液相色譜-三重四極桿/線性離子阱復(fù)合質(zhì)譜技術(shù)檢測(cè)?？墒承越M織中吡利霉素的殘留

王亦琳，尹暉，葉妮，孫雷，王鶴佳

(中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081)

吡利霉素(Pirlimycin，cas: 79548-73-5)是獸醫(yī)臨床中廣泛使用的一種動(dòng)物專用的林可霉素類抗菌藥物，由美國(guó)法瑪西亞-普強(qiáng)公司(Pharmacia& Upjohn Company)研制，其化學(xué)結(jié)構(gòu)式見圖1。吡利霉素具有抗革蘭氏陽性菌活性，其抗菌譜與林可霉素和克林霉素相似[1]，對(duì)金黃色葡萄球菌、無乳鏈球菌、停乳鏈球菌、乳房鏈球菌所致的臨床及亞臨床型乳腺炎效果明顯，棄乳期短，是治療奶牛乳腺炎尤其是泌乳期乳腺炎的良好藥物。臨床應(yīng)用中若使用不當(dāng)，很容易造成動(dòng)物可食性組織中的藥物殘留，引發(fā)過敏反應(yīng)等副作用，危害人類健康。我國(guó)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部2019年頒布的食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB31650-2019《食品中獸藥最大殘留限量》[2]規(guī)定，吡利霉素在牛奶和牛肌肉及脂肪組織中的最高殘留限量(MRL)均為100 μg/kg，在牛腎臟組織中的MRL為400 μg/kg，在牛肝臟組織中的MRL為1000 μg/kg。

圖1 吡利霉素化學(xué)結(jié)構(gòu)式

目前國(guó)內(nèi)外已經(jīng)報(bào)道的吡利霉素的殘留分析技術(shù)主要有液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[3-4]和酶聯(lián)免疫法[5]，但多集中于針對(duì)牛奶中的藥物殘留檢測(cè)[6-8]，很少有關(guān)于動(dòng)物性食品中該類藥物殘留檢測(cè)方法的報(bào)道。本文建立了液相色譜-三重四極桿-線性離子阱復(fù)合質(zhì)譜檢測(cè)方法，以滿足吡利霉素在牛肌肉、脂肪、腎臟和肝臟等4種?？墒承越M織中的殘留檢測(cè)要求。

1 材料與方法

1.1 儀器 日本島津公司Shimadzu 30A液相色譜儀-美國(guó)AB SCIEX公司QTrap 6500質(zhì)譜儀(配電噴霧離子源)； AE260電子天平，Mettler Toledo公司； Biofuge Strators高速冷凍離心機(jī)，賀利氏公司； SIR4渦旋混合器，IKA公司；固相萃取裝置，Waters公司。

1.2 藥品和試劑 吡利霉素對(duì)照品，購自德國(guó)Dr.Ehrenstorfer公司，含量≥98.0%；甲酸(色譜純)、甲醇(色譜純)、乙腈(色譜純)，美國(guó)Fisher公司；無水硫酸鈉(分析純)、氯化鈉(分析純)，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；captiva EMR-Lipid固相萃取柱：300 mg/3 mL，美國(guó)Agilent公司；所用水為超純水。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制 精密稱取吡利霉素對(duì)照品約10 mg，置于10 mL棕色量瓶中，用甲醇溶解并稀釋成濃度為1 mg/mL的吡利霉素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液；精密量取1 mg/mL的吡利霉素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液100 μL于10 mL量瓶中，用甲醇溶解并稀釋成濃度為10 μg/mL的吡利霉素標(biāo)準(zhǔn)工作液；精密量取10 μg/mL的吡利霉素標(biāo)準(zhǔn)工作液1 mL于10 mL量瓶中，用5%甲酸乙腈溶液溶解并稀釋成濃度為1 μg/mL的吡利霉素標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.4 樣品前處理

1.4.1 樣品的提取 稱取試料(2±0.02)g于50 mL離心管中，加入陶瓷均質(zhì)子，加5%甲酸乙腈10 mL，渦旋30 s混勻后，加入無水硫酸鈉4 g和氯化鈉1 g，渦旋30 s混勻后，在4 ℃下以8000 r/min離心8 min，轉(zhuǎn)移上清液2.4 mL至另一50 mL離心管中，加水0.6 mL，混勻，備用。

1.4.2 樣品的凈化 取備用液過captiva EMR-Lipid小柱，擠干，收集濾液，過微孔濾膜，供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測(cè)定。

1.5 儀器條件

1.5.1 色譜條件 色譜柱為kinetex F5(50 mm×3.0 mm，2.6 μm)，流動(dòng)相A相為0.1%甲酸水溶液；B相為0.1%甲酸乙腈溶液，梯度洗脫：0～1 min保持10% B；1～3 min，10% B線性變化到90% B；3～4 min保持90% B；4～5 min保持10% B；流速：0.4 mL/min；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：5 μL。

1.5.2 質(zhì)譜條件 電噴霧離子源(ESI+)；電噴霧電壓為5500 V；離子源溫度為500 ℃；輔助氣1為50 psi；輔助氣2為50 psi；氣簾氣為30 psi；碰撞氣為High；檢測(cè)方式為多反應(yīng)監(jiān)測(cè)聯(lián)合信息依賴性采集與增強(qiáng)子離子掃描模式(MRM-IDA-EPI)。吡利霉素定性、定量離子對(duì)及對(duì)應(yīng)的去簇電壓、碰撞能量參考值見表1。IDA參數(shù)：①使用動(dòng)態(tài)背景扣除功能；②從不排除之前的目標(biāo)離子；③觸發(fā)閾值：100cps。EPI參數(shù)：①掃描范圍：m/z100～400；②掃描速度：10000 Da/s；③CE：35ev；CES：15ev。

表1 吡利霉素MRM參數(shù)

1.6 基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密量取適宜濃度的吡利霉素標(biāo)準(zhǔn)工作液適量，用提取凈化后的空白試料濾液稀釋成含藥物濃度分別為1、2、5、10、100和400 ng/mL的系列基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作液(肌肉和脂肪采用1、2、5、10和100 ng/mL的濃度點(diǎn)，腎臟和肝臟采用1、2、5、10、100和400 ng/mL的濃度點(diǎn))，從中各取1.0 mL，過微孔濾膜，作為基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液上機(jī)測(cè)定。以特征離子質(zhì)量色譜峰面積為縱坐標(biāo)，基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計(jì)算回歸方程及相關(guān)系數(shù)。

1.7 方法準(zhǔn)確度及精密度的測(cè)定 采用標(biāo)準(zhǔn)添加法，在空白牛肌肉、脂肪、腎臟和肝臟中添加低、中、高濃度的吡利霉素標(biāo)準(zhǔn)工作液。在牛肌肉和牛脂肪中的添加濃度為10、100、200 μg/kg；在牛腎臟中的添加濃度為10、400、800 μg/kg；在牛肝臟中的藥物濃度為10、1000、2000 μg/kg。每種濃度5個(gè)樣品平行試驗(yàn)，重復(fù)3批次，按照1.4樣品前處理方法處理之后上機(jī)測(cè)定，基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液外標(biāo)法定量，計(jì)算回收率、批內(nèi)、批間變異系數(shù)。

1.8 方法靈敏度確定 添加適量濃度的吡利霉素標(biāo)準(zhǔn)工作液于2 g空白牛肌肉、脂肪、腎臟和肝臟組織中，經(jīng)前處理后測(cè)定，觀察藥物特征離子質(zhì)量色譜峰信噪比(S/N) 和對(duì)應(yīng)藥物濃度，以 S/N>3(按PtP算)作為方法的檢測(cè)限，S/N>10(按PtP算)作為方法的定量限。

2 結(jié)果與分析

2.1 定性分析 在一般的MRM檢測(cè)模式中，通常選擇一個(gè)母離子和兩個(gè)響應(yīng)較強(qiáng)的子離子進(jìn)行定性分析。但在殘留檢測(cè)的實(shí)際工作中，由于待測(cè)樣品的基質(zhì)比較復(fù)雜，檢測(cè)中經(jīng)常會(huì)出現(xiàn)假陽性峰，影響定性的準(zhǔn)確性。本研究采用MRM-IDA-EPI檢測(cè)模式，可以得到目標(biāo)子離子的二級(jí)子離子全掃描質(zhì)譜圖(EPI圖)，通過與對(duì)照溶液的EPI圖進(jìn)行對(duì)比，可以更為準(zhǔn)確地做出定性判斷。圖2是吡利霉素陽性添加樣品和對(duì)照溶液的EPI圖對(duì)比，可以發(fā)現(xiàn)兩者的特征子離子匹配度很高。按照一個(gè)母離子1個(gè)識(shí)別點(diǎn)(IP)點(diǎn)，一個(gè)子離子1.5個(gè)IP點(diǎn)計(jì)算，圖2中有6個(gè)特征子離子，共10個(gè)IP點(diǎn)，超出歐盟2002/657/EC[9]規(guī)定的有最大殘留限量獸藥獸藥確證檢測(cè)至少需要3個(gè)IP點(diǎn)的要求，提高了復(fù)雜基質(zhì)中定性的準(zhǔn)確性。

1: 吡利霉素空白牛肝添加樣品; 2: 吡利霉素對(duì)照溶液 1: Blank cattle kidney sample added with pirlimycin; 2: Standard solution of pirlimycin

2.2 基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線 以吡利霉素的特征離子質(zhì)量色譜峰面積與其對(duì)應(yīng)的基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度作圖，得到相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性回歸方程及相關(guān)系數(shù)(R2)見表2。吡利霉素于牛肌肉和脂肪中在1～100 ng/mL的濃度范圍內(nèi)，于牛腎臟和肝臟中在1～400 ng/mL濃度范圍內(nèi)，特征離子質(zhì)量色譜峰面積與濃度均呈良好的線性關(guān)系，R2均>0.990。

表2 空白?？墒承越M織中吡利霉素的回歸方程和相關(guān)系數(shù)

2.3 方法靈敏度 按1.8中所述方法進(jìn)行處理，依據(jù)吡利霉素特征離子質(zhì)量色譜峰信噪比S/N>3和S/N>10分別為方法的檢測(cè)限和定量限，得出在空白牛肌肉、脂肪、腎臟和肝臟組織中，吡利霉素的檢測(cè)限均為5 μg/kg，定量限均為10 μg/kg。4種空白牛組織基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液中吡利霉素的特征離子質(zhì)量色譜圖見圖3。

2.4 方法準(zhǔn)確度及精密度 在空白牛肌肉、脂肪、腎臟和肝臟中各添加3個(gè)不同濃度的吡利霉素標(biāo)準(zhǔn)工作液進(jìn)行回收率試驗(yàn)，。結(jié)果表明，吡利霉素在牛肌肉和牛脂肪10～200 μg/kg，牛腎臟10～800 μg/kg，以及牛肝臟10～2000 μg/kg添加濃度水平上的回收率在60.2%～101%范圍內(nèi)；批內(nèi)與批間RSD均小于13%。結(jié)果見表3。

1: 空白牛肌肉; 2: 空白牛脂肪; 3: 空白牛腎臟; 4: 空白牛肝臟 1: Blank cattle muscle; 2: Blank cattle fat; 3: Blank cattle kidney; 4: Blank cattle liver

表3 空白?？墒承越M織中吡利霉素添加的回收率(n=5)

3 討論與結(jié)論

3.1 提取條件的選擇 試驗(yàn)中最先參考已報(bào)道的牛奶中吡利霉素殘留檢測(cè)的提取方法[6]，在樣品中直接加入甲酸乙腈提取液渦旋混合，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該方法易使組織快速成團(tuán)，難以將其中的藥物殘留充分提取，大大降低了回收率。經(jīng)過反復(fù)嘗試，最后采用以下方法：根據(jù)稱樣量，選擇適宜體積的5%甲酸乙腈提取一次，同時(shí)在離心管中加入了陶瓷均質(zhì)子，可以使組織足夠散碎，充分與甲酸乙腈接觸，大大提高吡利霉素的提取率。加入了無水硫酸鈉和氯化鈉，可以有效吸收組織中的水分。同時(shí)通過高速離心又能很好地去除蛋白質(zhì)等大量雜質(zhì)的干擾，并且在不影響回收率的前提下盡可能減少過柱體積，為實(shí)際應(yīng)用過程中進(jìn)行大批量樣品檢測(cè)節(jié)省了時(shí)間，提高了檢測(cè)效率。

3.2 凈化條件的選擇 根據(jù)吡利霉素的理化性質(zhì)，試驗(yàn)首先考察了MCX柱和HLB柱的凈化效果，然而在試驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)上述兩種小柱都比較耗時(shí)且回收率較低。通過多次嘗試和比較，最后確定采用直接過captiva EMR-Lipid小柱，收集濾液進(jìn)行凈化，濾液可以直接過濾膜后上機(jī)檢測(cè)，省去了活化、淋洗和吹干的步驟，為實(shí)際應(yīng)用過程中大批量樣品檢測(cè)時(shí)節(jié)省時(shí)間提供了便利。

3.3 定性方法的選擇 由于本文的分析對(duì)象牛肌肉、脂肪、腎臟、肝臟均屬于動(dòng)物源性樣品，基質(zhì)比較復(fù)雜，在使用一般的MRM方法進(jìn)行樣品檢測(cè)時(shí)，目標(biāo)分析物容易受到復(fù)雜基質(zhì)的干擾影響。樣品中離子對(duì)豐度比與對(duì)照溶液相比，容許偏差易超出歐盟2002/657/EC[9]中的規(guī)定，影響定性的準(zhǔn)確性。因此我們建立了MRM-IDA-EPI的質(zhì)譜分析方法。利用儀器的線性離子阱(Trap)功能在第三重四極桿處(Q3)進(jìn)行子離子的富集掃描[10-11]，在使用MRM定量的同時(shí)，得到目標(biāo)子離子的二級(jí)質(zhì)譜全掃描圖，豐富了樣品定性所需要的質(zhì)譜數(shù)據(jù)，提高了方法的選擇性[12-15]。

3.4 定量方法的選擇 該方法針對(duì)牛肌肉、脂肪、腎臟、肝臟，在進(jìn)行前處理后上機(jī)測(cè)試發(fā)現(xiàn)有一定的基質(zhì)效應(yīng)。因此在定量方法選擇時(shí)采用了基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液法進(jìn)行定量，可以有效消除基質(zhì)效應(yīng)的影響，提高方法定量的準(zhǔn)確性。

本文采用液相色譜-三重四極桿/線性離子阱復(fù)合質(zhì)譜技術(shù)建立了一種可檢測(cè)牛肌肉，脂肪，腎臟和肝臟中吡利霉素殘留的分析方法。該方法在進(jìn)行常規(guī)的MRM采集同時(shí)，采用IDA-EPI模式又可以獲得目標(biāo)分析物子離子的完整二級(jí)質(zhì)譜信息，同時(shí)實(shí)現(xiàn)了定性和定量，可以有效防止假陽性的產(chǎn)生。同時(shí)該方法具有良好的可操作性和重現(xiàn)性，方法準(zhǔn)確度，靈敏度和精密度均能滿足獸藥殘留分析方面的要求。