香菇Y(jié)J-01原生質(zhì)體制備與再生條件的優(yōu)化

劉 璐 高 原 杜雙田田夢媛 耿 緣

（西北農(nóng)林科技大學生命科學學院，陜西楊凌712100）

我國是香菇生產(chǎn)消費大國，栽培規(guī)模居世界前列，但育種研究滯后。曾采用引種、馴化及雜交方法選育得到并推廣的“武香一號”、冬菇L26、慶科20、Cr系列、“申香8號”等仍難以滿足市場對香菇質(zhì)量與產(chǎn)量的需求，香菇育種與種質(zhì)改良工作迫在眉睫[1-3]。原生質(zhì)體育種可有效縮短育種周期，目前由原生質(zhì)體育種得到并推廣示范栽培的新品種還未見報道，外加香菇菌絲在原生質(zhì)體制備過程中會出現(xiàn)原生質(zhì)體單核化現(xiàn)象[4-5]，結(jié)合誘變育種、原生質(zhì)體融合育種可針對性的改良種質(zhì)[6-7]，顯著提高香菇的產(chǎn)量、品質(zhì)與抗病性[8-17]。原生質(zhì)體的制備與再生是原生質(zhì)體育種的基礎(chǔ)，研究采用通用旋轉(zhuǎn)設(shè)計對香菇原生質(zhì)體制備的工藝及再生條件進行優(yōu)化，期望為香菇原生質(zhì)體育種工作提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料①香菇菌株：香菇（Lentinus edodes）菌株，編號YJ-01，由西北農(nóng)林科技大學生命科學學院提供。②母種培養(yǎng)基（g/L）：木屑150.0（煎汁過濾），馬鈴薯 200.0，葡萄糖 10.0，蔗糖 10.0，蛋白胨 2.0，KH2PO41.0，MgSO40.5，瓊脂粉12.0，H2O 1000.0 mL，（pH5.5）。再生培養(yǎng)基：母種培養(yǎng)基用相應(yīng)穩(wěn)滲劑定容。③穩(wěn)滲劑分別為0.4 mol/L的NaCl、MgSO4、KCl、甘露醇，葡萄糖和蔗糖溶液（pH5.0）。

主要試劑：酶液用對應(yīng)穩(wěn)滲劑配制酶濃度（W/V）1.0%的蝸牛酶，纖維素酶與混合酶（蝸牛酶∶纖維素酶=1∶1），0.22 μm 微孔濾膜過濾除菌，現(xiàn)配現(xiàn)用。Cellulase（MP Biomedical）及 Snailase（Wolsen）等 為國產(chǎn)分析純。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌絲體培養(yǎng) 菌株活化及擴大培養(yǎng)參考文獻[18]。

1.2.2 原生質(zhì)體制備與純化 原生質(zhì)體制備與純化方法參考文獻[19]。

1.2.3 原生質(zhì)體計數(shù) 得到的原生質(zhì)體用穩(wěn)滲劑重懸后，血球計數(shù)板計數(shù)，稀釋至108涂布平板。

原生質(zhì)體產(chǎn)量（個/mL）=每小格平均原生質(zhì)體數(shù)×400×稀釋倍數(shù)×104

1.2.4 原生質(zhì)體再生 原生質(zhì)體再生參考文獻[20]。

原生質(zhì)體再生率（%）=[（再生平板菌落數(shù)-CK板菌落數(shù)）×稀釋倍數(shù)]/（涂布體積×原生質(zhì)體濃度）×100

1.2.5 試驗設(shè)計 對原生質(zhì)體產(chǎn)量與再生率從以下7個因素進行研究，試驗水平見表1。

表1 單因素試驗水平

1.2.6 原生質(zhì)體制備與再生條件優(yōu)化 根據(jù)單因素試驗結(jié)果，以原生質(zhì)體產(chǎn)量與再生率為指標，按通用旋轉(zhuǎn)設(shè)計安排試驗。

1.3 數(shù)據(jù)分析統(tǒng)計分析采用DPS（Version 7.05），作圖采用Orign 9.0。

2 結(jié)果與分析

2.1各單因素對YJ-01原生質(zhì)體產(chǎn)量與再生率的影響

2.1.1 不同酶種類對YJ-01原生質(zhì)體產(chǎn)量與再生率的影響 圖1顯示，混合酶的酶解效果優(yōu)于單一酶。用混合酶酶解時，原生質(zhì)體產(chǎn)量（5.69×108個/mL）是纖維素酶的4.15倍，蝸牛酶的1.42倍；用混合酶酶解時原生質(zhì)體再生率（0.91%）僅次于蝸牛酶（0.90%），是纖維素酶的2.39倍。這是因為香菇菌絲細胞壁成分復(fù)雜，單一酶不能較好降解細胞壁從而獲得大量的原生質(zhì)體。而蝸牛酶是含有果膠酶、淀粉酶、蛋白酶等20多種酶的復(fù)合酶，而纖維素酶主要由內(nèi)切或外切β-葡聚糖酶等組成，因此蝸牛酶酶解細胞壁的效果顯著優(yōu)于纖維素酶，但仍不及混合酶的酶解效果。故在后續(xù)的多因素試驗中采用混合酶酶系。

圖1 不同酶種類對YJ-01原生質(zhì)體產(chǎn)量與再生率的影響

2.1.2 酶解溫度對YJ-01原生質(zhì)體產(chǎn)量與再生率的影響 圖2顯示，酶解溫度對原生質(zhì)體的產(chǎn)量及其再生率的影響顯著。隨著酶解溫度的升高，原生質(zhì)體產(chǎn)量迅速增加，在酶解溫度為30℃左右時原生質(zhì)體產(chǎn)量達到最大值，此后隨著酶解溫度的進一步升高，原生質(zhì)體產(chǎn)量急劇下降。從酶解溫度在30℃左右時，原生質(zhì)體的再生率也達到最大值。由回歸方程計算得，29℃酶解，原生質(zhì)體產(chǎn)量最高（4.06×108個/mL）；30℃酶解，原生質(zhì)體再生率最高（1.08%）。這是由于酶解溫度影響了酶活，進而影響了原生質(zhì)體產(chǎn)量與再生率。蝸牛酶的最適溫度為30～37℃，纖維素酶的最適溫度在35℃，在適宜溫度下酶活高，細胞壁分解速率快。雖然在35℃左右，混合酶能保持較高的活性，但過高的溫度會打亂香菇菌絲細胞內(nèi)部代謝，破壞細胞膜的穩(wěn)定性，進而導致原生質(zhì)體細胞壁再生困難，所以溫度高于30℃時，原生質(zhì)體產(chǎn)量與再生率圖線均呈現(xiàn)下降的趨勢。

2.1.3 酶解時間對原生質(zhì)體產(chǎn)量與再生率的影響由圖3知，酶解時間小于3 h，有利于提高原生質(zhì)體產(chǎn)量與再生率；酶解時間大于3 h時，原生質(zhì)體產(chǎn)量與再生率均下降。從2 h開始，原生質(zhì)體產(chǎn)量隨酶解時間延長急劇增加，2.5 h之后便緩慢下降。原生質(zhì)體再生率在2～4.5 h先增加再減小。經(jīng)回歸方程計算得，酶解時間3.44 h，原生質(zhì)體產(chǎn)量最高（2.27×108個/mL）；酶解時間2.82 h，原生質(zhì)體再生率最高（1.70%）。

2.1.4 pH對原生質(zhì)體產(chǎn)量與再生率的影響 在圖4中，當3≤pH≤4時，原生質(zhì)體產(chǎn)量基本保持不變，再生率為0；4≤pH≤5時，原生質(zhì)體產(chǎn)量與再生率均急劇增加；5≤pH≤7時，原生質(zhì)體產(chǎn)量與再生率逐步減小。經(jīng)回歸方程計算，在pH5.10時原生質(zhì)體產(chǎn)量最高（2.34×108個/mL），pH5.69時原生質(zhì)體再生率最高（1.86%）。

圖2 酶解溫度對YJ-01原生質(zhì)體產(chǎn)量與再生率的影響

圖3 酶解時間對YJ-01原生質(zhì)體產(chǎn)量與再生率的影響

圖4 pH對YJ-01原生質(zhì)體產(chǎn)量與再生率的影響

圖5 菌齡對YJ-01原生質(zhì)體產(chǎn)量與再生率的影響

由于pH≤5.0時，再生培養(yǎng)基凝固狀態(tài)差，無法倒置培養(yǎng)，也無法挑取再生菌落進行下一步試驗，故根據(jù)回歸曲線確定原生質(zhì)體制備過程中穩(wěn)滲劑pH5.0，原生質(zhì)體再生過程中再生培養(yǎng)基的pH5.5。

2.1.5 菌齡對原生質(zhì)體產(chǎn)量與再生率的影響 圖5顯示，當菌齡小于4 d時，原生質(zhì)體產(chǎn)量隨菌齡延長而增加；菌齡大于4 d時，原生質(zhì)體產(chǎn)量逐漸降低。當菌齡小于6 d時，原生質(zhì)體再生率隨菌齡延長而增加，當菌齡大于6 d時，原生質(zhì)體再生率急劇下降。6日齡菌絲與7日齡菌絲的原生質(zhì)體產(chǎn)量相近，再生率相差大。經(jīng)回歸方程計算可知，菌齡4.1 d時原生質(zhì)體產(chǎn)量最高（2.01×108個/mL），菌齡5.4 d時原生質(zhì)體再生率最高（2.07%）。

2.1.6 不同穩(wěn)滲劑對原生質(zhì)體制備產(chǎn)量與再生率的影響 由圖6可知，以甘露醇作為穩(wěn)滲劑，原生質(zhì)體產(chǎn)量最高但再生率低；以MgSO4做為穩(wěn)滲劑，原生質(zhì)體產(chǎn)量（2.74×108個/mL），僅次于甘露醇和葡萄糖，再生率分別為1.73%（MgSO4）和1.60%（葡萄糖），僅次于以蔗糖為穩(wěn)滲劑的再生平板（1.94%）。這是因為在制備原生質(zhì)體時，以MgSO4作為穩(wěn)滲劑，不僅可以維持細胞膜內(nèi)外的滲透壓平衡，同時Mg2+可以與羧基及磷脂質(zhì)交聯(lián)，穩(wěn)定細胞膜。然而在原生質(zhì)體再生的過程中，Mg2+等無機鹽離子不足以為細胞提供再生細胞壁所需的能量，同時單糖無法滿足細胞壁再生的物質(zhì)需求。故以最大原生質(zhì)體再生率為目標，確定以MgSO4做制備穩(wěn)滲劑，以蔗糖做再生穩(wěn)滲劑。

圖6 穩(wěn)滲劑種類對YJ-01原生質(zhì)體產(chǎn)量與再生率的影響

2.1.7 穩(wěn)滲劑濃度對原生質(zhì)體產(chǎn)量與再生率的影響 由圖7可知，適當濃度的穩(wěn)滲劑有利于提高原生質(zhì)體產(chǎn)量與再生率。以純水為穩(wěn)滲劑作為對照組，此時原生質(zhì)體產(chǎn)量低（4.2×107個/mL），再生率為0。隨穩(wěn)滲劑濃度逐漸提高，原生質(zhì)體產(chǎn)量與再生率均呈現(xiàn)先增加再減小的趨勢。試驗結(jié)果顯示，低濃度穩(wěn)滲劑（0～0.2 mol/L）對原生質(zhì)體再生率有顯著提高作用，0.2～0.8 mol/L對再生率影響不顯著，再生率在緩慢升高至1.88%后（對應(yīng)穩(wěn)滲劑濃度0.6mol/L）便呈緩慢下降趨勢。由回歸方程計算得，穩(wěn)滲劑濃度0.51 mol/L時原生質(zhì)體產(chǎn)量有最大值（1.85×108個/mL），穩(wěn)滲劑濃度0.34 mol/L時，原生質(zhì)體再生率有最大值（1.97%）。

2.2 原生質(zhì)體制備及再生條件優(yōu)化

2.2.1 多因素試驗方案確立 為了優(yōu)化原生質(zhì)體的制備條件與再生條件，根據(jù)2.1中結(jié)果以原生質(zhì)體產(chǎn)量和再生率為指標，兼顧下一步試驗的實施性，最終確定以混合酶（纖維素酶∶蝸牛酶體積比1∶1）作為酶系，選擇pH5.0的MgSO4為原生質(zhì)體制備穩(wěn)滲劑，pH5.5的蔗糖作為原生質(zhì)體再生穩(wěn)滲劑。對另外4個因素酶解時間（X1），酶解溫度（X2），菌齡（X3）和穩(wěn)滲劑濃度（X4）按四因素二次通用旋轉(zhuǎn)設(shè)計（1/2實施）安排試驗，試驗因素及水平編碼見表2。

2.2.2 原生質(zhì)體制備數(shù)學模型的建立與檢驗 依據(jù)表2實施試驗，結(jié)果見表3，方差分析見表4。經(jīng)計算得原生質(zhì)體產(chǎn)量（Y）與各因素（Xi）水平的函數(shù)關(guān)系：

表2 試驗因素及水平編碼表

表3 原生質(zhì)體產(chǎn)量試驗結(jié)果

表4 原生質(zhì)體產(chǎn)量方差分析表

由表4知：對回歸方程（1）進行失擬性檢驗，F(xiàn)失擬=4.62670＜F0.05（5，3）=9.013，可知不失擬。F回歸=5.76012＞F0.05（11，8）=3.313，P=0.0047＜0.05，模型符合客觀實際。且，達極顯著水平，X2、達顯著水平。剔除方程（1）在α=0.10條件下不顯著項后得：

2.2.3 單因素對原生質(zhì)體產(chǎn)量的影響

對方程（1）降維得：

圖7 穩(wěn)滲劑濃度對YJ-01原生質(zhì)體產(chǎn)量與再生率的影響

由方程（3）-（6）得圖8。

由方程（1）知，各因素在試驗范圍內(nèi)對YJ-01原生質(zhì)體產(chǎn)量影響作用大小依次為：X2＞X1＞X3＞X4。由圖8曲線知，隨酶解時間，酶解溫度，穩(wěn)滲劑濃度以及菌齡的增加，原生質(zhì)體產(chǎn)量呈現(xiàn)先增加再減小的趨勢，各供試因素在試驗范圍內(nèi)均有最大值。

對方程（3）-（6）求極值得：

經(jīng)計算得：

X1max=0.27；X2max=-0.85；X3max=0.075；X4max=0.01

經(jīng)轉(zhuǎn)化公式計算得原生質(zhì)體制備條件：酶解時間（x1）=3.2 h，酶解溫度（x2）=27.9℃，菌齡（x3）=5.1 d，MgSO4穩(wěn)滲劑（x4）=0.5mol/L。即：在pH=5.0，以0.5mol/L MgSO4做穩(wěn)滲劑，對5日齡菌絲在28℃酶解3 h，最適原生質(zhì)體制備（原生質(zhì)體產(chǎn)量2.72×108個/mL）。

圖8 各編碼水平對香菇原生質(zhì)體產(chǎn)量的影響

2.2.4 原生質(zhì)體再生數(shù)學模型建立與檢驗 試驗結(jié)果見表5，方差分析見表6。

經(jīng)計算得YJ-01原生質(zhì)體再生率與各試驗因素的回歸方程為：

由方程（7）知，各因素對原生質(zhì)體再生率的影響效果依次為：X4＞X1＞X3＞X2。對結(jié)果進行方差分析，見表6：

依表6對回歸方程（7）進行失擬性檢驗與擬合分析，F(xiàn)失擬=3.65295＜F0.05（5，3）=9.013，不失擬。F回歸=6.03451＞F0.0（511，8）=3.313，P=0.0039＜0.05，模型符合客觀實際。且，X1、X3、X4、、、X1X3與 X1X4達到顯著水平。剔除方程（7）在α=0.10條件下不顯著項后得：

表5 原生質(zhì)體再生率試驗結(jié)果

表6 原生質(zhì)體再生率方差分析表

由方程（9）-（12）得圖9。

對方程（9）-（12）求極值得：

解得：

圖9 各編碼水平對香菇原生質(zhì)體再生率的影響

X1max=-0.35；X2max=-0.37；X3max=1.94；X4max=-0.56

經(jīng)轉(zhuǎn)化公式計算得：x1=2.8 h，x2=29.1℃，x3=7.3 d，x4=0.43 mol/L。即：當無交互作用時，以0.45 mol/L蔗糖做再生平板的穩(wěn)滲劑，對7日齡菌絲在29℃酶解3 h，最適原生質(zhì)體再生（再生率1.36%）。

2.2.6 交互作用對原生質(zhì)體再生的影響

2.2.6.1 X1（酶解時間）與X3（菌齡）對香菇原生質(zhì)體再生率的影響

由表6可見，在0.1顯著水平上，X1X3與X1X4兩個交互項滿足條件。故，X1和X3、X1和X4均存在顯著的交互作用。

令X2=0，X4=0，將方程（7）降維后得：

由方程（13）得圖10。

由圖10可知，Y（原生質(zhì)體的再生率）在供試范圍內(nèi)有最大值，當X1一定時，Y隨X3增加呈先增加再減小的趨勢；當X3一定時，Y均隨X1增加呈先增加再減小的趨勢。

2.2.6.2 X1（酶解時間）與X4（穩(wěn)滲劑濃度）對香菇原生質(zhì)體再生率的影響

令X2=0，X3=0，方程（7）降維得：

由方程（14）得圖11。由圖11可知，Y（原生質(zhì)體的再生率）在供試范圍內(nèi)有最大值，當X1一定時，Y隨X4增加呈先增加再減小的趨勢；當X4一定時，Y均隨X1增加呈先增加再減小的趨勢。

圖10 X1與X3的交互作用對YJ-01原生質(zhì)體再生的影響

圖11 X1與X4的交互作用對YJ-01原生質(zhì)體再生的影響

2.2.6.3 模型優(yōu)化 對方程（7）求極值。

對其各變量求一階偏導并另其為零，求得模型的極值點：

解方程組得：

X1=-0.24；X2=-0.90；X3=1.23；X4=-0.38

帶入轉(zhuǎn)化公式計算得：x1=2.9 h，x2=27.8℃，x3=6.5 d，x4=0.5 mol/L。即：以0.5 mol/L蔗糖做穩(wěn)滲劑，對6.5日齡菌絲在27.8℃酶解2.9 h，原生質(zhì)體有最大再生率（1.39%）。

2.2.6.4 驗證試驗 在以優(yōu)化得到的最優(yōu)再生條件下，進行驗證試驗，測得原生質(zhì)體產(chǎn)量分別為2.32×108個/mL，1.79×108個/mL，1.54×108個/mL。原生質(zhì)體再生率再生率分別為1.48%，1.06%，1.88%。與理論值相近，基本符合預(yù)測值。證明該條件具有科學性與穩(wěn)定性。

3 小結(jié)與討論

通過以上分析可得如下結(jié)論：

（1）供試4種因素在一定范圍內(nèi)，均可顯著提高YJ-01原生質(zhì)體產(chǎn)量與再生率。YJ-01原生質(zhì)體最優(yōu)制備條件為：在pH為5.0條件下，以0.5 mol/L MgSO4做穩(wěn)滲劑，對5日齡菌絲在28℃酶解3 h。最優(yōu)再生條件為：在pH為5.5條件下，以0.5 mol/L蔗糖做穩(wěn)滲劑，對6.5日齡菌絲在27.8℃酶解2.9 h。

（2）原生質(zhì)體產(chǎn)量由酶活與酶解反應(yīng)時間決定，各因素對原生質(zhì)體產(chǎn)量的影響作用依次為：酶解溫度＞酶解時間＞菌齡＞穩(wěn)滲劑濃度。酶解溫度和酶解液pH通過影響酶活來影響原生質(zhì)體產(chǎn)量。在pH4.5～6.0范圍內(nèi)，纖維素酶最適溫度為45～55℃，蝸牛酶最適溫度為30～37℃，酶活越高，酶促反應(yīng)越快，相同時間內(nèi)的原生質(zhì)體產(chǎn)量越高。穩(wěn)滲劑濃度是通過影響細胞內(nèi)外滲透平衡而影響原生質(zhì)體的產(chǎn)量，當穩(wěn)滲劑濃度過低時，原生質(zhì)體吸水膨脹甚至脹破；當穩(wěn)滲劑濃度過高時，原生質(zhì)體失水皺縮。酶種類和酶解時間通過控制酶解反應(yīng)來影響原生質(zhì)體產(chǎn)量，混合酶可針對不同底物進行反應(yīng)，因而酶解效果優(yōu)于單一酶，相同酶解時間內(nèi)產(chǎn)生原生質(zhì)體數(shù)量多于單一酶。

（3）原生質(zhì)體再生率由原生質(zhì)體活性決定，各因素對原生質(zhì)體再生率的影響作用依次為：穩(wěn)滲劑濃度＞酶解時間＞菌齡＞酶解溫度。原生質(zhì)體再生過程中，當穩(wěn)滲劑濃度過低或過高會導致原生質(zhì)體嚴重吸水膨脹或皺縮，此時原生質(zhì)體活性降低，細胞壁再生性能降低，再生率也隨之降低。在酶的最適反應(yīng)條件范圍內(nèi)，酶解反應(yīng)較快，混合酶系可針對不同底物進行酶解，酶解時間越長，原生質(zhì)體暴露在酶液中的時間越久，原生質(zhì)膜損傷也相對變大，原生質(zhì)體再生細胞壁的性能減弱，再生率降低。加上香菇菌絲與原生質(zhì)體最適生長溫度為（25±1）℃，過高的酶解溫度雖然會提高酶促反應(yīng)速率，但會降低原生質(zhì)體活性，進而降低影響原生質(zhì)體再生率。原生質(zhì)體再生率與菌齡有關(guān)可能是因為當菌絲過于幼嫩時，酶解后原生質(zhì)體不穩(wěn)定，再生困難，當菌齡過長時，菌絲細胞壁加厚，次生物質(zhì)增多，再生率下降。

（4）試驗利用二次通用旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計方法建立了原生質(zhì)體制備與再生的數(shù)學模型，并對模型優(yōu)化，得到原生質(zhì)體制備再生的較優(yōu)條件，且驗證試驗結(jié)果接近預(yù)測值。試驗所得結(jié)果，與邢振楠的研究結(jié)果[21（]酶解溫度30℃，p H=5.5時原生質(zhì)體產(chǎn)量最佳）接近，但與王鐠的研究結(jié)果[22（]34℃酶解時原生質(zhì)體產(chǎn)量最高）、李蕤的研究結(jié)果[23（]菌齡6 d，酶解時間3 h，酶解溫度34℃，滲透壓穩(wěn)定劑0.6 mol/L甘露醇最適于原生質(zhì)體制備）、廖漢泉的研究結(jié)果[24（]菌齡5～6 d，以0.8 mol/L甘露醇作為穩(wěn)滲劑，用1.5%溶壁酶液酶解1.5～2 h，所得原生質(zhì)體的產(chǎn)量高達4×107個/mL，此時再生率也較高）存在差異，這可能與菌株及基礎(chǔ)培養(yǎng)基不同有關(guān)。

▲更正 本刊2016年第6期第49頁“食用菌發(fā)酵罐制種技術(shù)”（作者姜固勝、張娣、杜萍、王金賀）的基金項目是黑龍江省教育科學規(guī)劃課題（ZJD1215012）。由于作者投稿時未注明，應(yīng)作者要求本刊現(xiàn)更正說明。