植物ABCB轉(zhuǎn)運蛋白研究進展

王暄 陳海霞

（湖南農(nóng)業(yè)大學園藝學院，長沙 410128）

腺苷三磷酸結(jié)合盒轉(zhuǎn)運蛋白（ATP-binding cassette transporters，ABC轉(zhuǎn)運蛋白）家族龐大，種類眾多，是現(xiàn)存生物體中發(fā)現(xiàn)的最大的蛋白質(zhì)家族之一。ABC轉(zhuǎn)運蛋白廣泛分布于原核及真核生物中，其主要是通過結(jié)合并水解ATP釋放能量實現(xiàn)底物的跨膜運輸，其轉(zhuǎn)運的底物主要包括肽、糖類、氨基酸、金屬離子、生物堿、維生素、無機有機分子、谷胱甘肽和細胞代謝產(chǎn)物等［1］。底物的多樣性促使了ABC轉(zhuǎn)運體參與植物眾多的生理過程，如維持細胞滲透穩(wěn)態(tài)，對毒物的富集及外排、木栓化的形成、抵抗生物和非生物脅迫以及植物營養(yǎng)攝入、脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)、信號轉(zhuǎn)導、病毒防御及抗原呈遞等［2］，從而引起國內(nèi)外研究者的廣泛關(guān)注。根據(jù)ABC轉(zhuǎn)運蛋白的系統(tǒng)發(fā)育分析、核苷酸結(jié)合區(qū)域（Nucleotidebinding domains，NBDs）序列的相似性及結(jié)構(gòu)域的組織形式，將該家族劃分為ABCA-ABCG 及ABCI 8個亞家族［3］，其中ABCB目前是第二大亞族，僅次于ABCG亞族。盡管通?？梢愿鶕?jù)植物的亞科成員預(yù)測植物ABC轉(zhuǎn)運蛋白的功能，但事實上許多植物的能力與其預(yù)測的功能存在不同，甚至不同于最相關(guān)序列的性質(zhì)。近年來的研究表明，ABCB亞族參與了許多關(guān)鍵生理過程，如氣孔的開合、根的發(fā)育、植物激素的運輸、液泡對毒性物質(zhì)的富集和次生代謝產(chǎn)物分泌。

1 ABCB轉(zhuǎn)運蛋白的結(jié)構(gòu)組成

ABC 轉(zhuǎn)運蛋白因含有 ATP 結(jié)合框而得名，即核苷酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域（Nucleotide-binding domain，NBD）［4］。植物ABCB轉(zhuǎn)運蛋白具有能夠編碼125-140 kD蛋白質(zhì)的開放閱讀框［5］，其包含核苷酸結(jié)合區(qū)域（Nucleotide-binding domains，NBDs）和跨膜結(jié)合區(qū)域（Transmembrane domains，TMDs），其中親水性的NBDs結(jié)構(gòu)和序列在ABC轉(zhuǎn)運蛋白家族中高度保守，包含3個保守的基序：“Walker A”，“Walker B”和“ABC標簽序列”（又稱Walker C）［5］。其中ABC標簽序列約有120個氨基酸殘基，位于Walker A 序列和Walker B序列之間［6-7］。每一個NBD結(jié)構(gòu)域分為2個子域，分別為核心結(jié)構(gòu)域和α-螺旋結(jié)構(gòu)域，包括上述的Walker A和Walker B序列、ABC蛋白特異位點，以及較不保守的H loop和Q loop［8］。相對于保守的NBDs結(jié)構(gòu)域，ABCB轉(zhuǎn)運蛋白的TMDs的結(jié)構(gòu)、長度與序列呈現(xiàn)多樣性，B亞族的TMDs是含有6個跨膜α-螺旋的疏水跨膜結(jié)構(gòu)域，形成了溶質(zhì)跨膜的通道；NBDs結(jié)構(gòu)域負責結(jié)合ATP，并水解ATP使其構(gòu)象發(fā)生改變，從而激活轉(zhuǎn)運過程，而TMDs結(jié)構(gòu)域則形成通道使得底物通過脂質(zhì)雙分子層，二者的協(xié)調(diào)作用最終實現(xiàn)了物質(zhì)的轉(zhuǎn)運［9］。

功能表征ABCBs的計算模型已經(jīng)表明，擬南芥AtABCB4，AtABCB14和AtABCB21具有N端盤繞線圈結(jié)構(gòu)。AtABCB4中第4個跨膜螺旋的疏水區(qū)域位于膜平面之下，它的連接結(jié)構(gòu)域含有另一個卷曲螺旋結(jié)構(gòu)［10］。3種擬南芥ABCB轉(zhuǎn)運蛋白（AtABCB4，AtABCB14和AtABCB19）的底物對接分析在AtABCB19和AtABCB4 TMD中分別顯示了2個和3個推定的IAA結(jié)合位點，以及AtABCB14 TMD中的非特異性IAA對接［11］。

2 ABCB轉(zhuǎn)運蛋白的分類與性質(zhì)

ABC轉(zhuǎn)運蛋白結(jié)構(gòu)域組織形式多樣，根據(jù)蛋白的大小分為全分子轉(zhuǎn)運蛋白、半分子轉(zhuǎn)運蛋白和可溶性轉(zhuǎn)運蛋白3類［12］。植物ABCB轉(zhuǎn)運蛋白在此基礎(chǔ)上有幾種根據(jù)結(jié)構(gòu)與性質(zhì)的命名方案，目前通用的是 Sánchez-Fernández subfamily 體系［13］中的 MDR（Multidrug resistance）、TAP（Transporter associated with anatigen processing）和ATM（ABC transporter of the mitochondria）的命名方式。植物ABCB轉(zhuǎn)運蛋白亞家族目前包括全分子轉(zhuǎn)運蛋白和半分子轉(zhuǎn)運蛋白兩大類，以人和酵母中ABCB蛋白的結(jié)構(gòu)域和序列同源性為原型來定義分類［14］，其中全分子轉(zhuǎn)運蛋白家族（MDR，multidrug resistance protein，多藥耐藥性蛋白，PGP/ p-glycoprotein）的結(jié)構(gòu)域以正向方式TMD-NBD-TMD-NBD形式排列在一條多肽分子上［8］，即（TMD-NBD）2；半分子ABCB轉(zhuǎn)運蛋白是由1個TMD結(jié)構(gòu)域與1個NBD結(jié)構(gòu)域融合以形成1個（TMD-NBD）單元，并且通過約由60個氨基酸組成的連接肽與另一個同源的TMD-NBD單元連接，單個多肽的4個核心結(jié)構(gòu)域都是連續(xù)的，這種模塊化結(jié)構(gòu)提高了ABCB轉(zhuǎn)運蛋白結(jié)合和運輸不同類別化合物的可能性。值得一提的是相對于ABC轉(zhuǎn)運蛋白其他亞家族，ABCB亞家族半分子轉(zhuǎn)運蛋白擁有線粒體ABC轉(zhuǎn)運蛋白（ABC transporter of the mitochondria，ATM）和抗原肽相關(guān)運載蛋白體（Transporter associated with antigen proccssing，TAP）兩種形式，TAP在結(jié)構(gòu)上比ATM多一個雙親信號肽（表1）。ATM可編碼線粒體蛋白是所有ABC轉(zhuǎn)運蛋白亞家族中成員最少的，目前在擬南芥中僅發(fā)現(xiàn)3個［15］。而對TAP的研究較少，在擬南芥中存在該亞組基因可調(diào)節(jié)重金屬抗性［16］。也發(fā)現(xiàn)屬于該亞族的半分子轉(zhuǎn)運蛋白與細菌基因組中的ABC轉(zhuǎn)運蛋白具有同源性［17］。近幾年，有研究發(fā)現(xiàn)，植物ABCB亞家族在番茄等作物中也存在除全分子蛋白和半分子蛋白以外的結(jié)構(gòu)，如番茄SLABCB19基因的結(jié)構(gòu)域排列為NBD-TMD-NBD；甚至存在僅有一個NBD結(jié)構(gòu)域（SLABCB27等）的基因［18］。

表1 植物ABCB轉(zhuǎn)運蛋白亞家族的劃分及結(jié)構(gòu)示意圖

擬南芥［19］、水稻［20］、番茄［18］、油菜［21］、玉米［22］、葡萄［23］及百脈根［24］的全基因組測序結(jié)果表明其分別有 29、27、29、69、31、28和 15個 ABCB轉(zhuǎn)運蛋白（表2）。徐杏等［20］鑒定了水稻中27個B亞族基因，OsABCB23等4個B亞族基因?qū)儆诎敕肿愚D(zhuǎn)運蛋白；其他的ABCB亞族成員屬于全分子轉(zhuǎn)運蛋白。核苷酸結(jié)合域 NBD的5個基序中 Walker A、Walker B和ABC域基序均高度保守，而Q環(huán)和H環(huán)的保守性略差；跨膜結(jié)構(gòu)域TMD在同一蛋白內(nèi)和不同蛋白之間沒有明顯的保守性，并且水稻ABCB基因在組織器官中具有明顯的表達特異性。擬南芥ABC轉(zhuǎn)運蛋白B亞家族有22個全分子蛋白和7個半分子蛋白；在組織器官表達主要集中在莖節(jié)的第2節(jié)、吸脹的種子、根、幼嫩的葉片、蓮座葉、花器官的萼片和枯萎的葉片中［25］。此外，通過蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)預(yù)測發(fā)現(xiàn)亞族蛋白之間有相互作用［26］。McFarlane等［27］也證實了亞族蛋白之間可以形成異源二聚體從而發(fā)揮功能，異源二聚體的形成，不僅存在于各個亞族內(nèi)部之間，而且更多的是存在于各個亞族之間，使功能更加多元化。

表2 部分植物ABCB轉(zhuǎn)運蛋白亞家族成員比較

3 ABCB轉(zhuǎn)運蛋白的功能

3.1 提高植物重金屬耐性

植株體內(nèi)的重金屬離子會導致植物膜細胞膜脂分子變化，在脅迫下積累滲透調(diào)節(jié)物脯氨酸，產(chǎn)生膜脂過氧化產(chǎn)物丙二醛［28］，影響植物正常代謝活動，甚至導致植物死亡。在模式植物擬南芥中已經(jīng)陸續(xù)發(fā)現(xiàn)一些半分子ABCB轉(zhuǎn)運蛋白基因，它們表現(xiàn)出對重金屬鎘、鋁及鐵的耐受性。Kim等［29］通過基因表達分析發(fā)現(xiàn)半分子轉(zhuǎn)運蛋白AtATM3在用鎘處理后的植物的根中上調(diào)表達，從而驗證了該基因涉及重金屬耐受性?？傊?，該研究顯示AtATM3有助于鎘抗性，并表明它可能介導線粒體膜上鎘的轉(zhuǎn)運。植物積累的金屬離子會破壞細胞的離子穩(wěn)態(tài)，為了盡量減少重金屬暴露及其積累的有害影響，植物進化出了解毒機制，這些機制主要基于螯合和亞細胞區(qū)域化，而重金屬螯合是一種普遍存在于多種植物中的解毒策略［30］。此后，Larsen等［31］運用圖位克隆等方法，也從擬南芥als1-1突變體分離鑒定出另一個半分子ABCB轉(zhuǎn)運蛋白AtABCB27/AtTAP2，并且在鋁（Al3+）處理條件下，該基因根部的表達量明顯上調(diào)；als1-1突變體則生長受抑，根長顯著低于野生型；另外利用ICP-OES分析經(jīng)過25 μm AlCl3處理的野生型和als1-1突變體根部的Al3+累積量，結(jié)果表明這兩者之間并無顯著差異；亞細胞定位顯示該蛋白定位于植物的根尖液泡膜及脈管系統(tǒng)，進而推測其可能將Al以螯合肽結(jié)合物的形式轉(zhuǎn)運至液泡中，并區(qū)隔起來，提高植物重金屬耐性。

研究發(fā)現(xiàn)了半分子ABCB轉(zhuǎn)運蛋白基因AtATM1，AtATM2和AtATM3與酵母線粒體膜蛋白ATM1（ScATM1）同源，所以推斷其涉及線粒體合成的鐵/硫簇合物的輸出［32］。在3種擬南芥ATM型的ABCB轉(zhuǎn)運蛋白中，AtATM3與ScATM1功能最接近。異源表達的AtATM3能夠消除線粒體中的鐵超累積并恢復線粒體呼吸功能以及細胞色素c的水平。相比之下，AtATM1只是輕微抑制，而AtATM2幾乎沒有抑制作用，在該系統(tǒng)中表達時甚至具有毒性。隨著研究的深入，Teschner等［33］研究又發(fā)現(xiàn)ABCB轉(zhuǎn)運蛋白AtABCB25/ATM3還存在涉及線粒體鐵硫蛋白成熟以外的新功能。分析數(shù)據(jù)表明，該基因在鉬輔因子（Moco）的生物合成中具有關(guān)鍵作用。Moco是多數(shù)酶（如硝酸還原酶、亞硫酸鹽氧化酶、黃嘌呤脫氫酶和醛氧化酶）所需要的一個基團。在擬南芥ATM3插入突變體中，硝酸還原酶和亞硫酸鹽氧化酶的活性降低到了50%。試驗證明了在擬南芥ATM3減少突變體中，鉬酶活性和蛋白水平下降。還有研究表明苦蕎FtABCB1基因在重金屬鉛的脅迫下在根、莖和葉中均上調(diào)表達［34］。

3.2 參與植物生長素調(diào)控

生長素主要在幼嫩的葉片和根系中合成，它極性運輸對植物的正常生長發(fā)育至關(guān)重要。生長素合成量或運輸異常，都會引起植株發(fā)育受阻甚至矮化［35］。1992年，Dudler等［36］克隆出了植物中的第一個MDR型基因AtABCB1/AtPGP1，證實其在植物的生命活動中發(fā)揮作用。Ma等［37］首次對蘋果進行ABCB家族基因的鑒定與表達分析，確定了ABCB1及ABCB19是兩個生長素輸出載體基因，可以參加蘋果的生長素運輸和植株高度調(diào)控。在M106的嫩枝中，它們的表達水平高于M9（蘋果矮化砧木）的嫰枝，推測 ABCB19 參與了抑制矮化砧木 M9 生長素的向基運輸進而導致的矮化過程。隨后，宋春暉等［38］以蘋果矮化砧木為材料克隆出與梨、油菜和擬南芥的ABCB19基因高度同源的基因，名為 MdABCB19。該基因在頂梢中表達量最高，在喬化砧木各器官的表達量顯著高于矮化砧木M9。MdABCB19啟動子的活性在光照環(huán)境下高于黑暗環(huán)境，表明MdABCB19的轉(zhuǎn)錄受光調(diào)控。在地上部，光形態(tài)建成基因COP1通過控制生長素運輸基因PIN1的轉(zhuǎn)錄來調(diào)節(jié)生長素的運輸，從而適當?shù)卣{(diào)節(jié)根部生長素的水平［39］。鑒于ABCB19和PIN1的蛋白互作關(guān)系，MdABCB19可能也參與光照條件下生長素的運輸。后來隨著粟酒裂殖酵母系統(tǒng)的開發(fā)［11］，可以實現(xiàn)重組蛋白的功能分析和亞細胞定位。可誘導nmt41啟動子下的mam1pdr1宿主系中表達了擬南芥ABCB1和ABCB19，且ABCB19顯示出比ABCB1更高的3H-IAA外排活動。隨后研究表明了擬南芥生長素轉(zhuǎn)運體ATABCB19在NPA（通過抑制植物生長素極性轉(zhuǎn)運，引起植物的異常生長發(fā)育）抑制生長素誘導的下胚軸向性中起重要作用［40］。通過突變ABCB19，證明了生長素運輸對核內(nèi)循環(huán)的影響，與弱光下擬南芥幼苗下胚軸伸長速率有定量關(guān)系［41］。AtABCB19是AtABCB1最相似的基因并且存在功能冗余性，因為擬南芥atabcb1/abcb19雙突變體中出現(xiàn)了因為生長素運輸缺陷而植株矮化的現(xiàn)象［42］。對ABCB19和綠色熒光蛋白的轉(zhuǎn)錄和翻譯融合的檢測表明，切除根部，誘導了ABCB19的積累，使生長素聚集，從而導致不定根的形成［43］。水稻OsABCB14與擬南芥AtABCB19是同源基因［20］，該基因受生長素誘導在維管組織中強烈表達，證實參與生長素極性運輸［44］。

擬南芥ABCB轉(zhuǎn)運蛋白B4ABCB4是細胞生長素水平的底物活化調(diào)節(jié)劑，是一種根本定位的生長素外排轉(zhuǎn)運蛋白，其生物素攝取活性低，生物素濃度低［45］。ABCB4對根尖的生長素運動的作用隨著生長素濃度的增加而增加，但是在根毛長度測定中，發(fā)現(xiàn)ABCB4的表達對生長素濃度的變化相對不敏感，在低濃度生長素下也是明顯表達。AtABCB4被認為是底物激活的細胞生長素水平調(diào)節(jié)因子，調(diào)控細胞內(nèi)的生長素水平［46］。同樣，與AtABCB4相似的同源蛋白AtABCB21，在子葉的背軸側(cè)和地上部位的交界處有較強的表達，而在根中主要在周細胞中表達。ABCB21作為兼性的輸入/輸出蛋白，控制植物細胞中生長素的濃度［47］。越來越多的報告證實更多的ABCB轉(zhuǎn)運蛋白，如AtABCB11/MDR8、AtABCB14/MDR12和AtABCB15/MDR13都存在相似功能［12，45］。

3.3 參與調(diào)節(jié)植物氣孔開合

ABCB轉(zhuǎn)運蛋白AtABCB14在向高濃度的二氧化碳（CO2）過渡時會調(diào)節(jié)氣孔閉合。在AtABCB14缺乏的植物中，高二氧化碳水平導致氣孔關(guān)閉加快［48］。在只含有保衛(wèi)細胞的分離表皮條帶中，缺失AtABCB14的植株與過表達AtABCB14的植株相比，蘋果酸依賴的氣孔閉合速度更快，而過表達AtABCB14的植株比野生型植株慢，這表明AtABCB14催化蘋果酸鹽從質(zhì)外體轉(zhuǎn)運到保衛(wèi)細胞。當AtABCB14在大腸桿菌和HeLa細胞中異源表達時，觀察到蘋果酸轉(zhuǎn)運活性的增加。因此推測AtABCB14通過將蘋果酸從質(zhì)外體轉(zhuǎn)運到保衛(wèi)細胞中調(diào)節(jié)氣孔運動，從而增加其滲透壓。

4 總結(jié)與展望

隨著對于ABC轉(zhuǎn)運蛋白家族的不斷深入研究，也發(fā)現(xiàn)了許多植物中存在ABCB轉(zhuǎn)運蛋白。從水生植物到陸生植物的一些遺傳學研究表明，ABC轉(zhuǎn)運蛋白家族的復雜性是隨著生長素調(diào)控的發(fā)展而出現(xiàn)的［49］。其中ABCB轉(zhuǎn)運蛋白參與植物的多種生理代謝活動，但由于其家族的龐大，轉(zhuǎn)運機制復雜多樣，成員間存在同源或異源互作，尚有很多ABCB轉(zhuǎn)運蛋白未能深度探索。需要我們進一步深入分析在植物生命活動中發(fā)揮作用的ABCB轉(zhuǎn)運蛋白。未來隨著更多的植物完成基因組測序，我們可以有更廣泛的植物類型作為研究對象，結(jié)合分子生物學技術(shù)揭示其在不同生命活動和逆境生理中的重要作用。在過去的研究中，關(guān)于ABC轉(zhuǎn)運蛋白的研究主要集中在其特異性底物的鑒定，日后可以利用蛋白質(zhì)組學和細胞生物學等方法深入解析ABCB轉(zhuǎn)運蛋白的跨膜運輸機制，并進一步確定其轉(zhuǎn)運的底物類型。最終我們運用基因工程的方法將具有重要應(yīng)用價值的ABCB蛋白基因轉(zhuǎn)入受體中，從轉(zhuǎn)化細胞中篩選新類型，培育新品種來攻克一些遺傳缺陷難題，充分利用這類轉(zhuǎn)運蛋白以提高植物生產(chǎn)力和質(zhì)量。