼重排反應(yīng)，硼氫化鈉還原反應(yīng)和還原胺化反應(yīng)得到加米霉素。其中，在構(gòu)型轉(zhuǎn)化這步反應(yīng)中，由于在純化過程中也有可能發(fā)生構(gòu)型轉(zhuǎn)化，因此，尋找一個(gè)合適的純化試劑很重要。本文中采用二氯甲烷進(jìn)行純化，原因是原料9-脫氧-9-同型紅霉素 A (E) 肟易溶于二氯甲烷， 而9-脫氧-9-同型紅霉素 A (Z) 肟不溶于二氯甲烷，通過打漿攪拌的方法使成品純度在97%以上，高于已報(bào)道文獻(xiàn)[13]中純度；該過程操作簡(jiǎn)單，容易得到純品，適合大規(guī)模生產(chǎn)；文獻(xiàn)[13]中，后處理方法采用先萃取再濃縮的方法得到產(chǎn)品，但是在后處理的過程中容易構(gòu)型再次轉(zhuǎn)變成原料，導(dǎo)致純度不高。

在制備9-去氧-12-脫氧-9，12-環(huán)氧-8a，9-二脫氫-8a-氮雜-8a-高紅霉素 A的過程中，如果9-脫氧-9-同型紅霉素 A (Z) 肟純度不高，反應(yīng)中會(huì)產(chǎn)生很多雜質(zhì)，該步驟也是難度比較大的一個(gè)步驟，本文使用三乙胺作為有機(jī)堿，不但減少雜質(zhì)的數(shù)量，還減少了對(duì)身體的危害，保證了生產(chǎn)的安全性， 該步收率遠(yuǎn)高于文獻(xiàn)[13]報(bào)道的收率，文獻(xiàn)[13]中所用到的堿為有機(jī)堿吡啶及無機(jī)堿碳酸氫鈉，有機(jī)堿吡啶有一定毒性，不適合放大生產(chǎn)，碳酸氫鈉會(huì)產(chǎn)生一個(gè)比較大的雜質(zhì)，9-羰基-8a-氮雜-8a-同型紅霉素 A，很難除去。

在還原反應(yīng)時(shí)，本文后處理未進(jìn)行純化操作直接進(jìn)行還原胺化反應(yīng)，減少操作步驟，降低產(chǎn)品損失，高于文獻(xiàn)收率，工藝經(jīng)優(yōu)化后適合放大生產(chǎn)。對(duì)比文獻(xiàn)[13]采用先還原再純化的方法，然后再進(jìn)行胺化反應(yīng)，導(dǎo)致收率偏低。

加米霉素樣品用乙腈作溶劑得到加米霉素單晶，確定了加米霉素晶體的空間點(diǎn)群和構(gòu)效方式；加米霉素屬于大環(huán)內(nèi)酯類化合物，有多個(gè)手性中心，會(huì)形成很多不同構(gòu)型，而通過加米霉素單晶解析最終確定了加米霉素的絕對(duì)構(gòu)型，由于該晶體具有很好的晶型結(jié)構(gòu)，對(duì)后續(xù)研究加米霉素新劑型，豐富臨床給藥方式，改善藥代動(dòng)力學(xué)，減少刺激性提高安全性等方面，具有一定的參考價(jià)值。