HPLC法同時(shí)測(cè)定板青敗毒口服液中(R-S)告依春、綠原酸、咖啡酸的含量

李有志，章安源, 張傳津， 陳 玲， 魏秀麗， 薄永恒，楊修鎮(zhèn)，惠慶亮，張淑二，田學(xué)磊，羅國棟， 牛華星*

(1.山東省獸藥質(zhì)量檢驗(yàn)所，山東省畜產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)測(cè)與風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，濟(jì)南 250022；2.山東省畜牧總站，濟(jì)南 250022；3.青島信諾邦生物科技有限公司，青島 266000，4.山東國利青生物技術(shù)有限公司，泰安 271000)

板青敗毒口服液由金銀花、板藍(lán)根、大青葉、蒲公英采用現(xiàn)代中藥制劑工藝制成口服液體制劑。金銀花、板藍(lán)根、蒲公英臨床試驗(yàn)表明有抗病毒活性的有效成分，增強(qiáng)機(jī)體免疫，可能與其含有(R-S)告依春、綠原酸、咖啡酸多個(gè)藥效成分產(chǎn)生的免疫增強(qiáng)綜合效應(yīng)有關(guān)[1-2]。這三種主要成分的含量高低也是評(píng)估板青敗毒口服液整體質(zhì)量的重要指標(biāo)，用HPLC法測(cè)定(R-S)告依春、綠原酸、和咖啡酸三個(gè)成分含量結(jié)果，能有效地控制制劑質(zhì)量，保證其臨床效果。目前研究尚未見同時(shí)測(cè)定板青敗毒口服液中多個(gè)有效成分含量的報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)精準(zhǔn)快速，能夠完善板青敗毒口服液的質(zhì)量控制方法，為提高制劑標(biāo)準(zhǔn)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試藥 儀器與設(shè)備 高效液相色譜儀Waters e2695 (配二極管陣列檢測(cè)器2998)；AE-240電子天平(瑞士Mettler Toledo 公司)；KQ - 250DB超聲儀(昆山市超聲儀有限公司)。

1.2 試藥與試劑 綠原酸(批號(hào)：Z0261702，含量98.3%)購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，(R-S)告依春(批號(hào)：1117530- 20130416，含量99.9%)，咖啡酸(批號(hào)：110885-201703，含量99.7%)均購自中國食品藥品檢定研究院；甲醇、乙腈(Merck公司, 色譜純)；磷酸(分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，水為娃哈哈飲用純凈水。供試品：板青敗毒口服液(青島信諾邦生物科技有限公司，批號(hào)：20200321,2020032101,2020032102，20200328,2020032801,2020032802，陰性對(duì)照供試品：由濰坊亞華藥業(yè)有限公司提供。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 色譜條件 色譜柱：Waters Symmetry C18柱(250 mm × 4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相A：乙腈；流動(dòng)相B：0.05%磷酸溶液[3]；流速：1 mL/min；進(jìn)樣量10 μL；柱溫為30 ℃。檢測(cè)波長(zhǎng)為245 nm，梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序

1.3.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取(R-S)告依春、綠原酸、咖啡酸對(duì)照品適量，加甲醇分別配制成濃度為1000 μg/mL的對(duì)照品溶液儲(chǔ)備液；精密量取(R-S)告依春對(duì)照品儲(chǔ)備液1 mL、綠原酸對(duì)照品儲(chǔ)備液5 mL、咖啡酸對(duì)照品2 mL至同一100 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，得濃度(R-S)告依春10 μg/mL、綠原酸50 μg/mL、和咖啡酸20 μg/mL的混合對(duì)照品溶液。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)工作液的制備 取適量1.3.2項(xiàng)下溶液，用初始流動(dòng)相稀釋，制備成系列濃度1、2.5、5、10、25、50、100、200、250、400、500 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)工作液，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.4 供試品溶液制備 精密量取樣品2 mL，置具塞錐形瓶中，精密加入50%乙醇25 mL，稱定重量，超聲處理(120 W,頻率40 KHz)30 min，超聲水浴溫度35 ℃，放冷后，用50%乙醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液5 mL，加50%乙醇定容至10 mL容量瓶中，0.22 μm微孔濾膜濾過，即得。

1.3.5 陰性對(duì)照溶液的制備 取處方中除金銀花、板藍(lán)根、蒲公英以外的其他藥材，照其制備工藝而成[4]，按1.3.4項(xiàng)下方法制備陰性對(duì)照溶液，即得。

1.3.6 測(cè)定法 分別精密吸取對(duì)照品溶液、供試品溶液及陰性對(duì)照溶液各10 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖與光譜圖測(cè)定，即得。

2 結(jié)果與分析

2.1 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)結(jié)果 為考察方法的專屬性，即判斷空白溶劑、制劑中各化學(xué)成分及輔料對(duì)(R-S)告依春、綠原酸、咖啡酸的測(cè)定是否存在干擾，照1.3.6方法，1.3.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄色譜圖與光譜圖。結(jié)果顯示，供試品與對(duì)照品出峰時(shí)間相一致。結(jié)果見圖1。且均達(dá)到基線分離；空白溶劑和陰性對(duì)照溶液色譜圖中，(R-S)告依春、綠原酸、咖啡酸出峰處均沒有干擾，表明其他成分對(duì)三者的測(cè)定均不會(huì)造成影響。

圖1 A 對(duì)照品混標(biāo)溶液 B 供試品溶液的色譜圖

2.2 方法學(xué)考察

2.2.1 線性關(guān)系考察 分別精密吸取1.3.3項(xiàng)下標(biāo)準(zhǔn)工作液10 μL，在1.3.1項(xiàng)色譜條件下注入儀器，分別以(R-S)告依春、綠原酸、咖啡酸峰面積為橫坐標(biāo)(X)，濃度(μg)為縱坐標(biāo)(Y)，得回歸方程分別為：Y(R-S)告依春= 0.0122X-0.1096，R2= 0.9991，Y綠原酸= 0.0028X-0.2311，R2= 0.9998； Y咖啡酸= 0.0167X+0.0014，R2= 0.9993。結(jié)果表明：(R-S)告依春在2.5～300 μg/mL、綠原酸、咖啡酸在5.0～400 μg/mL與其對(duì)應(yīng)的峰面積有良好的線性關(guān)系。

2.2.2 精密度試驗(yàn) 精密吸取對(duì)照品溶液10 μL注入色譜儀，連續(xù)進(jìn)樣6次。以峰面積計(jì)算，得出(R-S)告依春、綠原酸、咖啡酸峰面積RSD分別是2.2%、1.6%、1.8%。表明儀器精密度良好，符合檢測(cè)要求。

2.2.3 重復(fù)性試驗(yàn) 同批供試品，按1.3.4項(xiàng)下制備6份樣品溶液，分別注入液相色譜儀，計(jì)算R-S)告依春、綠原酸、咖啡酸峰的含量，RSD分別為1.4%、2.4%、1.9%。說明該方法重現(xiàn)性好，含量穩(wěn)定。

2.2.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取1.3.4項(xiàng)下同一供試品溶液(批號(hào)：20200321)，室溫下每隔4 h連測(cè)6次，進(jìn)樣體積10 μL，告依春、綠原酸、(R-S)咖啡酸峰面積RSD分別為0.7%、0.9%、0.9%，表明本制劑24 h內(nèi)成份較穩(wěn)定。

2.2.5 加樣回收率試驗(yàn) 分別精密量取已知含量板青敗毒口服液1 mL與濃度為600 μg/mL的綠原酸對(duì)照品溶液1 mL、120 μg/mL(R-S)告依春對(duì)照品溶液1 mL、200 μg/mL的咖啡酸對(duì)照品溶液1 mL，置具塞錐形瓶中，自“精密加入50%乙醇25 mL”起按1.3.4項(xiàng)下方法制備樣品溶液，平行6份，按1.3.1項(xiàng)下條件測(cè)定綠原酸、(R-S)告依春和咖啡酸含量?；厥章试?1.1～92.9%之間，變異系數(shù)在1.0%～1.5%之間，見表2～表4。表明該方法回收率較好，準(zhǔn)確度和精密度可以滿足檢測(cè)需求。

表2 板青敗毒口服液回收率試驗(yàn)(n=6)

2.2.6 檢出限和定量限 取“1.3.3”項(xiàng)下溶液，應(yīng)用本試驗(yàn)建立的檢測(cè)方法進(jìn)行測(cè)定，信噪比(S/N)≥3時(shí)的濃度為檢出限，信噪比(S/N)≥10時(shí)的濃度為定量限。結(jié)果顯示，綠原酸、咖啡酸的檢出限均為2.5 μg/mL，定量限是5.0 μg/mL，(R-S)告依春檢出限是1.0 μg/mL，定量限是2.5 μg/mL。

2.2.7 耐用性試驗(yàn)

2.2.7.1 色譜柱類型考察 取1.3.3項(xiàng)下供試品溶液，照1.3.1項(xiàng)下色譜條件，考察不同型號(hào)的普通C18色譜柱：Angilent ZORBAX SB-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm， 5 μm)、Waters Symmetry C18柱(250 mm × 4.6 mm，5 μm)、Agilent Eclipse XDB- C18柱(250 mm × 4.6 mm，5 μm)對(duì)三種成分保留時(shí)間，分離度、拖尾因子、理論塔板數(shù)的影響。結(jié)果見表3。三個(gè)成分峰的理論塔板數(shù)均大于9000，符合《中國獸藥典》2015年版二部板藍(lán)根、金銀花和蒲公英藥材含量測(cè)定項(xiàng)下對(duì)理論板數(shù)要求。故三種柱子均可用于該檢查，方法實(shí)用性及耐用性良好。

表3 色譜柱類型考察

2.2.7.2 柱溫、流速考察 調(diào)節(jié)柱溫分別為25 ℃、30 ℃、35 ℃。隨著柱溫升高，各峰保留時(shí)間和分離度影響不大。流速0.8 mL/min時(shí)，各峰出峰時(shí)間較一致，含量較一致(表4)。上述試驗(yàn)結(jié)果表明該方法耐用性良好。

2.3 樣品測(cè)定 精密量取供試品溶液6批，平行2份，按1.3.4項(xiàng)下方法制備供試品溶液，進(jìn)樣，測(cè)定，外標(biāo)法計(jì)算供試品中(R-S)告依春、綠原酸、咖啡酸的含量。結(jié)果見表4。

表4 樣品測(cè)定結(jié)果(n=6)(mg/mL)

3 討論與結(jié)論

3.1 指標(biāo)成分的選取 對(duì)多種藥效成分同時(shí)評(píng)價(jià)已成為中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究的方向。金銀花，板藍(lán)根是板青敗毒口服液的主藥成分?，F(xiàn)代藥理研究表明，酚酸類和黃酮在體內(nèi)均有抗菌、抗炎、抗病毒的作用[5-7]。金銀花的化學(xué)成分主要包括有機(jī)酸以及黃酮類等，綠原酸是金銀花的主要藥效成分，也是藥材及成方制劑主要質(zhì)控指標(biāo)之一[8-10]。蒲公英中酚酸類化合物含量豐富，尤其是咖啡酸和綠原酸含量較高，也是抗菌的主要成分[11]。板藍(lán)根成分復(fù)雜，且含有多種有效成分，現(xiàn)已廣泛用于抗病毒、抗感染類獸藥的生產(chǎn)與合成。其中(R-S)告依春(又名表告依春)是板藍(lán)根的主要抗病毒成分，且化學(xué)性狀穩(wěn)定，因此以(R-S)告依春含量作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，能較好反映板藍(lán)根藥材質(zhì)量的高低[12-13]。篩選以上三種成分作為質(zhì)量評(píng)價(jià)指標(biāo)，可評(píng)價(jià)板青敗毒口服液多種成分有效含量。

3.2 供試品提取方法的選擇 先后比較水[14]、70%乙醇[9]，75%乙醇[15]和50%乙醇[16]、50%甲醇[17]、甲醇[3]等不同提取溶劑、不同提取方法(超聲處理和加熱回流)、提取時(shí)間(20，30,40 min)進(jìn)行考察對(duì)三種成分提取率的影響?？紤]綠原酸為極性有機(jī)酸，不太穩(wěn)定，除極易溶于乙醇、水、甲醇和丙酮等溶劑外，高溫及長(zhǎng)時(shí)間加熱不利于綠原酸提取[14]，超聲水浴溫度控制在35 ℃，能夠避免綠原酸高溫時(shí)易氧化分解成咖啡酸，綠原酸提取較充分[18]。經(jīng)實(shí)驗(yàn)考察得出50%乙醇作為提取溶劑，綠原酸提取率較高。超聲30 min和加熱回流1 h提取率并無顯著差異。試驗(yàn)中使用超聲提取樣品簡(jiǎn)潔、快速，每次30 min，提取2次，即可確保三種成分有效提取。

3.3 流動(dòng)相的優(yōu)選 先后使用以下4種流動(dòng)相組合觀察對(duì)色譜峰的影響：乙腈-0.4%磷酸(8∶92)、乙腈-0.05%磷酸(8∶92)[3]、甲醇-水(23∶77)，甲醇-0.02磷酸[19]。因流動(dòng)相pH低于2.0，對(duì)色譜柱損害較大[3]，測(cè)試0.05%磷酸溶液pH為2.3左右，使用0.05%磷酸溶液為流動(dòng)相梯度洗脫后三種成分離度高，出峰時(shí)間快，峰形對(duì)稱，并無拖尾及其它雜質(zhì)峰的干擾，降低了流動(dòng)相中含酸性成分對(duì)色譜柱的損害。

3.4 波長(zhǎng)的選擇 試驗(yàn)中，在200～400 nm的波長(zhǎng)范圍內(nèi)掃描發(fā)現(xiàn)綠原酸、(R-S)告依春、咖啡酸特征吸收峰分別在324 nm、241、323 nm處。三種成分在245 nm波長(zhǎng)處仍有較為明顯的特征峰，分離度好，故最終將245 nm.設(shè)定為檢測(cè)波長(zhǎng)。

3.5 影響含量測(cè)定的因素 影響板青敗毒口服液中有效成分含量差異因素可能是原料藥材的質(zhì)量差異和投料真實(shí)性的差異，其次是生產(chǎn)工藝的差異[20]。數(shù)據(jù)顯示各地蒲公英藥材質(zhì)量均衡性差，全草蒲公英(跟、花莖、葉、花、果實(shí)較多)咖啡酸含量高于只有葉子的蒲公英[21]。增加本制劑多成分含量的測(cè)定可促使生產(chǎn)企業(yè)用質(zhì)量合格的原料藥材，嚴(yán)格按標(biāo)準(zhǔn)投料和生產(chǎn)。

3.6 結(jié)論 現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定有綠原酸、精氨酸等薄層鑒別，無咖啡酸的鑒別檢查[22]，方法專屬性不強(qiáng)、操作繁瑣，準(zhǔn)確度不高，穩(wěn)定性和重復(fù)性較差。成分單一難以表達(dá)中藥的質(zhì)量。實(shí)驗(yàn)三種成分同時(shí)定量質(zhì)控，處理簡(jiǎn)捷，方法可靠，重現(xiàn)性及回收率均符合要求，縮短了實(shí)驗(yàn)時(shí)間。流動(dòng)相系統(tǒng)摒棄磷酸鹽緩沖液，降低了色譜柱因磷酸鹽易堵造成柱壓高的風(fēng)險(xiǎn)。本方法可用于測(cè)定板青敗毒口服液中(R-S)告依春、綠原酸、咖啡酸的含量，同時(shí)也可以作為企業(yè)內(nèi)控標(biāo)準(zhǔn)方法，依據(jù)結(jié)果合理評(píng)價(jià)本劑型的質(zhì)量，保證療效的穩(wěn)定。可為近一步完善和提高板青敗毒口服液的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供依據(jù)，為畜產(chǎn)品質(zhì)量安全起到保駕護(hù)航的作用。