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    烯丙孕素緩釋微球的制備及特性研究

    2024-05-09 08:30:44陳沃俊張志遠(yuǎn)鄧翔云張妙齊曾藹寧冼偉杭陳勝鋒陳志勝計(jì)慧琴劉璨穎白銀山王丙云
    關(guān)鍵詞:孕素吐溫藥量

    陳沃俊,張志遠(yuǎn),鄧翔云,張妙齊,曾藹寧,冼偉杭,陳勝鋒,陳志勝,計(jì)慧琴,劉璨穎,張 暉,白銀山,王丙云

    (佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院 生命科學(xué)與工程學(xué)院,廣東佛山 528000)

    母豬批次化生產(chǎn)管理是現(xiàn)代集約化養(yǎng)殖的關(guān)鍵,通過人為控制,實(shí)現(xiàn)對(duì)豬群繁育過程的同步管理,使同一批次的母豬同期發(fā)情、同期排卵、同期配種、同期妊娠以及同期分娩。烯丙孕素(altrenogest)是母豬批次化生產(chǎn)管理中同步發(fā)情環(huán)節(jié)的關(guān)鍵藥物,是一種人工合成的21碳甾體類孕激素[1-2]。烯丙孕素的作用機(jī)理與天然黃體酮相似,給藥期間能抑制腦垂體分泌促性腺激素,從而阻止卵泡發(fā)育以及母豬發(fā)情。停藥后,腦垂體恢復(fù)促性腺激素的分泌,母豬恢復(fù)發(fā)情和卵泡發(fā)育[3-5]。由于其水溶性差,生物利用度低,因此需要頻繁給藥以維持有效藥物濃度,在臨床應(yīng)用時(shí)通常以20 mg/d的劑量連續(xù)給藥18 d,給豬場(chǎng)添加了許多工作量。

    微球(microsphere)作為藥物載體的研究始于20世紀(jì)70年代中期,具有靶向性、緩釋長(zhǎng)效性以及能掩蓋藥物不良?xì)馕兜葍?yōu)點(diǎn),是一種良好的藥物載體[6]。用于制備微球的包材種類繁多,其中單甲氧基聚乙二醇-聚乳酸共聚物(polyethylene glycol monomethyl ether-polylactic acid,mPEG-PLA)具有良好的生物相容性和可生物降解性,最終可完全降解為CO2和H2O排出體外,不會(huì)在動(dòng)物體內(nèi)積聚產(chǎn)生毒副作用,是一種新型控制藥物釋放的載體材料[7]。mPEG-PLA是FDA批準(zhǔn)的一類藥物輔料,已廣泛用于生物醫(yī)學(xué),特別是藥物輸送系統(tǒng)領(lǐng)域,在臨床上取得了較好效果[8]。另外,以mPEG-PLA作為載體材料制備的微粒制劑具有良好的緩釋性能,Zhang等使用乳化-溶劑揮發(fā)法制備三七總皂苷/mPEG-PLA微球,經(jīng)體外釋放試驗(yàn)證明三七總皂苷/mPEG-PLA微球穩(wěn)定、長(zhǎng)效釋放24 d,并能在60 d內(nèi)降解[9]。

    本試驗(yàn)擬采用mPEG-PLA為載體材料,通過乳化-溶劑揮發(fā)法制備烯丙孕素緩釋微球,達(dá)到烯丙孕素在母豬體內(nèi)緩慢長(zhǎng)效釋放、提高其生物利用度、減少臨床給藥次數(shù)和降低養(yǎng)殖成本的目的。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 藥品 烯丙孕素原料藥,純度為98%,上海源葉生物科技有限公司產(chǎn)品;烯丙孕素對(duì)照品(批號(hào)160415),純度99%以上,購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)訂購(gòu)平臺(tái)。

    1.1.2 主要試劑 mPEG2000-PLLA10000,相對(duì)分子質(zhì)量約為12 000,下文統(tǒng)稱mPEG-PLA,濟(jì)南岱罡生物工程有限公司產(chǎn)品;明膠、吐溫-80,均為生工生物工程(上海)股份有限公司產(chǎn)品;二氯甲烷,天津市大茂化學(xué)試劑廠產(chǎn)品;無水乙醇,天津市百世化工有限公司產(chǎn)品;乙腈,美國(guó)天地有限公司產(chǎn)品。乙腈為色譜純,其余藥品與試劑均為分析純。

    1.1.3 主要儀器 電動(dòng)恒速攪拌器(LC-OES-60SH),購(gòu)自上海力辰邦西儀器科技有限公司;電子分析天平,梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司產(chǎn)品;臺(tái)式離心機(jī)(TG16-WS),湖南湘儀離心機(jī)儀器有限公司產(chǎn)品;真空冷凍干燥機(jī)(德國(guó)Cheist Alpha 1-4 LSC),購(gòu)自Marin Christ公司;RC-6溶出度測(cè)定儀,天津天光光學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品;LC-15C高效液相色譜儀,日本島津公司產(chǎn)品;馬爾文激光粒度儀Mastersizer3000,英國(guó)馬爾文帕納科公司產(chǎn)品;綜合藥物穩(wěn)定性試驗(yàn)箱(WYH-100Z),購(gòu)自杭州旌斐儀器科技有限公司。

    1.2 方法

    1.2.1 烯丙孕素緩釋微球的制備及工藝優(yōu)選 制備方法:采用乳化-溶劑揮發(fā)法制備烯丙孕素緩釋微球。烯丙孕素緩釋微球制備的全過程需要在避光條件下進(jìn)行。將適量的烯丙孕素和mPEG-PLA溶解于二氯甲烷,作為油相;將適量明膠和吐溫-80溶解于純水,作為水相。將水相緩慢加入到處于持續(xù)攪拌狀態(tài)的油相中,形成O/W型乳劑,在常溫下攪拌至二氯甲烷全部揮發(fā)。收集二氯甲烷揮發(fā)完全后的產(chǎn)物,4 000 r/min離心10 min后,用純水洗滌3次,離心收集洗滌后的產(chǎn)物,真空冷凍干燥后即得烯丙孕素緩釋微球。

    制備工藝優(yōu)選:在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,挑選出對(duì)烯丙孕素制備影響較大的5個(gè)因素(攪拌速度、水相中吐溫-80含量、mPEG-PLA質(zhì)量濃度、油水體積比、水相中明膠含量),每個(gè)因素設(shè)置5個(gè)水平進(jìn)行正交試驗(yàn)設(shè)計(jì),表1為正交試驗(yàn)因素與水平表。使用SPSS 17.0設(shè)計(jì)L25(55)正交表,并以包封率為評(píng)價(jià)指標(biāo),篩選烯丙孕素緩釋微球的最佳制備條件。

    表1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平

    1.2.2 烯丙孕素標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 高效液相色譜條件:Ecosil C18色譜柱(5 μm,4.6×250 mm,120ACUXE),其余色譜條件參考黃忠等烯丙孕素含量測(cè)定的色譜條件[10]。

    標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立:精密稱取10 mg的烯丙孕素對(duì)照品,用無水乙醇溶解并稀釋,配制成3.125、6.25、12.5、25、50、100 μg/mL的烯丙孕素對(duì)照品工作液,用0.22 μm的有機(jī)系針筒式過濾器過膜后,按照上述的色譜條件進(jìn)行分析。以色譜峰面積為縱坐標(biāo),以烯丙孕素對(duì)照品濃度為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸,得到標(biāo)準(zhǔn)曲線圖和線性回歸方程。

    1.2.3 包封率和載藥量的測(cè)定 準(zhǔn)確稱取10 mg烯丙孕素緩釋微球于10 mL棕色容量瓶中,加入1 mL二氯甲烷并在30℃的條件下超聲15 min后,加入無水乙醇定容。用0.22 μm的有機(jī)系針筒式過濾器過膜后,按照1.2.2所述的色譜條件進(jìn)樣分析。載藥量和包封率計(jì)算公式如下:

    載藥量(%)=提取液藥物濃度×提取液總體積/烯丙孕素緩釋微球質(zhì)量(10 mg)

    包封率(%)=載藥量×烯丙孕素緩釋微球總質(zhì)量/烯丙孕素投藥量

    1.2.4 烯丙孕素緩釋微球形態(tài)觀察與粒徑測(cè)定 參考李希凱等[11]微球形態(tài)觀察的掃描電鏡條件,并使用馬爾文激光粒度儀Mastersizer3000測(cè)定烯丙孕素緩釋微球的平均粒徑,并記錄粒徑分布圖。

    1.2.5 烯丙孕素緩釋微球的體外釋放試驗(yàn)及體外釋放曲線方程擬合 溶出度測(cè)定方法按照《中國(guó)獸藥典》2015版溶出度測(cè)定法第二法漿法,溶出介質(zhì)分別為含1%吐溫-80 pH 1.2的鹽酸緩沖溶液、含1%吐溫-80 pH 4.1的乙酸緩沖溶液以及含1%吐溫-80 pH 6.8的磷酸鹽緩沖溶液各900 mL,溶出溫度為37℃±0.5℃,轉(zhuǎn)速100 r/min,烯丙孕素緩釋微球的添加質(zhì)量為1 000 mg,分別于0.25、0.5、1、2、3、4 h取樣1 mL,并迅速向溶出杯內(nèi)添加相同體積相同溫度的溶出介質(zhì),使用高效液相色譜法測(cè)定樣品中烯丙孕素的藥物濃度,并換算成累計(jì)釋藥量,繪制體外釋放曲線。

    體外釋放曲線方程擬合:以時(shí)間t為橫坐標(biāo),累計(jì)釋藥量M為縱坐標(biāo),按照固定的公式,使用Origin 2018擬合成零級(jí)釋放方程、一級(jí)釋放方程以及Higuchi方程。

    1.2.6 烯丙孕素緩釋微球的藥物穩(wěn)定性影響因素試驗(yàn)

    1.2.6.1 高溫試驗(yàn) 將烯丙孕素緩釋微球裝于棕色西林瓶中,開口放置于60℃下10 d,于第5天和第10天取樣,考察烯丙孕素緩釋微球性狀以及烯丙孕素含量的變化。

    1.2.6.2 高濕試驗(yàn) 將烯丙孕素緩釋微球裝于棕色西林瓶中,開口放置于25℃,相對(duì)濕度90%±5%的條件下10 d,于第5天和第10天取樣,考察烯丙孕素緩釋微球性狀以及烯丙孕素含量的變化,同時(shí)準(zhǔn)確稱取試驗(yàn)前后烯丙孕素緩釋微球的重量,計(jì)算烯丙孕素緩釋微球樣品的吸濕增重,以考察烯丙孕素緩釋微球的吸濕潮解性能。

    1.2.6.3 強(qiáng)光照射試驗(yàn) 將烯丙孕素緩釋微球裝于棕色西林瓶中,開口放置于照度為4500 lx±500 lx的光照裝置中10 d,于第5天和第10天取樣,考察烯丙孕素緩釋微球性狀以及烯丙孕素含量的變化。

    2 結(jié)果

    2.1 烯丙孕素標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

    由圖1可知,在3.125~100 μg/mL范圍內(nèi),烯丙孕素濃度與峰面積的線性回歸方程為y=28 067x+23 350,R2=0.999 7,線性關(guān)系良好,符合檢測(cè)要求。

    圖1 烯丙孕素標(biāo)準(zhǔn)曲線

    a.烯丙孕素;b.空白微球;c.空白微球表面;d.烯丙孕素緩釋微球;e.烯丙孕素緩釋微球表面

    2.2 烯丙孕素緩釋微球的制備工藝優(yōu)選

    正交試驗(yàn)結(jié)果表明,烯丙孕素緩釋微球的最佳制備工藝為A4B1C4D5E1,即攪拌速度1 000 r/min,吐溫-80含量0.2%,mPEG-PLA質(zhì)量濃度0.07 g/mL,油水體積比0.6,水相中明膠含量1.0%。根據(jù)正交試驗(yàn)得到的最佳制備條件制備3批烯丙孕素緩釋微球并測(cè)定它們的包封率和載藥量,最佳制備條件下,烯丙孕素緩釋微球的平均包封率為(95.64±0.23)%(n=3),平均載藥量為(9.83±0.61)%(n=3),mPEG-PLA對(duì)烯丙孕素的包埋效果達(dá)到最佳。

    2.3 微球的形態(tài)觀察及粒徑分析

    掃描電鏡結(jié)果顯示,烯丙孕素原藥呈晶體狀,空白微球與烯丙孕素緩釋微球呈球形,空白微球表面有裂紋,而烯丙孕素緩釋微球成球性較好,外觀圓整。與空白微球相比,烯丙孕素緩釋微球表面呈絨毛狀,可能為吸附于微球表面的藥物,且烯丙孕素緩釋微球表面具有許多微孔。

    烯丙孕素緩釋微球的粒徑分布圖如圖3所示,烯丙孕素緩釋微球的大小主要分布于20~180 μm范圍內(nèi),平均粒徑為82.3 μm。

    圖3 烯丙孕素緩釋微球的粒徑分布圖

    2.4 烯丙孕素緩釋微球的體外釋放及釋放曲線方程擬合

    由圖4可知,烯丙孕素緩釋微球能分別在含有1%吐溫-80 pH為1.2的鹽酸緩沖液、含有1%吐溫-80 pH為4.1的醋酸緩沖液以及含有1%吐溫-80 pH為6.8的磷酸鹽緩沖液中持續(xù)釋放4 h以上,4 h內(nèi)烯丙孕素緩釋微球在3種不同pH的釋放介質(zhì)中的累計(jì)釋藥量分別達(dá)82.37%、92.80%、96.10%。烯丙孕素緩釋微球在1 h內(nèi)釋藥較快,而1 h后,烯丙孕素緩釋微球的釋藥速度減慢,且在pH 1.2的鹽酸緩沖液中的釋放量低于另外兩種溶出介質(zhì)。

    圖4 不同釋放介質(zhì)下烯丙孕素緩釋微球的體外釋放曲線(n=3)

    烯丙孕素緩釋微球的體外釋放曲線方程擬合結(jié)果如表3所示,可以明顯看出,烯丙孕素緩釋微球在3種不同pH的溶出介質(zhì)中的溶出曲線更符合一級(jí)釋放模型,擬合效果最佳,而與零級(jí)釋放方程以及Higuchi方程的擬合效果較差。所以,烯丙孕素緩釋微球的釋放機(jī)理符合一級(jí)動(dòng)力學(xué)方程,具有一定的緩釋效果。

    表3 烯丙孕素緩釋微球體外釋放曲線方程擬合

    表4 烯丙孕素緩釋微球藥物穩(wěn)定性的影響因素

    2.5 烯丙孕素緩釋微球藥物穩(wěn)定性的影響因素

    由藥物穩(wěn)定性影響因素試驗(yàn)結(jié)果可知,高濕的條件對(duì)烯丙孕素緩釋微球的藥物穩(wěn)定性影響較小,烯丙孕素含量無明顯降低,且無吸濕結(jié)晶的現(xiàn)象出現(xiàn),而保存在高溫以及強(qiáng)光照射的條件下對(duì)烯丙孕素緩釋微球中烯丙孕素的含量有著明顯影響,在60℃的環(huán)境中儲(chǔ)存10 d后,烯丙孕素的含量減少3.00%,在照度4500 lx±500 lx的條件下儲(chǔ)存10 d后烯丙孕素的含量減少更為顯著,達(dá)到11.92%。因此,烯丙孕素緩釋微球需要在低溫陰暗的環(huán)境下儲(chǔ)存。

    3 討論

    在烯丙孕素緩釋微球的制備時(shí),mPEG-PLA的理化性質(zhì)如分子量、聚合物的比例等對(duì)微粒的粒徑、包封率及降解速率直接相關(guān),如低分子量的聚合物表現(xiàn)出較高的藥物釋放速率以及降解速率[12],因此在考慮mPEG-PLA性能及經(jīng)濟(jì)效益的同時(shí),本試驗(yàn)選取mPEG2000-PLLA10000進(jìn)行研究。在mPEG-PLA溶劑的選擇上,本試驗(yàn)考察了mPEG-PLA分別在乙醇、甲醇以及二氯甲烷中的溶解效果,結(jié)果表明,mPEG-PLA在二氯甲烷中的溶解效果最佳,且二氯甲烷具有強(qiáng)揮發(fā)性,可加快烯丙孕素緩釋微球的制備速度。

    本試驗(yàn)經(jīng)過工藝優(yōu)選制備得到的烯丙孕素緩釋微球包封率和載藥量高,優(yōu)于其他同為mPEG-PLA為載體制備的載藥微球[13],高包封率歸功于烯丙孕素的脂溶特性,因此烯丙孕素易于保留在微球的有機(jī)相內(nèi)。最佳制備條件下,微球的平均粒徑較小,但是粒徑跨距較大,這可能是殘留的明膠顆粒造成的,后續(xù)試驗(yàn)將進(jìn)一步優(yōu)化烯丙孕素緩釋微球的分離工藝以達(dá)到均勻粒徑的目的。

    長(zhǎng)效載藥微球在體內(nèi)的釋藥時(shí)間較長(zhǎng),因此需要進(jìn)行體外加速釋放試驗(yàn)對(duì)其釋藥特點(diǎn)進(jìn)行研究,從而快速評(píng)價(jià)載藥微球的釋藥方式,加快研發(fā)、生產(chǎn)進(jìn)程[13]。另外,根據(jù)《中華人民共和國(guó)獸藥典》規(guī)定,對(duì)于難溶性藥物,可在溶出介質(zhì)中添加適量的表面活性劑。經(jīng)過篩選,在溶出介質(zhì)中添加1%的吐溫-80既可以使烯丙孕素滿足在溶出介質(zhì)中的漏槽條件,而且能加快烯丙孕素緩釋微球的藥物釋放。在體外釋放試驗(yàn)中,烯丙孕素緩釋微球的釋放曲線符合一級(jí)釋放模型,具有緩釋效果,但烯丙孕素緩釋微球在初始階段釋藥速度較快,主要原因有以下兩點(diǎn):(1)藥物在微球中主要以吸附、鑲嵌和包埋的方式存在,微球表面吸附的藥物快速釋放是初始階段出現(xiàn)“突釋效應(yīng)”的主要原因,PU等[14]通過共聚焦顯微鏡觀察黃體酮微球中黃體酮的分布情況,發(fā)現(xiàn)黃體酮在微球表面分布十分密集,本試驗(yàn)中烯丙孕素緩釋微球和空白微球的電鏡結(jié)果也證明,烯丙孕素緩釋微球的表面吸附著大量的烯丙孕素原藥;(2)微球粒徑是影響藥物釋放的重要因素,球徑越小,釋放速度越快[15-16]。后續(xù)的研究應(yīng)進(jìn)一步改進(jìn)烯丙孕素緩釋微球的制備工藝,優(yōu)化烯丙孕素緩釋微球中藥物的存在形式,以降低突釋的影響。

    烯丙孕素一個(gè)重要的理化性質(zhì)是在光照條件下易發(fā)生化學(xué)結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)化,導(dǎo)致其活性喪失[17]。本研究使用mPEG-PLA對(duì)烯丙孕素進(jìn)行包埋,能減緩微球內(nèi)部的藥物光解的速度,增強(qiáng)藥物在光照條件下的穩(wěn)定性,但微球表面吸附有部分藥物,因此在光照穩(wěn)定性試驗(yàn)中主要是微球表面的烯丙孕素分解而導(dǎo)致藥物含量的下降。烯丙孕素緩釋微球在高溫條件下穩(wěn)定性一般,在高濕條件下穩(wěn)定性良好,因此烯丙孕素緩釋微球需要在低溫、避光的條件下儲(chǔ)存。

    Li Y等[18]進(jìn)行了國(guó)產(chǎn)與進(jìn)口兩種烯丙孕素口服溶液的藥代動(dòng)力學(xué)比較研究,結(jié)果顯示,兩種烯丙孕素口服溶液的消除半衰期分別為3.63 h±0.72 h和3.45 h±0.63 h,可見,現(xiàn)代養(yǎng)豬業(yè)常用的烯丙孕素制劑體內(nèi)半衰期短,消除速度快,而烯丙孕素緩釋微球研究不僅有助于解決烯丙孕素的這些缺點(diǎn),提高生物利用度,更為烯丙孕素長(zhǎng)效制劑的研發(fā)提供了理論依據(jù)。

    綜上所述,在最佳制備條件下烯丙孕素緩釋微球的包封率高,載藥量好,外觀圓整,粒徑較小。烯丙孕素緩釋微球具有緩釋效果,需要在避光、低溫條件下保存。

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