二穗短柄草CYP72A亞族成員表達分析及亞細胞定位

盧盼盼， 張 彪， 孫勤富， 陸盈盈

(揚州大學生物科學與技術學院，江蘇揚州 225009)

細胞色素P450(CYP450)廣泛存在于動植物和微生物體內(nèi)，是一類非常重要的氧化酶，可以催化各種復雜的化學反應，在藥理學、環(huán)境保護及外源損傷修復等方面有較大的應用潛力。CYP450基因家族十分古老，在單子葉植物、雙子葉植物分化之前就已經(jīng)存在。在植物基因組中，CYP450是最大的超家族之一，幾乎涉及植物所有的代謝途徑，作用底物十分廣泛，可以是萜類、苯丙烷類、生物堿、脂肪酸、植物激素、色素、黃酮等次生代謝物。CYP450可以在底物分子中加入氧原子，發(fā)生羥基化、環(huán)氧化、脫烷基化等化學反應，完成底物的合成或代謝途徑，被稱為“萬能的生物催化劑”。

CYP450可以根據(jù)發(fā)現(xiàn)的時間順序分為不同家族。氨基酸序列相似性超過40%的CYP450被歸為一個家族，序列相似性超過55%的CYP450被歸類為同一個亞族。CYP72基因家族是CYP450中參與次生代謝的最大的酶類族群之一，CYP72A屬于CYP72基因家族中的一個亞族，在被子植物中十分保守。

二穗短柄草(L.)植株矮小、生育期短、基因組小，與小麥()等禾谷類作物的親緣關系較近，且二倍體二穗短柄草(2=10)的基因組與擬南芥()的基因組大小相仿，擁有草類植物種類中最簡單的基因組，因此被作為小麥研究的理想模式植物。有研究表明，CYP72A亞族氧化酶參與多種代謝途徑。苜蓿()CYP72A67是溶血皂苷生物合成中重要的氧化酶，負責產(chǎn)生主要的皂苷配基——苜蓿酸。苜蓿體內(nèi)的皂苷含量與、的表達水平密切相關，CYP72A67是皂苷合成中間產(chǎn)物齊墩果酸、常春藤皂苷元C位上的羥化酶，CYP72A68可氧化齊墩果酸、常春藤皂苷元C位。油橄欖()中的2個CYP72成員OeOMES、OeSXS能夠在環(huán)烯醚萜的生物合成過程中催化氧化狀態(tài)的C—C化合物裂解。擬南芥CYP72A9是催化赤霉素(GA)C位上的羥化酶，可催化C—H GAs(GA12、GA9和GA4)向C—OH GAs(GA53、GA20和GA1)轉化，抑制的表達會導致植物體內(nèi)GA1含量減少、GA4含量增加。雙草醚是乙酰乳酸合酶的抑制劑，水稻()CYP72A31可將雙草醚代謝為低毒性的物質，從而增強植株對雙草醚除草劑的抗性，植株對除草劑抗性的強弱與CYP72A31表達水平的高低有關。此外，CYP72A亞族基因在抵抗植物病蟲害方面也發(fā)揮了重要作用。蟲害會誘導煙草()基因的迅速表達，過表達CYP72A2的煙草植株增強了對天蛾幼蟲、丁香假單胞桿菌的抗性。在抗性品種H7R中，水稻、的表達量在稻瘟病菌侵染后上調(diào)，在感性品種H7S中下調(diào)，推測這2個基因可能與水稻抗性反應有關。(，)-4，8，12-三甲基-1，3，7，11-十三碳四烯(TMTT)是植物受到植食性昆蟲侵害后產(chǎn)生的揮發(fā)性化學物質，能吸引害蟲天敵從而達到控制害蟲的作用。擬南芥的表達量在受到菜青蟲侵害時升高，且TMTT含量與轉錄本水平密切相關。

本研究利用生物信息學、實時熒光定量、蛋白瞬時表達等手段對二穗短柄草CYP72A亞族成員的序列特征、進化關系、組織表達、逆境響應和亞細胞定位等方面進行系統(tǒng)分析，以期為進一步解析CYP72A亞族成員的生物學功能提供參考。

1 材料與方法

1.1 CYP72A亞族成員的系統(tǒng)進化分析

在Pfam(http：//pfam.xfam.org/)數(shù)據(jù)庫中下載CYP450特征結構域的隱馬氏模型文件(Pafm登錄號：PF00067)，以PF00067為模型，在植物基因組數(shù)據(jù)庫Phytozome v12.0(https：//phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html)中搜索二穗短柄草中含有CYP450結構域的蛋白序列；用MEGA v10.0.5的MUSCLE計算方法對二穗短柄草、擬南芥CYP72A亞族蛋白序列進行序列比對，并構建系統(tǒng)進化樹，分析獲得的14個二穗短柄草CYP72A亞族成員。利用MEGA v10.0.5的MUSCLE計算方法對二穗短柄草、擬南芥、水稻、玉米()、大豆()的CYP72A亞族成員進行比對，利用鄰接法構建系統(tǒng)進化樹，bootstrap值設置為1 000。

1.2 試驗材料及脅迫處理

2020年3—7月，將供試材料二穗短柄草Bd21盆栽置于揚州大學溫室中培養(yǎng)。用馬鈴薯培養(yǎng)基在 25 ℃ 恒溫箱中培養(yǎng)禾谷鐮刀菌(，) 3～5 d，將菌絲挑至綠豆湯培養(yǎng)基中，于25 ℃培養(yǎng)2～3 d。在二穗短柄草開花期，采用單花滴注的方法接種小穗部基部的小花，每個小花接種2 μL菌液(濃度為5×10～10×10孢子/mL)，接種后分別在0、48、96、144 h進行取樣；對正常生長的二穗短柄草開花期的小穗、根和葉以及成熟期的種子分別取樣，所取樣品經(jīng)液氮速凍后在-80 ℃冰箱中保存。

1.3 二穗短柄草CYP72A亞族基因表達模式分析

用TRIzol試劑盒(Tiangen公司，北京)提取RNA，按照RNA kit cDNA合成試劑盒(TaKaRa公司，大連)合成cDNA第一條鏈。以二穗短柄草()為內(nèi)參，利用實時熒光定量PCR儀(BioRad公司，USA)檢測CYP72A亞族基因的表達模式，所用引物如表1所示。

1.4 二穗短柄草CYP72A亞族成員的亞細胞定位分析

亞細胞定位分析所用載體為p16318hGFP，p16318hGFP載體包含CaMV35S啟動子、綠色熒光蛋白編碼序列，利用表1中的引物序列得到擴增產(chǎn)物，將產(chǎn)物連接到p16318hGFP載體上，得到綠色熒光蛋白(GFP)重組質粒。利用聚乙二醇(PEG)介導的瞬時轉化方法將GFP重組質粒與內(nèi)質網(wǎng)maker mRFP-HDEL共轉化到小麥原生質體中，室溫培養(yǎng)過夜，利用激光共聚焦顯微鏡檢測綠色熒光和紅色熒光共表達部位。

表1 本研究所用引物序列

1.5 二穗短柄草CYP72A亞族基因的表達譜數(shù)據(jù)分析

從GEO數(shù)據(jù)庫(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)中下載二穗短柄草在禾谷鐮刀菌處理下的高通量測序數(shù)據(jù)，登錄號為GSE50665。

2 結果與分析

2.1 CYP72A亞族成員的系統(tǒng)進化關系分析

通過序列比對鑒定獲得了14個二穗短柄草CYP72A亞族成員。將二穗短柄草CYP72A亞族14個成員的蛋白序列與擬南芥CYP72A的8個成員、水稻CYP72A的13個成員、玉米CYP72A的11個成員、大豆CYP72A的12個成員的蛋白序列進行多重比對，構建系統(tǒng)進化樹。結果顯示，5個物種的CYP72A成員可以被分成2類，雙子葉植物大豆、擬南芥歸為Ⅰ類，單子葉植物水稻、玉米和二穗短柄草歸為Ⅱ類，推測CYP72A亞族在單雙子葉分化之前已經(jīng)存在，且在單雙子葉進化過程中表現(xiàn)出明顯差異(圖1)。

2.2 二穗短柄草CYP72A亞族基因在不同組織中的表達模式分析

用RT-qPCR分析CYP72A亞族基因在花、根、葉和種子4種組織中的相對表達量，結果顯示， 14個CYP72A亞族基因中，有7個基因(、、、、、和)在種子中的相對表達量最高。其中在種子中特異性高表達，在種子中的表達量分別是花、根、葉中表達量的10.3、6.8、7.9倍；、、和在葉中的相對表達量最高(圖2)。由此可見，二穗短柄草CYP72A亞族基因的表達具有組織特異性，在種子、葉片中高表達。

2.3 二穗短柄草CYP72A亞族基因在禾谷鐮刀菌處理下的表達譜分析

利用GEO數(shù)據(jù)庫中的高通量測序數(shù)據(jù)，筆者分析了13個二穗短柄草CYP72A亞族基因在禾谷鐮刀菌處理下的表達譜。結果顯示，除了、、和外，其他基因在禾谷鐮刀菌處理下的表達量都上升了2倍以上，其中上調(diào)的倍數(shù)最高，超過了20倍(圖3)，說明二穗短柄草CYP72A亞族部分基因受禾谷鐮刀菌誘導表達。

2.4 RT-qPCR分析二穗短柄草CYP72A亞族基因在禾谷鐮刀菌處理下的表達模式

為了進一步確定CYP72A亞族基因在禾谷鐮刀菌處理下的表達模式，筆者利用RT-qPCR分析了CYP72A亞族基因在不同時間段禾谷鐮刀菌處理下的表達模式。結果顯示，在禾谷鐮刀菌處理下，CYP72A亞族基因相對表達量明顯升高的有7個，分別是、、、、、和，其中、、和的上調(diào)倍數(shù)較高，與0 h的表達量相比，其相對表達量分別在96、144、96、48 h升高了13.8、10.7、8.4、8.1倍(圖4)。由此可見，CYP72A亞族基因受禾谷鐮刀菌誘導表達，且不同基因對禾谷鐮刀菌的響應時間和程度不同。

2.5 CYP72A亞族成員的亞細胞定位分析

筆者將在禾谷鐮刀菌處理下上調(diào)倍數(shù)較高的4個基因(、、和)分別構建到p16318hGFP表達載體上，形成融合表達載體，并將其與內(nèi)質網(wǎng)maker mRFP-HDEL共轉化到小麥原生質體中，分析這4個CYP72A亞族成員的亞細胞定位。結果顯示，4個CYP72A亞族成員的GFP熒光與HDEL的紅色熒光重疊，表明4個CYP72A亞族成員(Bradi2g41110、Bradi2g44160、Bradi2g44190和Bradi2g44200)都定位于內(nèi)質網(wǎng)(圖5)。

3 討論與結論

CYP72A亞族基因常成簇存在于染色體上，如水稻的9個CYP72A亞族基因成簇排列于1號染色體上，擬南芥的9個CYP72A亞族基因成簇排列于3號染色體上，玉米的9個CYP72A亞族基因分2簇排列于1號染色體上，番茄的11個CYP72A亞族基因成簇排列于7號染色體上，二穗短柄草的14個CYP72A亞族基因中僅有定位于1號染色體上，其他13個基因都定位于2號染色體上，其中、、、、、和成簇排列于2號染色體上，且、、、和受禾谷鐮刀菌誘導上調(diào)表達，說明二穗短柄草CYP72A亞族基因簇具有一定的共表達特性。與、的氨基酸序列相似性分別達到了82.83%、81.29%，推測這3個蛋白對應的基因可能由基因復制產(chǎn)生，在進化過程中逐漸分化，并可能協(xié)同發(fā)揮功能。

Prall等分析了33種植物(包括8種單子葉植物和25種雙子葉植物)的CYP72A亞族成員的系統(tǒng)進化關系，結果顯示，8種單子葉植物中所有CYP72A亞族成員聚為一類，除荷花外的24種雙子葉植物的所有CYP72A亞族成員聚為1個大的分支，荷花的1個CYP72A亞族成員單獨為1個分支。單子葉植物二穗短柄草、水稻、玉米的CYP72A亞族成員與雙子葉植物擬南芥、大豆CYP72A亞族成員在進化上形成2個明顯不同的進化分支。這些結果表明，植物CYP72A亞族在單、雙子葉分化之前已經(jīng)形成，且在單、雙子葉進化過程中形成了不同的進化方向。

在正常生長條件下，水稻在根中表達，在地上部分不表達，而在多種除草劑誘導下，在根中的表達量會減少，在地上部分的表達量會增加。也有研究結果表明，在水稻抽穗期，、在水稻葉片中的表達水平最高。分析不同植物CYP72A的組織表達模式可見，不同成員間的表達模式有一定的相似性，如擬南芥CYP72A9在長角果中的表達量最高，其次是在葉片、根和種子中，在花、莖中的表達量較低。二穗短柄草、、、、、和的表達量也是在種子中最高，其中在種子中特異性高表達，推測二穗短柄草CYP72A亞族可能在種子生長及代謝途徑中發(fā)揮重要功能。

水稻、、受病原菌侵染誘導表達。順式茉莉酮是植物受到昆蟲侵害后釋放出的物質，擬南芥、在順式茉莉酮誘導下強烈上調(diào)表達。煙草在受昆蟲侵害后迅速誘導表達，在煙草中過表達能夠增強對天蛾幼蟲、丁香假單胞桿菌的抗性。歐洲山芥的CYP72A552能夠催化皂苷的形成，激活植物對小菜蛾、煙草天蛾害蟲的防御功能。RT-qPCR結果顯示，二穗短柄草CYP72A亞族中7個基因的相對表達量在禾谷鐮刀菌處理下明顯升高，推測植物CYP72A亞族基因不僅參與氧化代謝途徑，可能還參與禾谷鐮刀菌的防衛(wèi)反應。

擬南芥CYP72A9是定位于內(nèi)質網(wǎng)的GA13-羥化酶，可催化GA4、GA9和GA12轉化為GA1、GA20和GA53，從而影響種子休眠過程。也定位于內(nèi)質網(wǎng)，功能缺失會導致節(jié)間變短、株高降低、生育期延長。亞細胞定位分析結果顯示，4個CYP72A亞族成員(、、和)都定位于內(nèi)質網(wǎng)，且受禾谷鐮刀菌誘導表達，上調(diào)倍數(shù)均超過8倍，推測這4個CYP72A亞族成員可能通過內(nèi)膜系統(tǒng)參與代謝過程及生物脅迫響應。