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    基于nrITS、psbA-trnH和DMC1序列中國短柄草族的系統(tǒng)進(jìn)化和生物地理學(xué)研究

    2018-07-24 01:06:24武潑潑張學(xué)杰張洛艷樊守金
    植物研究 2018年4期
    關(guān)鍵詞:短柄草屬雀麥

    武潑潑 張學(xué)杰 張洛艷 樊守金

    (山東師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院逆境植物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,濟(jì)南 250014)

    禾本科(Poaceae)植物種類眾多,全世界約有700個(gè)屬、10 000多種,起源時(shí)間最早可以追溯到約7 000年前的白堊紀(jì)(Cretaceous)[1],從溫帶氣候?yàn)橹鞯沫h(huán)境逐漸適應(yīng)如今多種多樣的生態(tài)環(huán)境,分布區(qū)覆蓋地球陸地面積的五分之一[2]。短柄草族隸屬于禾本科早熟禾亞科(Pooideae),全球約16種,主要分布在歐洲和亞洲大陸的溫帶地區(qū),亞洲的高山以及從墨西哥到玻利維亞的美洲地區(qū)亦有分布[3],我國分布有5種,其中兩種是中國特有。其總狀花序和雀麥族的圓錐花序共同演化形成小麥族的穗狀花序[4],和小麥族有著較近的親緣關(guān)系。

    該族植物具有重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值、生態(tài)價(jià)值和科研價(jià)值。Bossolini等提出將短柄草和二穗短柄草作為模式植物,作為小麥(Triticumaestivum)和水稻(Oryzasativa)研究的橋梁[5]。短柄草是短柄草族多年生草本植物,優(yōu)良牧草,分蘗能力強(qiáng),水土保持能力良好。Steinwand等將短柄草開發(fā)為研究多年生禾草的模式植物[6]。二穗短柄草是短柄草族一年生草本植物,具有植株小,生長周期短,且染色體基因組小,結(jié)構(gòu)也較為簡單,較易遺傳轉(zhuǎn)化等特點(diǎn),被開發(fā)為研究小麥、大麥(Hordeumvulgare)等麥類作物的模式植物。二穗短柄草基因組測序已經(jīng)完成,基因組共5條染色體,測序獲得拼接總長為272 MB的序列框架圖,約包含25 532個(gè)編碼基因[7]。根據(jù)測序結(jié)果,二穗短柄草與小麥基因組相似度很高,親緣關(guān)系很近。以二穗短柄草為模式材料研究麥類作物,具有較高的準(zhǔn)確性和效率,為解析小麥抗逆、高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)等重要性狀提供了新的突破口。但是小麥族、雀麥族和短柄草族的系統(tǒng)學(xué)位置尚不明確。觀點(diǎn)主要分為3類:一類認(rèn)為短柄草屬(Brachypodium)和雀麥族有較近的親緣關(guān)系[8~9];一類支持短柄草屬歸屬于小麥族[10~13];一類支持短柄草屬獨(dú)立成族[14~19]。短柄草族植物在我國主要分布于喜馬拉雅山脈和橫斷山脈交界處,對揭示青藏高原的隆起和闡明植物的分布原因具有重要研究價(jià)值。因此,對短柄草族植物展開系統(tǒng)學(xué)和生物地理學(xué)研究是很有必要的。

    核糖體rDNA片段ITS位于核糖體DNA內(nèi)轉(zhuǎn)錄基因間隔區(qū),是目前生物系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化分析和DNA Barcoding研究中廣泛應(yīng)用的核基因片段。Alvarez&Wendel對發(fā)表在在幾個(gè)著名的系統(tǒng)學(xué)和進(jìn)化學(xué)期刊中的植物系統(tǒng)發(fā)育文章進(jìn)行調(diào)查統(tǒng)計(jì)[20],共計(jì)調(diào)查244篇文獻(xiàn),在屬及屬下水平研究中涉及nrITS序列的文獻(xiàn)占三分之二(66%),超過三分之一(34%)的系統(tǒng)發(fā)育樹是只依靠nrITS序列進(jìn)行構(gòu)建的。

    葉綠體基因psbA-trnH是一段非編碼序列,長度約為450 bp,進(jìn)化速率較快,且序列兩端保守,有利于通用引物的設(shè)計(jì),是目前常用的DNA Barcoding候選片段之一[21]。Li等人對植物條形碼的研究綜述中也表明psbA-trnH是目前應(yīng)用最廣泛的質(zhì)體DNA條形碼[22]。

    單拷貝基因由于含有更多的遺傳信息,逐漸受到分類學(xué)家的廣泛重視[23~24]。DMC1是減數(shù)分裂相關(guān)的單拷貝核基因,在多倍體中獨(dú)立遺傳,在小麥族的多倍體體形成、屬的分類研究中得到廣泛應(yīng)用。Tang等利用DMC1片段對四倍體小麥A基因組的起源進(jìn)行研究。表明小麥A基因組來自于Triticumurartu,而不是一粒小麥(T.monococcum)[25]。

    因此,本研究用葉綠體基因片段psbA-trnH,核糖體基因轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)ITS,單拷貝核基因片段DMC1以及psbA-trnH+nrITS+DMC1聯(lián)合序列對短柄草族及其相關(guān)屬進(jìn)行研究,以期為其系統(tǒng)學(xué)位置、屬下關(guān)系和分歧時(shí)間提供翔實(shí)的證據(jù)。

    1 材料和方法

    1.1 樣品采集

    本研究共選取36份材料,其中短柄草屬3種7個(gè)個(gè)體、雀麥屬5種、小麥族7屬23種,并選稻亞科(Oryzoideae)的稻為外類群。憑證標(biāo)本均保存于山東師范大學(xué)標(biāo)本館(SDNU),相關(guān)信息見表1?;贏rcGIS軟件制作的采集地點(diǎn)分布圖見圖1。

    表1 實(shí)驗(yàn)材料及其來源Table 1 List of plant materials used in this study and their original resources

    圖1 標(biāo)本采集地點(diǎn)分布圖Fig.1 The distribution of sampling locations

    1.2 DNA提取與PCR擴(kuò)增

    DNA材料來自于硅膠快速干燥保存的葉片,用改良的CTAB法[26]和DNA試劑盒提取DNA。擴(kuò)增引物序列見表2。nrITS反應(yīng)程序:95℃ 4 min;35個(gè)循環(huán),分別為94℃ 30 s,52℃ 30 s,72℃ 90 s;最后72℃延伸10 min。psbA-trnH反應(yīng)程序:94℃ 3 min;30個(gè)循環(huán),分別為94℃ 30 s,55℃ 30 s,72℃ 45 s;最后72℃延伸10 min。DMC1反應(yīng)程序:94℃ 5 min;35個(gè)循環(huán),分別為94℃ 60 s,52℃ 60 s,72℃ 60 s;最后72℃延伸8 min。擴(kuò)增反應(yīng)在Bio-Rad T100 PCR儀上進(jìn)行,PCR反應(yīng)體系為20 μL:2*Taq PCR Master Mix(萊楓,上海)10 μL,上游和下游引物(華大,北京)各1 μL,DNA模板1 μL,7 μL ddH2O。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)后交于北京華大基因公司測序。

    表2 PCR引物名稱及序列Table 2 The names and sequences of Primers

    1.3 系統(tǒng)發(fā)育分析

    使用Clustal X 1.8.3對目的序列進(jìn)行比對分析,空位(Gap)做缺失處理,利用Gblocks 0.91b對基因序列進(jìn)行剪切,手工調(diào)整完成校對。利用SquenceMatrix將Gblock得到的基因序列聯(lián)合。通過Shortcut to DAMBE進(jìn)行核酸飽和性檢驗(yàn),檢驗(yàn)序列是否適合構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹;使用軟件MrModeltest選擇最佳核苷酸替換模型,ITS最佳模型為GTR+G,psbA-trnH最佳模型為HKY+I+G,DMC1最佳模型為HKY+G,聯(lián)合序列在nex文件分區(qū),模型對應(yīng)如上。分別用MEGA6、PAUP 4.0、MrBayes 3.2.6進(jìn)行最大簡約法(MP)分析、最大似然法(ML)分析和貝葉斯法(BI)分析,構(gòu)建3種進(jìn)化樹。采用啟發(fā)式搜索對四組數(shù)據(jù)進(jìn)行1 000次隨機(jī)重復(fù)檢驗(yàn),TBR置換算法,得到的自展支持率用于評價(jià)最大似然樹和最大簡約樹的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的可靠性。使用MrBayes 3.2.6進(jìn)行貝葉斯推理法分析,替換模型采用MrModeltest的結(jié)果,位點(diǎn)間差異比率采用γ分布比率差異,其中部分為不變位點(diǎn),其余參數(shù)為默認(rèn)值,采用馬爾科夫—蒙特卡羅鏈數(shù)據(jù)模擬估算后驗(yàn)概率,數(shù)據(jù)運(yùn)行1 000 000代,取樣頻率為1 000,總結(jié)樹前舍棄25%老化樣本,計(jì)算最優(yōu)分支格局獲得發(fā)育樹的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu),以后驗(yàn)概率作為評估參數(shù)。

    1.4 分化時(shí)間計(jì)算

    用BEAST v1.8.4[27]進(jìn)行分化時(shí)間計(jì)算。首先對聯(lián)合序列進(jìn)行似然比檢驗(yàn)LRT(likelihood ratio test)確定該片段在各進(jìn)化枝中是符合嚴(yán)格分子鐘還是寬松分子鐘。利用BEAST1.8.4中的寬松分子鐘模型估算系統(tǒng)發(fā)育樹上的每個(gè)節(jié)點(diǎn)的分歧時(shí)間。依據(jù)已有的化石記錄和分子鐘估計(jì)的時(shí)間選擇兩個(gè)節(jié)點(diǎn)進(jìn)行標(biāo)定:(1)選用稻亞科和早熟禾亞科的分歧時(shí)間49.6 Ma;(2)短柄草族和小麥族的分歧時(shí)間33 Ma。選擇“Yule”進(jìn)化模型和GTR+G模型進(jìn)行運(yùn)算。四條馬爾科夫鏈(Markov Chain Monte Carlo)迭代計(jì)算100 000 000代,每1 000代進(jìn)行一次取樣,以保證參數(shù)posterior,prior和likelihood的有效取樣量(ESS)大于200。用軟件Tracer v1.6檢查收斂程度,最初的10 000代做為老化樣本舍去,用剩余樣本構(gòu)建時(shí)間尺度下的一致樹。用FigTree v1.4.2進(jìn)行處理,得到各分支的分化時(shí)間。

    1.5 生物地理學(xué)分析

    植物區(qū)系主要根據(jù)區(qū)系組成和植被類型進(jìn)行劃分,是一定區(qū)域內(nèi)所有植物種類的總和,是在一定的自然地理?xiàng)l件下發(fā)展演化的結(jié)果。根據(jù)吳征鎰的中國植物區(qū)系劃分方案,本研究所用材料可劃分為三個(gè)區(qū)域:A西北地區(qū)、B華北地區(qū)、C西南地區(qū)?;贐EAST1.8.4的trees文件,TreeAnnotator v1.8.4生成的tree文件以及統(tǒng)計(jì)的分布區(qū)信息,利用RASP(Reconstruct Ancestral State In Phylogenies)[28]軟件對短柄草族、雀麥族和小麥族進(jìn)行祖先分布區(qū)重建。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 系統(tǒng)發(fā)育分析

    基于nrITS、DMC1和聯(lián)合序列構(gòu)建的ML和BI系統(tǒng)發(fā)育樹具有一致的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu),稻為外類群,小麥族(Ⅰ)和雀麥族(Ⅱ)聚為一支互為姐妹群,短柄草族(Ⅲ)和這一支互為姐妹群。基于psbA-trnH構(gòu)建的ML和BI系統(tǒng)發(fā)育樹,短柄草族單獨(dú)聚為一支,雀麥族散布鑲嵌在小麥族內(nèi),共同聚為一支。系統(tǒng)發(fā)育圖如圖2,圖中支持率格式分別代表靴代值/后驗(yàn)概率。在nrITS、DMC1、psbA-trnH和聯(lián)合序列分別構(gòu)建的四個(gè)系統(tǒng)發(fā)育樹中,短柄草族的支持率都是100/100,高度支持該屬獨(dú)立成族。雀麥族在nrITS、DMC1和聯(lián)合序列分別構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹中的支持率都是100/100,小麥族在nrITS、DMC1和聯(lián)合序列分別構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹中的支持率分別是37/97,58/94,78/100,支持小麥族和雀麥族的成立,但是基于psbA-trnH構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹中,雀麥族鑲嵌在小麥族內(nèi),支持率為100/100,暗示小麥族和雀麥族有著多種進(jìn)化歷史,可能發(fā)生過葉綠體基因的漸滲或轉(zhuǎn)移等事件。

    圖2 小麥族、雀麥族和短柄草族系統(tǒng)發(fā)育圖 A.nrITS;B.psbA-trnH;C.DMC1;D.nrITS+psbA-trnH+DMC1 Ⅰ(小麥族):節(jié)節(jié)麥、冰草、黑紫披堿草、加拿大披堿草、圓柱披堿草、披堿草、垂穗披堿草、老芒麥、麥薲草、Elymus tsukushiensis、布頓大麥草、短芒大麥草、球莖大麥、大麥、窄穎賴草、濱麥、大賴草、賴草、纖毛鵝觀草、黑麥、普通小麥、圓錐小麥;Ⅱ(雀麥族):扁穗雀麥、雙雄雀麥、大麥狀雀麥、雀麥、旱雀麥;Ⅲ(短柄草族):二穗短柄草、草地短柄草、短柄草Fig.2 The Phylogenetic tree of Triticeae, Bromeae and Brachypodieae A.nrITS;B.psbA-trnH;C.DMC1;D.nrITS+psbA-trnH+DMC1 Ⅰ(Triticeae):Aegilops tauschii,Agropyron cristatum,Elymus atratus,Elymus canadensis,Elymus cylindricus,Elymus dahuricus,Elymus nutans,Elymus sibiricus,Elymus tangutorum,Elymus tsukushiensis,Hordeum bogdanii,Hordeum brevisubulatum,Hordeum bulbosum,Hordeum vulgare,Leymus angustus,Leymus mollis,Leymus racemosus,Leymus secalinus,Roegneria ciliaris,Secale cereale,Triticum aestivum,Triticum turgidum;Ⅱ(Bromeae): Bromus catharticus,Bromus diandrus,Bromus hordeaceus,Bromus japonicus,Bromus tectorum;Ⅲ(Brachypodieae):Brachypodium distachyum,Brachypodium pratense,Brachypodium sylvaticum

    圖3 短柄草族、雀麥族和小麥族各分支分歧時(shí)間圖Fig.3 Divergence time of Brachypodieae,Bromeae and Triticeae

    圖4 祖先分布區(qū)重建 A.西北地區(qū);B.華北地區(qū);C.西南地區(qū)Fig.4 The reconstruction of ancestral state A. Northwest region;B. North China;C. Southwest region

    2.2 分化時(shí)間計(jì)算

    經(jīng)LRT檢驗(yàn)選用貝葉斯寬松分子鐘計(jì)算,利用多個(gè)標(biāo)定點(diǎn)對聯(lián)合基因序列進(jìn)行分析,這不僅能克服單個(gè)基因片段可能對分子鐘造成的偏離影響,還可以彌補(bǔ)因?yàn)閱蝹€(gè)基因片段信息量不足所造成的缺陷。短柄草族、雀麥族和小麥族各分支分歧時(shí)間結(jié)果如圖3所示。短柄草族其主要類群起源于33.16 Ma漸新世(Oligocene)的魯培勒階(Rupelian),基部的二穗短柄草在8.08 Mya分化形成;雀麥族其主要類群起源于26.11 Mya的漸新世的恰特階(Chattian),基部類群在14.17 Mya分化形成;小麥族主要類群起源于21.68 Mya的中新世(Miocene)早期,其基部類群在9.52 Mya分化形成。鑒于各地質(zhì)時(shí)間年齡值在不斷修訂,本研究的地質(zhì)時(shí)期名稱及其時(shí)間劃分來自于國際地層委員會(huì)(International Commission on Stratigraphy)在2017年2月更新的數(shù)據(jù)[29]。

    2.3 祖先分布區(qū)重建

    通過對短柄草族、雀麥族、和小麥族的祖先分布區(qū)重建,RASP結(jié)果如圖4。我國分布的短柄草族植物最近共同祖先分布在我國西南地區(qū),小麥族和雀麥族組成小麥超族,最近共同祖先分布于我國西北地區(qū)。

    3 討論

    3.1 短柄草族系統(tǒng)學(xué)位置分析

    本研究基于nrITS、DMC1、psbA-trnH及其聯(lián)合序列對短柄草族的系統(tǒng)學(xué)位置進(jìn)行研究?;趎rITS、DMC1和聯(lián)合序列的結(jié)果高度支持短柄草屬成立短柄草族,這與Soreng[30~31]等人的結(jié)果相符合,也與Cheng等人[32]構(gòu)建的中國維管植物生命之樹相一致?;谌~綠體基因psbA-trnH的研究結(jié)果與其他基因片段及聯(lián)合序列結(jié)果沖突,表明小麥族與雀麥族有著復(fù)雜的進(jìn)化路線,且二者親緣關(guān)系較近,支持小麥族和雀麥族組成小麥超族。綜合以上結(jié)果,短柄草屬單屬成族,且最先分化出來,位于基部;其次,雀麥族和小麥族分化形成,二者相互為姐妹群,二者有著復(fù)雜的進(jìn)化路線。

    3.2 短柄草族生物地理學(xué)分析

    BEAST的分析結(jié)果顯示短柄草族位于三者的最基部,最先分化形成,分化時(shí)間是33.16 Ma,族下屬內(nèi)物種形成時(shí)間為二穗短柄草8.06 Ma,2.96 Ma短柄草與草地短柄草分化。在26.11 Ma雀麥族和小麥族開始分化,雀麥屬在26.11 Ma分化,賴草屬在21.68 Ma分化,大麥屬在20.16 Ma分化,冰草屬在20.16 Ma分化,披堿草屬在19.34 Ma分化,黑麥屬和小麥屬在15.68 Ma分化。結(jié)合地理地質(zhì)事件事件,青藏高原的隆升過程,可發(fā)現(xiàn)小麥族的屬下物種的形成大多集中在青藏高原的第三階段的隆升(7-13 Ma),在此階段青藏高原在西北地區(qū)發(fā)生抬升事件[33];短柄草族的物種形成時(shí)間在3 Ma之后,而青藏高原在3.6 Ma以來經(jīng)歷了地表強(qiáng)烈提升和高原快速擴(kuò)張,同時(shí)期的東亞季風(fēng)也在不斷加強(qiáng)[34]。中國特有種草地短柄草也是在此時(shí)間段分化形成。

    祖先分布區(qū)重建結(jié)果也表明,小麥族與雀麥族祖先同屬于北方干旱地區(qū),而短柄草族起源于濕潤的西南地區(qū)。現(xiàn)如今,短柄草族的分布也主要集中在濕潤多雨區(qū)域,如喜馬拉雅山脈南側(cè)是海洋性氣候,分布較多;而山脈北側(cè)是大陸性氣候,該族物種分布較少。短柄草族植物的共同祖先是古地中海分布的,隨著古地中海的收縮退卻和喜馬拉雅山脈的隆起,中亞和西亞逐漸干旱[35],部分短柄草屬植物退居在我國西南地區(qū),西南地區(qū)的橫斷山脈在第四紀(jì)冰川時(shí)期也是多種生物的避難所??梢酝茰y在古地中海收縮后,部分短柄草屬植物遷移到我國西南地區(qū),在第四紀(jì)冰川時(shí)期,氣候的反復(fù)變化和青藏高原的隆起影響下形成現(xiàn)有分布格局。通過野外采集調(diào)查和網(wǎng)上資料收集,發(fā)現(xiàn)短柄草屬植物的分布和我國山脈水系走向密切相關(guān),該屬植物主要分布在南北走向的橫斷山系和長江流域,東西走向的秦嶺和華南地區(qū)南北走向的山脈限制了該屬植物的擴(kuò)張。

    3.3 草地短柄草和短柄草進(jìn)化關(guān)系

    草地短柄草是我國特有種,但是與短柄草的關(guān)系一直存有疑問。在FOC被收錄,但外籍作者認(rèn)為可能是短柄草的局部變體,The plantlist和GBIF皆未收錄。本研究的結(jié)果表明3個(gè)不同地區(qū)的短柄草聚成一支,3個(gè)不同地區(qū)的草地短柄草聚成一支,支持草地短柄草這一物種的成立。通過查看對比中科院北京植物研究所標(biāo)本館和中科院西北高原生物研究所標(biāo)本館以及iDigBio[36]公布的英國邱園、法國國家植物標(biāo)本館、加利福尼亞科學(xué)院標(biāo)本館、柏林達(dá)勒姆標(biāo)本館、美國國家標(biāo)本館、猶他州立大學(xué)植物標(biāo)本館、密歇根大學(xué)標(biāo)本館、密蘇里植物園標(biāo)本館、北歐植物標(biāo)本館、奧斯陸大學(xué)自然歷史博物館、亞利桑那州立大學(xué)維管植物標(biāo)本館等標(biāo)本館的實(shí)物標(biāo)本和高清圖片,發(fā)現(xiàn)草地短柄草的具有小穗穗柄柄長大于2 mm的特點(diǎn)是該屬其他物種所不具有的。

    短柄草屬植物全球廣布,其屬下15~22種,起源于33 Ma左右,但在各國植物志和地方志的記載總和遠(yuǎn)超此數(shù)字,其屬下物種數(shù)目是亟待修訂的。短柄草屬植物起源于古地中海區(qū)域,但是具體的起源時(shí)間和地點(diǎn)有待深入考證,其在全球的分布成因也待進(jìn)一步研究。短柄草屬植物在我國西南地區(qū)廣泛分布,也分布在瀾滄江—怒江(湄公河—薩爾溫江分水嶺Mekong-Salween Divide)分水嶺的兩側(cè),其種群結(jié)構(gòu)需要進(jìn)一步的深入研究。

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