甜瓜Trihelix轉(zhuǎn)錄因子的鑒定與生物信息學(xué)分析

鄭 玲， 李夢丹

(洛陽師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，河南洛陽 471934)

轉(zhuǎn)錄因子是一類DNA蛋白復(fù)合體，其可與目的基因啟動子部位的元件產(chǎn)生特異性聯(lián)合，進而調(diào)節(jié)目的基因的表達。Trihelix是植物特有的一種轉(zhuǎn)錄因子，因其含Trihelix結(jié)構(gòu)域而獲名，參與光響應(yīng)、環(huán)境調(diào)節(jié)和植株生長發(fā)育等一系列生命活動，Trihelix也被稱為GT家族。

Trihelix含有3個保守域，分別是Trihelix保守結(jié)構(gòu)域、第四α螺旋和卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域。Trihelix保守結(jié)構(gòu)域的3個串聯(lián)的α-螺旋能形成螺旋-環(huán)-螺旋-環(huán)-螺旋構(gòu)象，該結(jié)構(gòu)和MYB家族3個α螺旋構(gòu)成的螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋結(jié)構(gòu)相似，所以通常認為Trihelix家族源于一個MYB-like基因。Trihelix家族根據(jù)其功能結(jié)構(gòu)域的氨基酸不同被分為GT-1、GT-2、GTγ、SH4和SIP1等5個亞族。此家族每個亞族的結(jié)構(gòu)域都十分保守，每個α螺旋均有1個保守的色氨酸。每個亞族間卻不同，GT-2亞族的N、C端分別有1個Trihelix保守結(jié)構(gòu)域，GT-2C、SH4及GT-1亞族中的Trihelix結(jié)構(gòu)域內(nèi)部疏水區(qū)都有1個色氨酸殘基。GTγ亞族中有1個第四α螺旋和N端Trihelix結(jié)構(gòu)域，SH4亞族無前者，即(F/Y)-(F/Y)-X-X-(L/I/M)-X-X-(L/I/M)保守序列，其余Trihelix亞家族均含有此結(jié)構(gòu)域。異亮氨酸存在于SIP1亞族Trihelix結(jié)構(gòu)域的第3個疏水區(qū)。Trihelix家族C端的卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域，亞族間區(qū)別較大，但亞族內(nèi)部保守，一般與二聚化或多聚化有關(guān)。

關(guān)于Trihelix家族的研究表明，擬南芥()有34個Trihelix家族成員，而水稻()有41個、番茄()有36個、谷子()有34個、蘋果(Mill.)有39個、辣椒()有28個、葡萄()有27個等。

甜瓜()為葫蘆科甜瓜屬，是主要的園藝作物之一，具有十分重要的經(jīng)濟價值。甜瓜全基因組測序的完成為對甜瓜功能基因組進行深入研究提供了數(shù)據(jù)支持。但目前還沒有關(guān)于甜瓜Trihelix家族的研究報道。本研究以甜瓜的基因組數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，結(jié)合生物信息學(xué)技術(shù)對其Trihelix家族進行鑒定，分析該家族的基本信息、進化關(guān)系、位置信息、表達模式和順式元件等，為進一步探究該家族的基因功能提供了理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 甜瓜Trihelix家族的鑒定

本試驗的研究對象是甜瓜，于2020年3—6月在洛陽師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院生物信息學(xué)實驗室(214室)計算機上進行軟件操作和信息處理：在植物轉(zhuǎn)錄因子數(shù)據(jù)PlantTFDB(http：//planttfdb.gao-lab.org/)中分別獲取甜瓜及擬南芥(34個)Trihelix家族的氨基酸序列；在葫蘆科基因組數(shù)據(jù)庫網(wǎng)站ICuGI(http：//cucurbitgenomics.org/)中獲取甜瓜基因組數(shù)據(jù)信息，并利用甜瓜Trihelix家族序列對其基因組數(shù)據(jù)庫進行Blast比對，得到候選蛋白序列，以PF13837為探針進行搜索鑒定；隨后利用InterPro在線程序軟件對下載的甜瓜Trihelix序列進行驗證，確認其是否含有Trihelix結(jié)構(gòu)域，最終得到26個含有完整結(jié)構(gòu)域的候選Trihelix序列；利用ExPASy數(shù)據(jù)庫中的ProtParam工具(https：//web.expasy.org/protparam/)分析甜瓜每個候選Trihelix家族成員蛋白質(zhì)序列的長度、理論等電點、分子量等基本信息，利用Plant-PLoc網(wǎng)站(http：//www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/plan-t/？tdsourcetag=s_pcqq_aiomsg)進行亞細胞定位預(yù)測。

1.2 甜瓜Trihelix基因家族在染色體上的定位

將甜瓜Trihelix家族基因的蛋白質(zhì)序列在Melonet DB(https：//melonet-db.dna.affrc.go.jp/ap/top)中進行檢索，得到基因在染色體上的位置信息，再利用MapInspect軟件將基因位置信息在染色體上進行定位，并繪制物理圖譜。

1.3 甜瓜Trihelix家族進化樹構(gòu)建

利用 MEGA 6.0軟件里的Clustal W工具對擬南芥、甜瓜共計60個Trihelix氨基酸序列進行多序列比對，利用 MEGA 6.0 軟件 Neighbor-Joining 算法構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。

1.4 甜瓜Trihelix家族的基因結(jié)構(gòu)分析

在葫蘆科基因組數(shù)據(jù)庫中獲得甜瓜基因組信息，依次檢索出相對應(yīng)的CDS序列和GENE序列，利用GSDS 2.0(http：//gsds.gao-lab.org/index.php)網(wǎng)站進行分析，生成甜瓜Trihelix家族基因的外顯子-內(nèi)含子圖像。甜瓜Trihelix家族基因的保守基序采用在線工具MEME(http：//meme-suite.org/tools/meme)進行預(yù)測，保守基序數(shù)目設(shè)置為10。將下載的結(jié)果利用TBtools軟件的Redraw Motif Pattern工具進行分析，生成圖像。

1.5 甜瓜Trihelix基因家族的啟動子分析

從甜瓜基因數(shù)據(jù)庫中下載Trihelix家族基因啟動子序列(起始密碼子上游2 000 bp)，采用PlantCARE(http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtool-s/plantcare/html/)進行分析，得出其中的順式作用元件相關(guān)數(shù)據(jù)。利用GSDS2.0網(wǎng)站(http：//gsds.gao-lab.org/index.php)對數(shù)據(jù)進行分析，最終得到順式作用元件圖譜。

1.6 甜瓜Trihelix基因家族的表達模式分析

在Melonet DB(https：//melonet-db.dna.affrc.go.jp/ap/top)根據(jù)基因登錄號檢索出每個CDS序列編碼出的蛋白質(zhì)在植株各部位及相同部位各生長時段的表達數(shù)據(jù)，利用TBtools軟件制作熱圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 甜瓜Trihelix家族的鑒定

本研究共鑒定到26個甜瓜Trihelix家族成員，在ProtParam和Plant-PLoc網(wǎng)站分別檢索出CmGT基因家族蛋白質(zhì)序列的長度、分子量、理論等電點和亞細胞定位等信息。26個甜瓜Trihelix家族基因按照下載的蛋白質(zhì)原始序列順序，依次命名為～，蛋白質(zhì)長度介于279aa()～927aa()之間；分子量范圍為 33 225.58()～102 712.52()；等電點范圍4.81()～9.80()，其中17個小于7，富含酸性氨基酸，其余9個大于7，富含堿性氨基酸；亞細胞定位發(fā)現(xiàn)定位于線粒體和細胞核，定位于線粒體和葉綠體，僅定位于葉綠體，、、、和僅定位于細胞核，其余18個都定位于線粒體。

2.2 甜瓜Trihelix基因家族的染色體定位

由圖1可知，甜瓜26個Trihelix基因不均勻地分布于12條染色體上；每條染色體上的基因數(shù)為 1～5個，其中Chr4上基因數(shù)目最多(5個)，其次是Chr1與Chr3(4個)，Chr10上含有3個基因，Chr2和Chr11上僅含有2個基因，其余染色體上均含有1個基因；另外Chr4上出現(xiàn)了基因簇現(xiàn)象。

2.3 甜瓜Trihelix家族的基因結(jié)構(gòu)和系統(tǒng)進化樹分析

2.3.1 甜瓜與擬南芥Trihelix系統(tǒng)進化樹 根據(jù)擬南芥Trihelix家族的分類標(biāo)準(zhǔn)，將甜瓜Trihelix家族也分為5個亞族(圖2)，依次為GT-2亞族、GT-1亞族、SH4亞族、GTγ亞族和SIP1亞族，分別包括7、5、3、3、8個基因。基于系統(tǒng)進化樹，確定了12對姐妹基因，分別是SIP1亞家族中的6對；SH4亞家族中的2對；GT-1亞家族中的2對；GTγ亞家族中的1對；GT-2亞家族中的3對。還可看出甜瓜Trihelix家族存在1對同源旁系基因和。

2.3.2 甜瓜Trihelix家族的基因結(jié)構(gòu)分析 由圖 3-B 可知，在26個甜瓜Trihelix家族基因中，GT-2亞族除外均有1個內(nèi)含子；GT-1亞族中，有17個內(nèi)含子，有4個內(nèi)含子，其他基因皆僅有1個內(nèi)含子；GTγ亞族和SIP1亞族中、、和均無內(nèi)含子，SH4亞族內(nèi)含子數(shù)量為2～3個不等，SIP1亞族中為0～6個。

2.3.3 甜瓜Trihelix基因家族的的保守基序分析 26個甜瓜Trihelix序列中保守基序的數(shù)量和種類差異較大(圖3-C)。所有的序列都含有Motif1。除、、外所有的序列都含有Motif2。Motif4及Motif5僅出現(xiàn)在GT-2亞族中。Motif6存在于除、外的所有序列中。Motif7及Motif3僅在GT-2和GT-1亞族的部分成員中出現(xiàn)。SH4亞族無Motif8，GT-1及 GT-2 亞族中均無Motif9，GTγ、SH4及SIP1亞族中均未出現(xiàn)Motif10。GT-2亞族中出現(xiàn)較多種類的Motif基序。、及具有相同種類的Motif基序。僅有Motif10、Motif6、Motif1、Motif8 4種基序，和其他序列差別較大。

2.4 甜瓜Trihelix基因家族的啟動子元件分析

在甜瓜Trihelix家族中鑒定到多種響應(yīng)激素和環(huán)境信號的順式作用元件(圖4)。光響應(yīng)元件(G-box和G-Box)、脫落酸信號響應(yīng)元件(ABRE)、乙烯響應(yīng)元件(ERE)、茉莉酸響應(yīng)元件(TGACG-motif)在各亞族中均有分布；GT-2、GT-1 和SIP1亞族里的9個基因中均出現(xiàn)了低溫響應(yīng)元件(LTR)；MBS為干旱響應(yīng)元件，主要出現(xiàn)于SIP1、GTγ及GT-2亞家族；在13個基因中出現(xiàn)了生長素響應(yīng)元件(TCA-element)；20個基因中發(fā)現(xiàn)了缺氧信號響應(yīng)元件(ARE)；、、、和、中皆發(fā)現(xiàn)了茉莉酸、光、脫落酸信號、乙烯4種響應(yīng)元件。

2.5 甜瓜Trihelix基因家族的表達模式分析

熱圖(圖5)顯示，種子經(jīng)過吸水后，的表達量明顯下調(diào)，、、、、和則呈現(xiàn)不同程度上調(diào)，推測這些基因可能與早期種子的萌發(fā)有關(guān)。和在果實發(fā)育的過程中表達量明顯上調(diào)，推測其與果實的發(fā)育有關(guān)。SH4亞族的在采摘1～4周后的果實和外果皮中顯著表達，SIP1亞族的絕大多數(shù)成員(除和)在果實成熟過程中均呈現(xiàn)較高表達量，推測這些成員與乙烯、脫落酸(果實成熟相關(guān)的激素)的合成相關(guān)，與之相似的還有GTγ亞族的和，GT-1亞族的。GT-2亞家族中的、和基因在雌花的幼根、花藥和雌花中表達水平較高，推測該亞族在調(diào)節(jié)花和根的成長方面占據(jù)重要地位。SIP1亞族中大多數(shù)成員(除和)在幾乎所有的組織中都呈現(xiàn)較高的表達水平，推測該亞族的大多數(shù)基因在幼苗、根、莖、葉、花、果實等生長發(fā)育的各個時期均具有重要的作用。

3 討論與結(jié)論

本研究對甜瓜的Trihelix家族進行了生物信息學(xué)分析，共鑒定了26個Trihelix家族成員。這些基因多數(shù)定位于線粒體中，不均勻地分布于12條染色體上，Chr4上出現(xiàn)基因簇現(xiàn)象。此家族被分為 GT-2、GT-1、GTγ、SH4、SIP1 5個亞族，確定了12對姐妹基因，1對同源旁系基因。擬南芥與甜瓜Trihelix家族共同構(gòu)建的進化樹中，和位于同一分支，參與干旱和寒冷等逆境脅迫應(yīng)答，可推測也具有此功能；和位于同一分支，(ASIL2)作用于營養(yǎng)器官的各部分，在種子中作用效果更為明顯，推測也可能參與了營養(yǎng)器官和種子的生長發(fā)育過程。

本研究在甜瓜Trihelix家族成員中發(fā)現(xiàn)大量與光響應(yīng)有關(guān)的順式元件(G-box和G-Box)，推測甜瓜Trihelix家族與光響應(yīng)調(diào)節(jié)密切相關(guān)。這與Park等、Nagano等與Wang等的相關(guān)研究一致。當(dāng)受到冷害、鹽以及ABA脅迫時，擬南芥基因在植物體內(nèi)呈現(xiàn)上調(diào)表達趨勢。谷子Trihelix家族可能參與了調(diào)節(jié)各種非生物脅迫和激素的處理。黃禮鴻等的研究表明，番茄Solyc09g015150和Solyc12g05651受多種非生物脅迫和激素的調(diào)控。棉花Trihelix家族SH4亞族調(diào)控基因表達響應(yīng)了干旱、低溫、高鹽和ABA處理。葡萄Trihelix家族的GT-2亞族與干旱脅迫有密切關(guān)系。水稻中OsGTγ-1過量表達對其提高鹽脅迫抗性具有明顯作用。甜瓜Trihelix家族的SIP1和GT-2亞族中出現(xiàn)大量干旱、低溫和缺氧信號等響應(yīng)元件，推測SIP1和GT-2亞族在植株應(yīng)對缺氧、低溫和干旱等逆境環(huán)境的調(diào)節(jié)方面起到十分關(guān)鍵的影響。另外此家族啟動子區(qū)域的順式元件還包括脫落酸信號、乙烯、生長素和茉莉酸等響應(yīng)元件。脫落酸和茉莉酸可以誘導(dǎo)植株抗旱性、抗寒性、抗病性和耐鹽性的產(chǎn)生，乙烯會促進果實成熟，生長素則可以促進植株成長。故推測Trihelix家族在植物逆境脅迫調(diào)節(jié)和生長發(fā)育等方面起到十分關(guān)鍵的作用。

擬南芥中基因?qū)儆贕T-2亞家族，通常表達于花萼原基發(fā)生時期，在囊胚發(fā)育中也起著重要作用。同為GT-2亞家族的()可以抑制擬南芥腺毛狀體發(fā)育過程中倍性細胞的增長。相似的，本研究發(fā)現(xiàn)甜瓜Trihelix家族中的GT-2亞族在調(diào)節(jié)根和花的生長發(fā)育方面占據(jù)重要地位。表達模式分析結(jié)果顯示，SIP1亞族的大部分成員在甜瓜營養(yǎng)生長和生殖發(fā)育過程都發(fā)揮著重要的調(diào)控作用，這與“SIP1亞族的參與植株早期胚胎發(fā)育”的推測一致。順式作用元件分析中，SH4亞族的和SIP1亞族的絕大多數(shù)成員與乙烯、脫落酸等相關(guān)激素的合成有關(guān)，而表達模式分析也表明，這些基因在果實成熟的過程中發(fā)揮著重要的作用。綜上所述，Trihelix家族普遍參與植株成長的各個過程，在營養(yǎng)生長和生殖生長過程中都可能具有關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用。