產(chǎn)L-谷氨酸工程菌株的誘變選育及其發(fā)酵效率

梁玲 黃欽耿 翁雪清 吳松剛 黃建忠

（福建師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 工業(yè)微生物教育部工程研究中心，福州 350117）

L-谷氨酸（L-glutamate，L-Glu）是生物體內(nèi)的重要營養(yǎng)物質(zhì)，參與動物、植物、微生物細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)代謝過程［1］。L-谷氨酸在食品行業(yè)中廣泛用作增鮮劑，另外在醫(yī)藥、人造制革、化妝品工業(yè)及農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上也具有廣泛的用途，是目前世界上產(chǎn)量最大的氨基酸［2-5］。L-谷氨酸最早是在1866年由德國化學(xué)家以小麥面筋水解而得［6］，近一個世紀(jì)之后，隨著谷氨酸生產(chǎn)菌的分離得到與研究改造，逐步過渡到采用發(fā)酵法進(jìn)行生產(chǎn)。隨著谷氨酸棒桿菌基因組信息注解及微生物育種技術(shù)的進(jìn)步，谷氨酸的發(fā)酵水平得到極大的提升。然而，從產(chǎn)酸水平和糖酸轉(zhuǎn)化率來看，我國谷氨酸發(fā)酵生產(chǎn)還落后于國際水平［7-9］。因此，選育L-谷氨酸高產(chǎn)菌株，進(jìn)一步提高產(chǎn)酸水平及轉(zhuǎn)化率，對谷氨酸清潔生產(chǎn)具有重要的意義。

常壓室溫等離子體（Atmospheric and room temperature plasma，ARTP）誘變系統(tǒng)能夠在常壓下產(chǎn)生25-40℃的具有高活性粒子濃度的等離子體射流，通過作用于微生物細(xì)胞造成有效的DNA多樣性損傷［10-11］，具有操作簡便、設(shè)備簡單、條件溫和、安全性高、誘變快速、產(chǎn)生突變的多樣性大等特點(diǎn)［12-13］，是新近發(fā)展起來的非常安全高效的誘變系統(tǒng)。在氨基酸菌株選育方面，都比較多的集中在ARTP的直接誘變，如楊立鵬等［14］采用ARTP方法選育到一株高產(chǎn)L-色氨酸的突變株TRP-YP-3-2，其L-色氨酸產(chǎn)量達(dá)到61.4 g/L，糖酸轉(zhuǎn)化率達(dá)到19.25%，分別較出發(fā)菌提高了15.41%和22.77%，而且遺傳穩(wěn)定，生長速率高。蔡友華等［15］利用ARTP誘變集合48孔板篩選，獲得突變株1905#，其能夠耐受更低的pH，搖瓶產(chǎn)酸較出發(fā)菌株提高99.6%，遺傳穩(wěn)定。另外，將細(xì)胞制備成原生質(zhì)體，去除了細(xì)胞壁的保護(hù)，使得細(xì)胞對誘變因素更為敏感，對原生質(zhì)體進(jìn)行ARTP誘變處理，操作簡便易行，可大大提高誘變的效果。如蔣順進(jìn)［16］以綠色產(chǎn)色鏈霉菌AVL4為研究對象，通過原生質(zhì)體ARTP誘變，篩選獲得變株S251，其50 L罐發(fā)酵阿維拉霉素水平最高達(dá)到4 500 μg/mL，較對照菌株AVL4提高27.4%。公維亮等［17］采用原生質(zhì)體ARTP誘變，結(jié)合雙親酶活的原生質(zhì)體融合方案，獲得GSM-4、GSM-5兩株那西肽效價提高15%以上的突變菌株，體現(xiàn)了非常好的選育效果。在谷氨酸高產(chǎn)菌株的選育方面，鮮有原生質(zhì)體ARTP誘變選育的報道。

本研究以經(jīng)過多次誘變及代謝改造的高產(chǎn)L-谷氨酸的谷氨酸棒桿菌工程菌（Corynebacterium glutamicum）GY1為研究對象，對該菌株的原生質(zhì)體形成和再生的條件進(jìn)行探索，并對原生質(zhì)體進(jìn)行ARTP誘變，全局誘變L-谷氨酸工程菌，獲取更多樣的細(xì)胞膜及基因損傷，最大限度的獲得突變菌株庫，以期獲得產(chǎn)酸及糖酸轉(zhuǎn)化率提高的突變株。誘變的主要的流程如圖1所示。

圖1 L-谷氨酸高產(chǎn)菌株原生質(zhì)體ARTP誘變選育流程

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 出發(fā)菌種 谷氨酸棒桿菌Corynebacterium glutamicumGY1（FluAr/ProAr/Glnr/odhA-/pckA-/dtsR1-/ltsA-/alaT-），由工業(yè)微生物教育部工程研究中心保存。

1.1.2 培養(yǎng)基 斜面培養(yǎng)基及固體平板培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖5.0，豆粕提取物18.0，酵母粉10.0，磷酸二氫鉀1.0，尿素3.0，丁二酸0.5，瓊脂粉20.0，生物素 10.0 μg/L，pH7.0，121℃滅菌 20 min。

種子培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖22.0，酵母粉 10.0，豆粕提取物20.0，硫酸鎂 0.4，尿素10.0，丁二酸 1.0，硫酸亞鐵 0.01，硫酸錳 0.01，甲硫氨酸0.5，生物素0.4 mg/L，維生素B10.2 mg/L，pH7.0，121℃滅菌20 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖80，豆?jié)?30，玉米漿干粉35，豆粕提取物10，糖蜜10，毛發(fā)水解物2.3，甜菜堿1.2，丁二酸3.75，尿素6.0，硫酸鎂1.6，磷酸二氫鉀12.5，蘇氨酸0.015，賴氨酸0.015，甲硫氨酸 0.05，天冬氨酸 0.12，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.8 mg/L，MnSO4·3H2O 0.8 mg/L，抗壞血酸 0.08 mg/L，對氨基苯甲酸 0.08 mg/L，生物素0.08 mg/L，維生素B10.03 mg/L，維生素 B122.5 μg/L，pH7.0，121℃滅菌20 min。

再生培養(yǎng)基：在固體平板培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加0.5 mol/L的蔗糖即為再生培養(yǎng)基。

1.1.3 主要藥品和試劑 SMM緩沖液：0.5 mol/L 蔗糖，0.02 mol/L MgC12·6H2O，0.02 mol/L 順丁烯二酸，pH7.0，121℃滅菌 20 min。

甘氨酸溶液：稱取1 g甘氨酸溶于10 mL水中，用0.22 μm的針頭式過濾器過濾除菌，-4℃保藏。

溶菌酶液：稱取0.2 g溶菌酶，溶于10 mL SMM緩沖液，即溶菌酶濃度為20 g/L，用0.22 μm的針頭式過濾器過濾除菌，-20℃保藏。

1.1.4 主要儀器設(shè)備 SBA-40D 型生物傳感分析儀由山東省科學(xué)院生物研究所制造；UV-2100型紫外可見分光光度計由尤尼柯（上海）儀器有限公司制造；梅特勒 pH計由瑞士梅特勒-托利多集團(tuán)制造；ARTP-IIS 型ARTP誘變儀由無錫源清天木生物科技有限公司制造。

1.2 方法

1.2.1 原生質(zhì)體的制備與再生 原生質(zhì)體制備：取一環(huán)保藏于-80℃冰箱的谷氨酸棒桿菌GY1，接種于3 mL的種子培養(yǎng)基中，30℃，220 r/min振蕩培養(yǎng)12 h，吸取1mL菌液至裝有30 mL種子培養(yǎng)基的250 mL三角瓶，添加1 mL 10%的甘氨酸，30℃，220 r/min振蕩培養(yǎng)12 h，培養(yǎng)結(jié)束后，將菌液6 000 r/min離心10 min，SMM高滲緩沖液洗滌離心兩次，棄去上清，得到制備原生質(zhì)體的出發(fā)菌。取一部分用高滲液適當(dāng)稀釋，吸取100 μL涂布于固體培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)至長出菌落，計算菌落數(shù)A。

以SMM溶液作為高滲液，在出發(fā)菌中加入溶菌酶液，使終濃度分別為2.5、5.0、7.5、10.0和12.5mg/mL，轉(zhuǎn)入直徑為6 cm的平皿，放置于恒溫振蕩器，30℃，60 r/min條件下分別酶解30、60、90、120和150 min，隨后2 500 r/min離心10 min，棄上清，用SMM溶液洗滌離心兩次，最后加入3 mL SMM溶液重懸細(xì)胞，得到原生質(zhì)體懸液。

原生質(zhì)體再生：原生質(zhì)體懸液用SMM溶液梯度稀釋后取100 μL涂布于再生培養(yǎng)基平板上，30℃培養(yǎng)2 d長出菌落，計算菌落數(shù)B。另外，將原生質(zhì)體用無菌水梯度稀釋后涂布于再生培養(yǎng)基平板，30℃培養(yǎng)2 d，計算長出的菌落數(shù)C。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果結(jié)合后續(xù)實(shí)驗(yàn)需求選擇合適的原生質(zhì)體制備與再生條件。原生質(zhì)體再生率=（B-C）/（A-C）×100%。

1.2.2 ARTP誘變 參照ARTP 誘變育種儀操作流程，將原生質(zhì)體懸液加入終濃度為5%的甘油作為保護(hù)劑，吸取10 μL原生質(zhì)體懸液均勻涂于載片，將載片轉(zhuǎn)入操作倉，以氦氣作為工作載氣，功率為110 W，通氣量為10 L/min，距離為2 mm，進(jìn)行誘變處理。處理時間設(shè)置為10、20、30、40、50、60、70和80 s，誘變結(jié)束后將載片轉(zhuǎn)入SMM高滲液中，30℃，60 r/min振蕩15 min，確保將原生質(zhì)體全部洗脫下來，然后稀釋涂布至再生培養(yǎng)基平板，30℃培養(yǎng)2 d至長出單菌落，進(jìn)行平板菌落計數(shù)，以處理0s的樣品為對照，計算致死率并繪制致死率曲線，選擇致死率約為85%-90% 的處理時間對原生質(zhì)體進(jìn)行誘變。

1.2.3 突變株的篩選 再生培養(yǎng)基平板培養(yǎng)2 d后長出單個菌落，挑選外觀形態(tài)與對照菌株（如菌落大小、形狀、色澤等）存在差異的的單菌落轉(zhuǎn)接至谷氨酸固體平板，30℃培養(yǎng)24 h，然后用96微孔板發(fā)酵進(jìn)行初篩，采用生物傳感分析儀測定谷氨酸含量，選擇產(chǎn)酸提高幅度較大的突變株進(jìn)行搖瓶復(fù)篩。從固體平板菌落接種至斜面，以原始出發(fā)菌株GY1為對照，30℃培養(yǎng)24 h后，按2%的接種量接種至種子培養(yǎng)基中，30℃，220 r/min培養(yǎng)24 h，再以10%的接種量轉(zhuǎn)至發(fā)酵搖瓶，30℃，220 r/min，振蕩培養(yǎng)24 h后溫度調(diào)至37℃，繼續(xù)發(fā)酵24 h后結(jié)束培養(yǎng)。分析發(fā)酵液中 L-谷氨酸含量、菌體生物量。L-谷氨酸含量采用生物傳感器分析儀測定。

1.2.4 50 L發(fā)酵罐補(bǔ)料分批發(fā)酵驗(yàn)證 采用三級發(fā)酵工藝，以搖瓶種作為一級種子接入二級種子罐，接種量為2%，再以20%的移種量從種子罐移種至發(fā)酵罐，發(fā)酵周期為36 h，控制發(fā)酵罐參數(shù)：罐壓0.05MPa，初始通氣量1∶1.5 vvm，培養(yǎng)24 h后提高至1∶1 vvm，發(fā)酵前期溫度為30℃，培養(yǎng)至OD562達(dá)到80后升溫至37℃誘導(dǎo)表達(dá)谷氨酸；初始攪拌300 r/min，初始葡萄糖濃度為100 g/L，初始PH7.0，發(fā)酵期間每隔 2 h 取樣檢測菌體生物量（OD562）、L-Glu含量及殘?zhí)?，根?jù)耗糖速率確定補(bǔ)料量，流加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20% 的氨水控制pH在6.9-7.1，通過控制攪拌和補(bǔ)料維持發(fā)酵過程溶氧（DO）在15%-35%，流加700 g /L葡萄糖溶液控制發(fā)酵過程中葡萄糖濃度在4.0-7.0 g/L，發(fā)酵結(jié)束前 2-4 h停止補(bǔ)料，當(dāng)殘?zhí)腔竞谋M時，發(fā)酵結(jié)束。

2 結(jié)果

2.1 最佳原生質(zhì)體制備與再生條件的選擇

2.1.1 不同溶菌酶濃度對原生質(zhì)體制備的影響 由圖2可知，在一定時間內(nèi)（本實(shí)驗(yàn)時間為90 min），隨著溶菌酶濃度的增加，谷氨酸棒桿菌GY1原生質(zhì)體生成率逐步提高，在酶濃度為12.5 mg/mL時達(dá)到最高，繼續(xù)提高溶菌酶的濃度，原生質(zhì)體數(shù)量略有下降。當(dāng)酶濃度比較低的時候，再生率隨著酶濃度增加而提高，當(dāng)溶菌酶濃度為10.0 mg/mL時，再生率達(dá)到峰值21.3%，繼續(xù)提高酶濃度，再生率急劇下降?？赡苁怯捎谶^高的酶濃度使細(xì)胞壁酶解過度，將細(xì)胞壁徹底降解，進(jìn)而對細(xì)胞膜造成損傷，不利于原生質(zhì)體再生。結(jié)合原生質(zhì)體制備量和再生率的綜合考慮，選取最佳的溶菌酶濃度為10.0 mg/mL。

2.1.2 溶菌酶作用不同時間對原生質(zhì)體制備的影響 在制備原生質(zhì)體的過程中，原生質(zhì)體的數(shù)量隨著酶解時間的延長逐步增加，在顯微鏡下觀察可見越來越多的棒狀細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)榍驙畹脑|(zhì)體，最終幾乎全部酶解成為球形原生質(zhì)體。由圖3可見，原生質(zhì)體的制備量隨著時間的延長而增加，但是當(dāng)酶解時間過長時，再生率顯著下跌?？赡茉蚴敲附馓L時間導(dǎo)致細(xì)胞壁全部去除，進(jìn)而損傷質(zhì)膜系統(tǒng)，使原生質(zhì)體質(zhì)量下降難以再生。綜合考慮原生質(zhì)體的制備率再生率，使用10 mg/mL的溶菌酶處理90min為最佳酶解時間。

圖2 酶濃度對原生質(zhì)體制備的影響

圖3 酶解時間對原生質(zhì)體制備的影響

2.2 ARTP處理時間的選擇

根據(jù)ARTP誘變不同的時長，再生后平板長出的菌落數(shù)，以未經(jīng)誘變的平板菌落數(shù)為對照，計算致死率，繪制致死率曲線（圖4）。由圖4可知，ARTP處理60 s時，GY1原生質(zhì)體已達(dá)到100%的致死率，處理20 s，致死率達(dá)到55.7%。鑒于出發(fā)菌株GY1本身經(jīng)歷了多次物理化學(xué)誘變，而且谷氨酸棒桿菌具備的限制修飾系統(tǒng)，在ARTP處理時間的選擇方面，一方面想通過ARTP處理強(qiáng)化菌株原生質(zhì)體損傷的 “程度”，獲得較多的DNA損傷，另一方面也盡可能保證有一定數(shù)量的再生菌落進(jìn)行篩選，增加獲取優(yōu)良變株的機(jī)率，選擇致死率為90%左右的處理時長，即處理40 s（致死率為89.6%）作為最佳的ARTP誘變時間。

2.3 突變株的篩選

原生質(zhì)體進(jìn)行ARTP誘變后，在長出單菌落的再生平板上，根據(jù)菌落的形態(tài)特征如菌落大小、光澤度或顏色，隨機(jī)挑取了760個單菌落進(jìn)行96微孔板初步篩選，篩選結(jié)果表明，有 136個菌株比出發(fā)菌株產(chǎn)酸提高，正變率為17.9%，選取其中 60 株產(chǎn)酸較出發(fā)菌株提高12%以上的菌株進(jìn)行搖瓶復(fù)篩，產(chǎn)酸結(jié)果見表1。由表1可見，有22株誘變菌株在搖瓶發(fā)酵中產(chǎn)酸比對照菌GY1高，最高的一株為YAG117，L-Glu含量達(dá)16.3 g/L，較GY1提高13.9%。

圖4 ARTP處理時間對GY1原生質(zhì)體致死率的影響

表1 誘變菌株搖瓶復(fù)篩谷氨酸產(chǎn)量

2.4 遺傳穩(wěn)定性分析

誘變株通常穩(wěn)定性較差，為驗(yàn)證該變株的穩(wěn)定性，將變株連續(xù)傳代5次，每次傳代進(jìn)行搖瓶發(fā)酵驗(yàn)證L-Glu產(chǎn)量，均設(shè)置3個平行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如表2。從菌株形態(tài)特征上看，變株YAG117在傳代過程中穩(wěn)定性良好，菌落形態(tài)及顯微形態(tài)都沒有變化，而且L-谷氨酸產(chǎn)量變化幅度在3%以內(nèi)，體現(xiàn)了較好的遺傳穩(wěn)定性。

表2 斜面?zhèn)鞔鷮ν蛔冎闥AG117谷氨酸含量的影響

2.5 50 L罐補(bǔ)料分批發(fā)酵

根據(jù)原有的發(fā)酵工藝，將變株YAG117與出發(fā)菌株GY1進(jìn)行50 L罐發(fā)酵對比驗(yàn)證，每隔2 h測定生物量，殘?zhí)羌癓-Glu含量，繪制發(fā)酵曲線，結(jié)果如圖5。結(jié)果顯示，變株YAG117與出發(fā)菌株GY1有相似的生長曲線，葡萄糖消耗速度趨于一致，細(xì)胞生長性能優(yōu)于對照菌株，菌體密度從發(fā)酵之初就比對照菌株生長迅猛并維持在較高水平，展現(xiàn)了很好的環(huán)境適應(yīng)性和生長特性。從L-谷氨酸產(chǎn)量上看，L-谷氨酸積累在發(fā)酵初期就高于對照菌株，并且產(chǎn)酸勢頭強(qiáng)勁，隨著菌體密度對數(shù)生長迅速積累，在菌體生長進(jìn)入穩(wěn)定期后，產(chǎn)酸保持增速。發(fā)酵30 h以后，產(chǎn)酸增加速度下降，在發(fā)酵36 h時產(chǎn)酸達(dá)到216.6 g/L，較出發(fā)菌株GY1（發(fā)酵36 h產(chǎn)酸191.9g/L）提高了12.9%，糖酸轉(zhuǎn)化率比出發(fā)菌株提高了10.2%。整個發(fā)酵周期誘變菌株YAG117產(chǎn)酸均比對照菌株GY1高，發(fā)酵過程穩(wěn)定，糖酸轉(zhuǎn)化率達(dá)到68.87%，展現(xiàn)了非常好的工業(yè)應(yīng)用前景。

圖5 菌株YAG117/GY1分批補(bǔ)料發(fā)酵代謝曲線

3 討論

谷氨酸棒桿菌GY1是一株工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)的L-谷氨酸的工業(yè)菌株，期間經(jīng)歷多代的傳統(tǒng)誘變及代謝改造，在多次的誘變修飾過程中往往積累了較多的細(xì)胞結(jié)構(gòu)及生理上的不利突變，致使細(xì)胞出現(xiàn)一定的“死胡同”效應(yīng)，而且谷氨酸棒桿菌作為一類革蘭氏陽性菌株，其細(xì)胞壁較厚，細(xì)胞修復(fù)機(jī)制復(fù)雜，使得進(jìn)一步通過普通誘變的方式對菌株改良變得非常困難。ARTP作為一種新近發(fā)展起來的全局誘變工具，其較普通的紫外及化學(xué)誘變方式來說具有更高的突變率、更多樣的DNA損傷和蛋白突變類型，而且沒有方向性和偏好性［11］。通過去除細(xì)胞壁，制備原生質(zhì)體，結(jié)合ARTP這種不常見的誘變體系對于經(jīng)歷多次誘變的工業(yè)菌株更加有利于形成L-谷氨酸生物合成相關(guān)代謝網(wǎng)絡(luò)的全局變化，最終形成遺傳穩(wěn)定的突變株。

制備數(shù)量多，質(zhì)量優(yōu)的原生質(zhì)體是進(jìn)行原生質(zhì)體ARTP誘變的前提，酶法破壁制備原生質(zhì)體的過程中，酶濃度、酶解時間對原生質(zhì)體的制備率及再生率影響顯著。酶濃度太低，細(xì)胞壁不能被有效去除，不能形成原生質(zhì)體；酶濃度太高，則可能會損傷細(xì)胞膜，造成細(xì)胞存活率不高。酶解時間的影響與酶濃度相似，時間不足時細(xì)胞壁尚未去除，原生質(zhì)體數(shù)量少，而時間太長，細(xì)胞膜可能會受到損傷，影響細(xì)胞再生［17］。另外，出發(fā)菌的活力也對原生質(zhì)體的形成與再生影響顯著，對數(shù)生長期的細(xì)胞代謝活躍、一致性好，收集此時期菌體制備原生質(zhì)體可得到較好的制備效果，不僅如此，在培養(yǎng)細(xì)胞的過程中添加適量的甘氨酸或氨芐青霉素能使細(xì)胞壁的合成受阻，造成細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)疏松，有利于酶解破壁［18］。本研究通過優(yōu)化原生質(zhì)體制備條件、選取最佳的ARTP處理時間，既保證一定數(shù)量的細(xì)胞個體，又能夠兼容足夠的誘變豐富性。從760個突變株中獲得136株正突變株，正變率達(dá)到17.9%，相對較低的正變率也再次體現(xiàn)了工業(yè)菌株對誘變體系的“疲勞”作用，最終通過96孔板的初篩和搖瓶復(fù)篩獲得L-谷氨酸發(fā)酵水平顯著提高的變株YAG117，L-Glu含量達(dá)16.3 g/L，較GY1提高13.9%，50 L罐分批發(fā)酵36 h，L-谷氨酸產(chǎn)量達(dá)到216.6 g/L，比出發(fā)菌株提高了12.9%，較戶紅通等［19］通過優(yōu)化清潔發(fā)酵工藝的谷氨酸產(chǎn)量提高了12.5%，也是目前文獻(xiàn)報道最高水平，這充分體現(xiàn)了原生質(zhì)體ARTP誘變在工程菌株改良中的良好效果。值得注意的是，優(yōu)良變株從傳代菌株整體的產(chǎn)酸水平來看，連續(xù)傳代3次L-谷氨酸的產(chǎn)量基本不變，但到第4代時（F4），L-谷氨酸產(chǎn)量下降幅度加大，所以，在進(jìn)行生產(chǎn)實(shí)踐或是發(fā)酵中試時，為取得較好的產(chǎn)酸水平，建議一次菌株的斜面?zhèn)鞔螖?shù)不超過3代，以F2代斜面菌株進(jìn)行進(jìn)一步的發(fā)酵最佳。

原生質(zhì)體的ARTP誘變作為傳統(tǒng)誘變育種的補(bǔ)充，能夠有效的進(jìn)行包括細(xì)胞膜在內(nèi)的細(xì)胞全方位損傷，有利于獲取全局?jǐn)_動的突變株，從而實(shí)現(xiàn)選育目標(biāo)，但其還是無法在機(jī)制及機(jī)理上解釋突變株的代謝變化，接下來，可以借助組學(xué)的分析方法，全面比較出發(fā)菌株及突變株的組學(xué)數(shù)據(jù)，增進(jìn)對突變株L-谷氨酸全局代謝的認(rèn)知，有利于尋找新的L-谷氨酸生物合成擾動點(diǎn)，為L-谷氨酸工程菌的構(gòu)建提供新的理論支持。

4 結(jié)論

以高產(chǎn)L-谷氨酸的谷氨酸棒桿菌GY1為出發(fā)菌株，采用10.0 mg/mL的溶菌酶酶解90 min制備原生質(zhì)體，隨后在綜合考慮致死率及菌落數(shù)的條件下，利用ARTP處理40 s。突變株經(jīng)96微孔板初篩及搖瓶復(fù)篩，最終獲得L-谷氨酸產(chǎn)量明顯提高的的優(yōu)良突變株YAG117，搖瓶產(chǎn)酸為16.3 g/L，較出發(fā)菌株GY1提高13.9%，同時，進(jìn)行50 L罐的補(bǔ)料分批發(fā)酵驗(yàn)證，其L-谷氨酸產(chǎn)量達(dá)到216.6 g/L，糖酸轉(zhuǎn)化率達(dá)到68.87%，較出發(fā)菌株GY1分別提高12.9%和10.2%。