DNA/銀納米簇介導(dǎo)的功能核酸生物傳感器研究進(jìn)展

楊敏 李舒婷 楊文平 李相陽(yáng) 許文濤

（1. 北京農(nóng)學(xué)院食品科學(xué)與工程學(xué)院，北京 100083；2. 北京食品營(yíng)養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)，北京 100083）

貴金屬納米團(tuán)簇是由 Au、Ag和Pt 等貴金屬元素組成的分子聚集體，一般由幾個(gè)到幾十個(gè)原子組成。金屬納米團(tuán)簇的理化性質(zhì)對(duì)其物理尺寸有強(qiáng)烈的依賴性，當(dāng)尺寸接近電子的費(fèi)米波長(zhǎng)（金和銀約0.5 nm），連續(xù)的密度態(tài)分裂成類似于分子的不連續(xù)的能級(jí)，與激發(fā)光相互作用時(shí)電子能夠在能級(jí)之間轉(zhuǎn)換，進(jìn)而能發(fā)出強(qiáng)烈的熒光［1］，顯現(xiàn)出獨(dú)特的電學(xué)和光學(xué)性能［2］。其中，以DNA為模板的銀納米簇（Ag NCs）由于其高熒光量子產(chǎn)率（> 50%），良好的光穩(wěn)定性，低毒性，生物相容性，易合成等優(yōu)點(diǎn)而引起了廣泛關(guān)注［3］?；诖耍疚膶?duì)DNA / Ag NCs在生物傳感器及其應(yīng)用方面的研究展開(kāi)綜述，并著重介紹了其在細(xì)胞成像及抑菌方面的應(yīng)用，最后總結(jié)了DNA / Ag NCs生物傳感器目前存在的不足和未來(lái)發(fā)展的趨勢(shì)，以期為研究者提供借鑒。

1 DNA/銀納米簇的制備及基本性質(zhì)

1.1 DNA/銀納米簇的制備方法

DNA，特別是胞嘧啶堿基C與銀離子之間有強(qiáng)烈的親和性［4］，有證據(jù)表明迄今為止最成功的AgNCs就是用 DNA 為模板合成的，這種強(qiáng)烈親和性使得銀離子能夠維持雙鏈DNA的胞嘧啶之間C-C的錯(cuò)配［5］。并且該方法制備條件溫和，制備的銀納米簇?zé)晒庑再|(zhì)穩(wěn)定，生物相容性好，這些優(yōu)點(diǎn)使得DNA穩(wěn)定的銀納米簇的研究最為廣泛。

Zheng等［6］首次報(bào)道了用DNA為模板合成熒光銀納米簇，以含有12個(gè)堿基5'-AGGTCGCCGCCC-3'的DNA序列為模板，磷酸緩沖液為反應(yīng)體系的緩沖液，NaBH4作為還原劑，在冰浴條件下合成了熒光銀納米簇，制備出的熒光銀納米簇穩(wěn)定性好、溶于水、顆粒均勻。該Ag NCs在400 nm-550 nm有強(qiáng)的紫外吸收峰，在630 nm左右有熒光發(fā)射，質(zhì)譜數(shù)據(jù)顯示所合成的Ag NCs只有1-4個(gè)Ag原子。后續(xù)的多次研究又強(qiáng)調(diào)了堿基種類、堿基序列以及 DNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)對(duì)合成DNA穩(wěn)定的Ag NCs的關(guān)鍵作用［7-10］。隨后 O’Neill等［11］報(bào)道了用發(fā)卡狀 DNA（環(huán)上含 3-12個(gè)C）合成發(fā)熒光的Ag NCs，結(jié)果表明，環(huán)上C的數(shù)量可以調(diào)節(jié)所得Ag NCs的穩(wěn)定性和熒光。因此，很多用于合成 DNA / Ag NCs 的模板都是富含胞嘧啶的單鏈DNA（ssDNA）或者是包含一段C環(huán)的發(fā)夾結(jié)構(gòu) DNA 和雙鏈DNA（dsDNA）。之后，Huang等［12］發(fā)現(xiàn)含錯(cuò)配堿基對(duì)的雙鏈DNA 也被用于位點(diǎn)特異性的Ag NCs的合成，分子規(guī)模的Ag NCs位于錯(cuò)配堿基對(duì)附近，而整體DNA還保持完整結(jié)構(gòu)。

1.2 DNA/銀納米簇的表征

由于合成Ag NCs的DNA寡核苷酸的單分散性，使用電噴霧質(zhì)譜（Electrospray ionization mass spectrometry，ESI-MS）可以精確地確定納米團(tuán)簇的化學(xué)計(jì)量學(xué)［13］。紫外-可見(jiàn)吸收光譜可以用來(lái)測(cè)定Ag NCs的最大吸收波長(zhǎng)；熒光光譜可通過(guò)熒光分光光度計(jì)來(lái)獲得，從而獲得Ag NCs的熒光發(fā)射情況；Ag NCs的形貌和大小可借助透射電子顯微鏡（Transmission electron microscopy，TEM）來(lái)觀察和測(cè)量［14］。紫外可見(jiàn)光譜和圓二色光譜均可用來(lái)探討Ag NCs的結(jié)構(gòu)變化及其熒光變化機(jī)制［15］。

2 多色DNA/銀納米簇的調(diào)控機(jī)制

Ag NCs周圍的配體/堿基環(huán)境是決定熒光發(fā)射顏色的重要因素，成核序列不同以及靠近Ag NCs的序列（增強(qiáng)子序列）不一樣，Ag NCs產(chǎn)生的熒光都可能會(huì)不一樣。目前DNA / AgNCs的熒光發(fā)射有四種主要的顏色，分別為紅、黃、藍(lán)、綠，如圖1所示。此外還有近紅外發(fā)射光。據(jù)報(bào)道，DNA / AgNCs由一個(gè)由Ag+離子包圍的核心/群中性Ag原子組成。中性原子的數(shù)目決定了原子團(tuán)簇的發(fā)射波長(zhǎng)，而Ag+離子將核心和DNA堿基“黏合”在一起［16-17］。Copp等［18］先前證明綠色和紅色發(fā)射往往分別與4個(gè)和6個(gè)中性核心銀原子有關(guān)。此后，該團(tuán)隊(duì)又基于質(zhì)譜分析，發(fā)現(xiàn)DNA / Ag NCs的紅色發(fā)射極含有6個(gè)中性的Ag原子和8個(gè)Ag+離子，綠色發(fā)射極含有4個(gè)中性的Ag原子。這意味著兩個(gè)Ag原子從原始紅色發(fā)射極的核心氧化成Ag+，從而導(dǎo)致熒光顏色的轉(zhuǎn)變［19］。

圖1 DNA/銀納米簇4種主要的熒光顏色

Dickson課題組［20］以不同的DNA序列為模板合成的具有不同顏色的熒光發(fā)射的熒光銀納米簇光譜，如表1所示，這些銀納米簇模板都以C12為基礎(chǔ)，通過(guò)變動(dòng)中間部分的堿基類型和順序，合成的熒光銀納米簇的熒光發(fā)射光譜從可見(jiàn)光區(qū)域跨越到近紅外區(qū)域。

表1 五種不同單鏈DNA序列為模板穩(wěn)定的銀納米簇的發(fā)射光

Sengupta等［21］小組利用3種不同序列的DNA（dT12、dT4C4T4和dC4T4C4）探討了銀納米簇的激發(fā)波長(zhǎng)對(duì)堿基序列的選擇性。光譜分析表明以聚T堿基的DNA為模板合成的銀納米簇發(fā)出藍(lán)色或綠色熒光，而以聚C堿基的DNA為模板的銀納米簇除了可以發(fā)出藍(lán)、綠熒光，還可以發(fā)出紅色熒光。對(duì)dC4T4C4進(jìn)行了研究表明簇的形成取決于寡核苷酸的濃度，較高的濃度有利于紅色熒光的產(chǎn)生，在較低濃度的dC4T4C4中，一種藍(lán)色/綠色的熒光納米簇占主導(dǎo)地位。

2011年，Yeh團(tuán)隊(duì)［22］表明當(dāng)DNA / Ag NCs與富含鳥嘌呤的DNA鏈靠近時(shí)，可以使Ag NCs的熒光從無(wú)到有，發(fā)出強(qiáng)的紅色熒光，或使紅色熒光增強(qiáng)，這依賴于Forster能量轉(zhuǎn)移作為熒光開(kāi)/關(guān)（on /off）切換機(jī)制，且鳥嘌呤N7位點(diǎn)在觀察到的紅色熒光增強(qiáng)中起關(guān)鍵作用。當(dāng)Ag NCs與富含胸腺嘧啶的DNA鏈鄰近時(shí)，產(chǎn)生綠色熒光增強(qiáng)，而富含腺嘌呤的DNA鏈鄰近時(shí)沒(méi)有產(chǎn)生任何可測(cè)量的熒光增強(qiáng)。

Li等［23］的研究表明，在充滿高密度葡聚糖的擁擠環(huán)境中制備的銀納米團(tuán)簇與水溶液相比，具有更小的粒徑和更高的熒光量子產(chǎn)率。Cerretani等［24］的研究表明，5'-TTCCCACCCACCCCGGCCCGT-3'能穩(wěn)定紅色和綠色發(fā)射極，并可通過(guò)加入H2O2或NaBH4引發(fā)兩團(tuán)簇之間的切換。此外，一些非熒光中間體物質(zhì)的形成會(huì)限制兩個(gè)發(fā)射器之間的完全可逆性。

3 DNA/銀納米簇介導(dǎo)的功能核酸傳感器

3.1 DNA/銀納米簇介導(dǎo)的“turn-on”型功能核酸熒光生物傳感器

核酸探針是指帶有標(biāo)記物的序列已知的核酸片段，它可以與其互補(bǔ)的核酸序列雜交形成雙鏈。以DNA為模板生成的Ag NCs是目前一種新興的熒光探針，它比半導(dǎo)體量子點(diǎn)具有更小的體積，并且能比常用的有機(jī)染料有更好的光穩(wěn)定性和亮度［16］。當(dāng)Ag NCs足夠小時(shí)，它們表現(xiàn)出很強(qiáng)的光吸收和發(fā)射能力，這使得它們幾乎成為單分子光譜中理想的熒光基團(tuán)［22］。另外，Ag NCs由于其光譜特性高度依賴于DNA的序列和結(jié)構(gòu)，已被研究者廣泛應(yīng)用于構(gòu)建功能核酸熒光生物傳感器來(lái)進(jìn)行生物分析。

3.1.1 無(wú)信號(hào)放大策略 在2011年，Kun等［25］發(fā)現(xiàn)DNA雙鏈中的堿基缺失位點(diǎn)（AP位點(diǎn)）可以作為Ag NCs生成的支架，在含AP位點(diǎn)的DNA雙鏈中，熒光Ag NCs的形成對(duì)AP位點(diǎn)表面的胞嘧啶和位點(diǎn)側(cè)面的鳥嘌呤具有高度選擇性。基于Ag NCs形成對(duì)AP位點(diǎn)微環(huán)境的依賴性，作者構(gòu)建了一個(gè)“signalon”熒光傳感平臺(tái)用于DNA單核苷酸多態(tài)性（Singlenucleotide polymorphism，SNP）的檢測(cè)。當(dāng)存在靶標(biāo)鏈時(shí)，靶標(biāo)鏈與探針結(jié)合，在AP位點(diǎn)處可形成Ag NCs，在670 nm波長(zhǎng)處發(fā)出強(qiáng)熒光；當(dāng)靶標(biāo)鏈發(fā)生單堿基突變時(shí)，在AP位點(diǎn)處無(wú)法生成Ag NCs，無(wú)熒光產(chǎn)生。熒光Ag NCs對(duì)AP位點(diǎn)周圍序列的強(qiáng)烈依賴性已成功地用于鑒定癌癥抑制基因p53的密碼子177中的突變。

Zhu等［26］開(kāi)發(fā)了一種新型的DNA / Ag NCs探針，用于基于TdT介導(dǎo)的聚合和支架鏈置換反應(yīng)的原位凋亡細(xì)胞檢測(cè)和成像。為了制備開(kāi)啟熒光DNA/ AgNC探針，應(yīng)用含有兩個(gè)結(jié)構(gòu)域I和II的單鏈DNA S1。富含胞嘧啶的結(jié)構(gòu)域I對(duì)Ag+表現(xiàn)出強(qiáng)親和力，可以容易地制備熒光核酸穩(wěn)定的Ag NCs。由于結(jié)構(gòu)域II與BHQ標(biāo)記的DNA S2部分雜交，猝滅劑位于Ag NCs附近，通過(guò)熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）有效淬滅DNA / Ag NCs的熒光。在凋亡細(xì)胞的細(xì)胞核中，TdT分別使用DSB和dATP作為引物和底物，將poly-dA添加到DSB的3'-OH末端。然后，細(xì)長(zhǎng)的poly-dA鏈與DNA / Ag NCs探針的3'ploy-T突出端雜交，并啟動(dòng)前端鏈置換。由靶poly-dA DNA鏈引發(fā)的鏈置換從DNA / Ag NC探針釋放猝滅劑標(biāo)記的DNA，導(dǎo)致DNA / Ag NCs的顯著熒光點(diǎn)亮，用于敏感檢測(cè)細(xì)胞凋亡。該方法可以在體外檢測(cè)至少20個(gè)凋亡細(xì)胞。

3.1.2 有信號(hào)放大策略

3.1.2.1 鳥嘌呤接近 根據(jù)鳥嘌呤靠近使得熒光增強(qiáng)呈現(xiàn)的是一種“turn-on”的模式，當(dāng)不存在目標(biāo)分析物時(shí)，熒光銀納米簇與富含鳥嘌呤的增強(qiáng)序列是呈現(xiàn)完全分離的狀態(tài)，所以背景熒光信號(hào)非常低。Yeh等［27］發(fā)現(xiàn)以CCCTTAATCCCC為模板合成的銀納米簇，當(dāng)模版延長(zhǎng)部分序列與一段包含有富G序列的DNA雜交后，能夠得到熒光強(qiáng)度增強(qiáng)了500倍的紅色熒光銀簇。在此基礎(chǔ)上，該團(tuán)隊(duì)還設(shè)計(jì)一個(gè)變色的銀納米簇探針（cNCB），在銀納米簇、富G序列和待測(cè)序列同時(shí)存在時(shí)產(chǎn)生橘色的銀納米簇?zé)晒?，而?dāng)待測(cè)序列的其中一個(gè)堿基發(fā)生突變后會(huì)產(chǎn)生紅色的銀納米簇?zé)晒?，兩種不同情況下合成的銀納米簇?zé)晒獍l(fā)射波長(zhǎng)卻相差幾十納米，因而實(shí)現(xiàn)對(duì)單堿基突變的檢測(cè)［28］。

Li等［29］提出了一種結(jié)合誘導(dǎo)熒光激活法來(lái)檢測(cè)α-淀粉酶，使用兩種適體（Apt15和Apt29），并通過(guò)序列元件進(jìn)行修飾。使用12個(gè)核苷酸序列將第一個(gè)適體與5'末端的納米簇成核序列連接起來(lái)。第二個(gè)適體通過(guò)互補(bǔ)序列與3'末端的富含G的突出端連接。兩個(gè)適體探針與靶蛋白的結(jié)合啟動(dòng)與每個(gè)適體連接的互補(bǔ)接頭序列之間的雜交，從而使富含G的突出端與Ag NCs緊密接近，導(dǎo)致顯著的熒光增強(qiáng)。通過(guò)該方法，對(duì)于人α-凝血酶，實(shí)現(xiàn)了1 nmol/L的檢測(cè)限和5 nmol/L-2 μmol/L的線性動(dòng)態(tài)范圍。

3.1.2.2 金屬離子 Zhang等［30］報(bào)道了基于DNA /Ag NCs的信號(hào)增強(qiáng)熒光適體傳感器，用于同時(shí)檢測(cè)赭曲霉毒素A（Ochratoxin a，OTA）和黃曲霉毒素B 1（AFB 1）。在添加Zn2+后，熒光強(qiáng)度明顯增加，從而使OTA的檢出限低至0.2 pg/mL，AFB1的檢出限低至0.3 pg/mL。Lee等［31］用Ag+來(lái)觸發(fā)DNA/ Ag NCs的熒光從弱紅色轉(zhuǎn)換為強(qiáng)綠色來(lái)檢測(cè)Ag+。Ag+通過(guò)在兩個(gè)Cyt12/ Ag NCs之間形成橋，誘導(dǎo)Cyt12/ Ag NCs二聚體結(jié)構(gòu)的形成，這種二聚體的形成使Cyt12-Ag NCs的熒光從紅色變?yōu)榫G色。使用這種Ag+觸發(fā)的熒光轉(zhuǎn)換可檢測(cè)到濃度低至10 nmol/L的Ag+。

3.1.2.3 與其他納米材料結(jié)合 Khan等［32］開(kāi)發(fā)了一種基于適配體銀納米簇（DNA / Ag NCs）/二硫化鉬納米片（MoS2）的熒光檢測(cè)真菌毒素T-2的方法。使用的DNA鏈包含3段，包括穩(wěn)定銀簇片段（C12）、連接片段和T-2毒素適配體片段。以此DNA合成發(fā)紅色熒光的銀納米簇會(huì)吸附到二硫化鉬納米片表面，通過(guò)熒光共振能量轉(zhuǎn)移（Fluorescence resonance energy transfer，F(xiàn)RET），造成熒光猝滅。而目標(biāo)物存在時(shí)，由于適配體作用，會(huì)把銀簇從納米片表面拉開(kāi)，F(xiàn)RET作用失效，熒光恢復(fù)?；诖嗽恚瑢?duì)T-2進(jìn)行了靈敏性檢測(cè)。動(dòng)態(tài)定量范圍為0.005 ng/mL-500 ng/mL，檢測(cè)線為0.93 pg/mL。

3.2 DNA/銀納米簇介導(dǎo)的“turn-off”型功能核酸生物傳感器

3.2.1 生物大分子 Yang等［33］利用DNA納米銀簇（DNA / Ag NCs）的熒光特性，開(kāi)發(fā)了一種能夠高特異性檢測(cè)靶miRNA存在的DNA / Ag NCs探針。首先設(shè)計(jì)了一條DNA序列，它具有針對(duì)靶miRNA的特異性互補(bǔ)序列和用于產(chǎn)生紅色發(fā)射Ag NCs的12個(gè)核苷酸的支架。當(dāng)存在靶miRNA時(shí)，DNA /Ag NCs探針的發(fā)射顯著低于不存在靶miRNA或其他miRNA的情況。

作為生物硫醇，Cys在其參與可逆氧化還原反應(yīng)、解毒和代謝過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用。Wang等［34］開(kāi)發(fā)了一種簡(jiǎn)單的Cys檢測(cè)方法，檢測(cè)系統(tǒng)由DNA / Ag NCs和Cys檢測(cè)靶組成。DNA鏈由成核序列和富含G的適體序列組成，富含G序列的存在可以顯著增強(qiáng)Ag NCs的熒光信號(hào)，利用此DNA鏈作為模板合成一種具有強(qiáng)熒光信號(hào)的銀簇納米材料。在Cys或其他生物硫醇的存在下，由于S-Ag鍵的產(chǎn)生，DNA / Ag NCs的熒光可以被強(qiáng)烈猝滅。該方法對(duì)Cys的線性檢測(cè)范圍為0.1 nmol/L-100 nmol/L，檢測(cè)限為0.05 nmol/L。

3.2.2 金屬離子 Peng等［35］設(shè)計(jì)了一種新的熒光寡核苷酸穩(wěn)定的銀納米團(tuán)簇（DNA / Ag NCs）探針，用于靈敏檢測(cè)汞和銅離子。該探針含有兩個(gè)定制的DNA序列。一種是信號(hào)探針，其含有富含胞嘧啶的序列模板，用于Ag NCs合成和兩端的連接序列。另一種是富含鳥嘌呤的序列，用于信號(hào)增強(qiáng)和與信號(hào)探針的連接序列互補(bǔ)的連接序列。雜交后，基于DNA / Ag NCs在富含鳥嘌呤的DNA序列附近的熒光增強(qiáng)效應(yīng)，雜交的雙鏈DNA / Ag NCs的熒光增強(qiáng)了200倍并且比單鏈DNA / Ag NCs穩(wěn)定。在Hg2+或Cu2+存在的情況下可以猝滅其熒光，因此可以用作檢測(cè)汞和銅離子的新型熒光探針，線性檢測(cè)6.0-160.0和6 nmol/L-240 nmol/L范圍內(nèi)的汞和銅離子，檢測(cè)限分別為2.1 nmol/L和3.4 nmol/L。

3.2.3 小分子 Ding等［36］提出了DNA模板銅/銀納米簇（DNA-Cu / Ag NCs）熒光探針用于選擇性檢測(cè) S2-。 用 DNA 模 板（5'-CCCTTAATCCCC-3'） 合成具有優(yōu)異熒光特性的DNA-Cu / Ag NCs熒光探針。然而，一旦引入含有S2-的溶液，由于硫離子與銀和銅原子具有強(qiáng)親和力，熒光DNA-Cu / Ag NCs探針的結(jié)構(gòu)變化誘導(dǎo)其熒光淬滅。通過(guò)DNA-Cu / Ag NCs檢測(cè)的熒光強(qiáng)度的變化定量檢測(cè)S2-的濃度。所提出的方法允許在10 pmol/L-1 mmol/L的S2-濃度范圍內(nèi)使用，檢測(cè)線為3.75 pmol/L。

3.3 DNA/銀納米簇介導(dǎo)的“比率型”功能核酸熒光生物傳感器

大多數(shù)Ag NCs只具有單一的熒光信號(hào)，阻礙了Ag NCs探針的實(shí)際應(yīng)用和發(fā)展。因此，具有多個(gè)發(fā)射峰的變色龍Ag NCs為敏感的比率目標(biāo)檢測(cè)提供了一種新的可能性。Zhou等［15］設(shè)計(jì)了一種新型的變色龍DNA模板Ag NCs，其熒光顏色可以通過(guò)互補(bǔ)DNA、非熒光輔助Ag NCs和Mg2+的調(diào)控在黃色、橙色和紅色之間進(jìn)行切換。以A20-C55為模板的Ag NCs（A20-C55-NC）在磷酸鹽緩沖溶液中具有強(qiáng)黃色熒光（Y信號(hào)）。當(dāng)通過(guò)模板雜交靠近無(wú)熒光輔助Ag NCs時(shí)，Y信號(hào)減少而新的紅色發(fā)射（R信號(hào)）上升，導(dǎo)致Ag NCs溶液從黃色到紅色的顯著顏色變化；另一方面，A20-C55-NC與互補(bǔ)DNA（T20）的雜交大大增強(qiáng)了Y信號(hào)；而A20-C55-NC在Mg2+存在下同時(shí)顯示出具有相同強(qiáng)度的R和Y信號(hào)；因此，變色龍Ag NCs實(shí)現(xiàn)了可控的多色熒光變化，無(wú)論是在雙鏈還是發(fā)夾形結(jié)構(gòu)，比率探針都顯示出具有納摩爾敏感性的信號(hào)響應(yīng)指數(shù)生長(zhǎng)。

Wang等［37］構(gòu)建了一種為單一熒光團(tuán)的新型比率熒光納米傳感器已成功構(gòu)建，用于超靈敏和特異性檢測(cè)Pb2+。G-DNA的G1區(qū)段與R-DNA的R1區(qū)段雜交，形成含有Pb2+依賴的DNAzyme的雙鏈體。G-DNA的G2區(qū)段模板化Ag NCs（G-DNA / Ag NCs）發(fā)射綠色熒光。同時(shí)，G2-1的片段與R2-1片段的雜交，不僅有助于穩(wěn)定Pb2+依賴的DNAzyme的構(gòu)型而且還使R2富G序列接近形成的G-DNA / Ag NCs，將綠色發(fā)射G-DNA / Ag NCs轉(zhuǎn)化為紅色。dsDNA/ Ag NCs含有Pb2+依賴的DNAzyme的rA切割位點(diǎn)，在Pb2+存在下，特異性DNA片段將從dsDNA/ Ag NCs釋放，導(dǎo)致DNA / Ag NCs從紅色變?yōu)榫G色，由于Pb2+可以連續(xù)切割rA位點(diǎn)，因此從紅色到綠色發(fā)射的信號(hào)變化被放大。該傳感器從0.001 nmol/L-10 nmol/L表現(xiàn)出良好的線性關(guān)系，Pb2+測(cè)定的檢出限為1.0 pmol/L，低于大多數(shù)檢測(cè)Pb2+生物傳感器。

3.4 DNA/銀納米簇介導(dǎo)的功能核酸電化學(xué)生物傳感器

電化學(xué)生物傳感器因具有操作簡(jiǎn)單、穩(wěn)定性好、靈敏度高、可實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)等優(yōu)點(diǎn)，在食品安全、環(huán)境檢測(cè)、轉(zhuǎn)基因測(cè)定、醫(yī)藥工業(yè)等領(lǐng)域日益得到了科研工作者的重視。而金屬納米粒子一般具有較好的導(dǎo)電性能，催化性能及吸附能力，可以大大提高傳感器的靈敏度。Jie等［38］利用雙功能Ag NCs和多重?cái)U(kuò)增策略，合成了新型Ag NCs并將其用作多功能電化學(xué)發(fā)光和電化學(xué)信號(hào)探針。在長(zhǎng)dsDNA模板修飾的電極上原位合成了大量Ag NCs，放大了電化學(xué)發(fā)光信號(hào)，用于靈敏檢測(cè)凝血酶。DPV峰電流顯示出與1.0 fmol/L-10.0 nmol/L的目標(biāo)濃度的對(duì)數(shù)線性依賴性，測(cè)限在3σ時(shí)為0.1 fmol/L。

Quan等［39］開(kāi)發(fā)了一種基于銀納米團(tuán)簇（Ag NCs）/辣根過(guò)氧化物酶（Horseradish peroxidase，HRP）納米復(fù)合物（Ag NCs-HRP）的納米探針，用于癌胚抗原（Carcino-embryonic antigen，CEA）的電化學(xué)檢測(cè)。通過(guò)含有CEA適體和C12的DNA模板合成Ag NCs。隨著HRP吸附到Ag NCs上，形成了可以與CEA特異性結(jié)合的納米探針（Ag NCs-HRP）。將抗CEA抗體，CEA和納米探針依次裝配到電極表面后，電極表面的HRP可催化3，3'-二甲氧基聯(lián)苯胺（DB）聚合形成PDB絕緣聚合物薄膜。因此，F(xiàn)e（CN）63-/4-溶液中電極的氧化還原電流減小，并且降低的氧化還原電流與檢測(cè)到的CEA濃度成比例，實(shí)現(xiàn)了對(duì)CEA檢測(cè)的高靈敏度。降低的電流與CEA在1 pg-10 ng/mL范圍內(nèi)的濃度呈對(duì)數(shù)關(guān)系，檢測(cè)限為0.5 pg/mL。

3.5 DNA/銀納米簇介導(dǎo)的其他類型功能核酸生物傳感器

3.5.1 溫度傳感器 大多數(shù)的溫敏材料只有單一的信號(hào)響應(yīng)，沒(méi)有更好的熒光穩(wěn)定性和對(duì)比度。Oemrawsingh和 Zhao等［40-41］的研究為 Ag NCs的熒光受溫度變化的調(diào)控提供了明確的證據(jù)，但熒光Ag NCs對(duì)溫度并沒(méi)有明顯的線性響應(yīng)。Zhou等［42］首次報(bào)道了一種新型的雙熒光溫度敏感型DNA模板化Ag NCs對(duì)，成功地指示了活細(xì)胞的溫度，并且證明了溫度誘導(dǎo)的熒光響應(yīng)是由于DNA模板的雜交和去雜交引起的Ag NCs對(duì)的整合和分離。用兩個(gè)富含C的DNA支架合成銀納米簇（A1-NC，A2-NC），由于A1和A2具有互補(bǔ)序列，使A1-NC，A2-NC彼此靠近，從而獲得了對(duì)溫度敏感的銀納米簇對(duì)（A-NCP）。A-NCP在 640 nm（A-FL640） 和 570 nm（A-FL570）處呈現(xiàn)兩個(gè)明亮的發(fā)射帶，而B-NCP在685 nm（B-FL685）和620 nm（B-FL620）處實(shí)現(xiàn)熒光峰值。隨著溫度的升高，A-NCP（A-FL570）的熒光發(fā)射增加，A-FL640減少；B-NCP（B-FL685和B-FL620）的熒光發(fā)射同時(shí)降低。因此，A-NCP熒光顏色顯示出從橙色到黃色的變化，而B-NCP的熒光顏色從橙色變?yōu)闊o(wú)色，實(shí)現(xiàn)了對(duì)應(yīng)于15-45℃溫度的敏感變化。此外，發(fā)夾型（AH和BH）模板合成的銀納米簇的熒光對(duì)溫度也有類似的響應(yīng)效果。

3.5.2 石英晶體微量天平生物傳感器 Zhou等［43］開(kāi)發(fā)了一種新型石英晶體微量天平（QCM）生物傳感器，以DNA / Ag NCs作為高效信號(hào)放大器，實(shí)現(xiàn)了對(duì)核酸進(jìn)行高靈敏度和無(wú)標(biāo)記的檢測(cè)。用探針DNA對(duì)QCM進(jìn)行修飾，使其特異性地捕獲目標(biāo)DNA。然后，將DNA模板化的Ag NCs組裝起來(lái)，通過(guò)與DNA骨架相連的Ag+增強(qiáng)QCM傳感器的靈敏度，然后氫醌誘導(dǎo)Ag NCs的還原形成。用TEM和AFM進(jìn)一步證實(shí)了DNA模板化Ag NCs的形成。結(jié)果表明，在這種放大模式下，QCM傳感器的頻率響應(yīng)高達(dá)87倍。頻率響應(yīng)與DNA濃度在0.6 nmol/L-30 nmol/L范圍內(nèi)呈線性關(guān)系，檢出限為0.1 nmol/L。

3.5.3 智能邏輯生物傳感器 作為信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)器，DNA / Ag NCs優(yōu)于有機(jī)染料和量子點(diǎn)，因?yàn)镈NA /Ag NCs的使用不僅避免了DNA與信號(hào)指示劑的共價(jià)標(biāo)記，而且更容易被引入DNA邏輯系統(tǒng)［44］。這些內(nèi)在特性賦予DNA / Ag NCs在并行/級(jí)聯(lián)邏輯門和計(jì)算電路的開(kāi)發(fā)中具有前景的應(yīng)用。

Zhang等［45］構(gòu)造了基于銀納米團(tuán)簇（Ag NCs）/氧化石墨烯（GO）的一系列邏輯電路以執(zhí)行非算術(shù)功能，包括3位、4位和5位奇數(shù)/偶數(shù)檢查，由此產(chǎn)生的設(shè)備可以區(qū)分0-31范圍內(nèi)的偶數(shù)和奇數(shù)十進(jìn)制數(shù)。另外，這些裝置可以在生物基質(zhì)中穩(wěn)定地執(zhí)行它們的邏輯操作，表明基于Ag NCs / GO的系統(tǒng)可以在復(fù)雜的生物環(huán)境中操作。Fan等［44］結(jié)合GO對(duì)DNA模板化Ag NCs的猝滅能力和G-四鏈體增強(qiáng)的卟啉染料熒光強(qiáng)度，首次構(gòu)建了無(wú)標(biāo)簽、無(wú)酶的2-to-1、4-to-2編碼器和1-to-2解碼器。此外，Lin等［46］首次將DNA / Ag NCs的多路復(fù)用器用作智能生物傳感器，以高靈敏度識(shí)別大腸桿菌和金黃色葡萄球菌致病基因，在通用平臺(tái)上集成多個(gè)DNA邏輯門，實(shí)現(xiàn)了先進(jìn)的邏輯功能。該研究簡(jiǎn)單易用，為多分子器件的集成和智能診斷提供了一種有指導(dǎo)意義的方法。

4 DNA/銀納米簇介導(dǎo)的功能核酸生物傳感器的應(yīng)用

4.1 DNA/銀納米簇用于胞內(nèi)成像

在過(guò)去的20年中，具有分子樣能級(jí)的少數(shù)原子貴金屬納米團(tuán)簇已經(jīng)成為具有顯著光電性質(zhì)的新型熒光團(tuán)［47］。由于DNA / Ag NCs易于合成的途徑，良好的光穩(wěn)定性和生物相容性以及高量子產(chǎn)率的優(yōu)良特性，使其成為許多應(yīng)用的有力候選者，特別是在生物成像方面［48］。

4.1.1 細(xì)胞成像 靈敏、特異的腫瘤細(xì)胞檢測(cè)不僅對(duì)腫瘤的早期診斷，而且對(duì)腫瘤轉(zhuǎn)移的研究具有重要意義。Ai等［49］利用AS1411為模板來(lái)合成銀納米團(tuán)簇以發(fā)掘其潛在應(yīng)用。在形成銀納米團(tuán)簇后，AS1411仍然保持其結(jié)構(gòu)并且能夠與癌細(xì)胞中的核仁蛋白結(jié)合。同時(shí)，這種結(jié)合可以極大地增強(qiáng)銀納米團(tuán)簇的熒光強(qiáng)度。該性質(zhì)可直接用于HeLa細(xì)胞的生物成像。

Li等［50］受到真核細(xì)胞核中普遍存在的端粒含有重復(fù)DNA序列TTAGGG的啟發(fā)，基于DNA /Ag NCs在細(xì)胞核內(nèi)的原位熒光激活作用，開(kāi)發(fā)了一種新穎、簡(jiǎn)便、無(wú)標(biāo)記、特異性和通用的細(xì)胞核成像方法。NC-a模板化的Ag NCs和富含G的b序列將通過(guò)與DNA探針C-ab互補(bǔ)而聚集在一起。從而使Ag NCs的熒光激活。此外，研究者還根據(jù)端粒的重復(fù)序列TTAGGG設(shè)計(jì)了具有不同富含G序列的5個(gè)探針。結(jié)果表明，在C-ab存在下，所有五種探針均可作為Ag NCs的有效熒光增強(qiáng)劑，從而進(jìn)一步驗(yàn)證了無(wú)熒光的Ag NCs可以通過(guò)端粒序列激活。然后用CEM細(xì)胞作為模型，流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定顯示無(wú)熒光的Ag NCs可以快速進(jìn)入細(xì)胞并且在沒(méi)有洗滌的簡(jiǎn)單孵育后，熒光被強(qiáng)烈激活，實(shí)現(xiàn)了原位細(xì)胞成像。

Yin等［51］提出了一種基于識(shí)別誘導(dǎo)的適配體構(gòu)象改變從而使富含鳥嘌呤的DNA序列靠近DNA /Ag NCs，利用熒光增強(qiáng)效應(yīng)來(lái)檢測(cè)癌細(xì)胞的策略。DNA探針是發(fā)夾結(jié)構(gòu)，由3'端的目標(biāo)特異性適配體序列、富含鳥嘌呤的DNA序列和5'端的臂段（表示為識(shí)別探針）組成。另一個(gè)作為信號(hào)探針，包含一個(gè)用于Ag NCs模板合成的序列和一個(gè)與識(shí)別探針的ARM段互補(bǔ)的鏈接序列。適體與癌細(xì)胞的識(shí)別和結(jié)合迫使識(shí)別探針進(jìn)行構(gòu)象改變，進(jìn)而啟動(dòng)識(shí)別探針的臂段與信號(hào)探針的連接序列之間的雜交。然后Ag NCs靠近富含G的DNA，從而增強(qiáng)熒光。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該策略采用特異性適配體sgc8c能對(duì)CCRF-CEM細(xì)胞進(jìn)行特異性成像，在200 μL結(jié)合緩沖液中檢測(cè)到低至150個(gè)CCRF-CEM細(xì)胞。

4.1.2 酶活檢測(cè) Huang等［52］構(gòu)建了一種新型熒光報(bào)告基因，可以實(shí)現(xiàn)端粒酶活性的檢測(cè)。此外，探針成功用于區(qū)分正常細(xì)胞和癌細(xì)胞，并監(jiān)測(cè)用抑制模型藥物治療后的實(shí)時(shí)端粒酶活性反應(yīng)。低熒光的H-Ag NCs探針設(shè)計(jì)含有3個(gè)功能性DNA支架（H序列）：Ag NCs的模板序列polyC、T5環(huán)、9個(gè)堿基的互補(bǔ)序列。探針中的端粒DNA可以在端粒酶存在的情況下延伸，得到幾個(gè)重復(fù)的TTAGGG序列，然后重復(fù)序列與探針中的互補(bǔ)序列雜交形成自發(fā)夾結(jié)構(gòu)，由于富含G序列接近而導(dǎo)致 Ag NCs顯著的熒光增強(qiáng)?；跓晒庠鰪?qiáng)，可以檢測(cè)和成像細(xì)胞內(nèi)端粒酶活性。相反，如果細(xì)胞中端粒酶活性不足，底物不能延長(zhǎng)，則無(wú)法觀察到H-Ag NCs探針的熒光。

4.2 DNA/銀納米簇的抑菌作用

一定的時(shí)間內(nèi)，銀納米抗菌劑可以使某些細(xì)菌、真菌或病毒等微生物的生長(zhǎng)繁殖保持在必要水平以下。納米銀可通過(guò)3種機(jī)制破壞細(xì)菌膜：首先，從納米銀中釋放出的Ag+可以在細(xì)菌膜中遷移，從而導(dǎo)致細(xì)胞死亡；其次，細(xì)胞質(zhì)中的巰基或細(xì)胞質(zhì)中的磷基團(tuán)與Ag+之間的相互作用會(huì)導(dǎo)致活性氧（ROS）的產(chǎn)生，從而抑制DNA的復(fù)制能力。最后，細(xì)胞膜和銀納米之間的靜電相互作用形成了可作為運(yùn)輸屏障的壁坑［53-54］，從而使細(xì)胞出現(xiàn)功能障礙而死亡。

Yang等［55］首次使用支鏈DNA作為支架來(lái)調(diào)節(jié)銀納米團(tuán)簇（super-Ag NCs）的形成，其空間結(jié)構(gòu)被精確設(shè)計(jì)和構(gòu)建。ssDNA的互補(bǔ)黏端的雜交合成分支的DNA / Ag NCs，實(shí)現(xiàn)了具有可調(diào)形狀和臂長(zhǎng)的超級(jí)Ag NCs，包括Y、X和（Y-X）形超級(jí)Ag NCs。超級(jí)Ag NCs表現(xiàn)出優(yōu)異的抗菌性能，濃度為20 μmol/L的（Y-X）-super-NC可使細(xì)菌生長(zhǎng)延遲至8 h。超級(jí)Ag NCs增強(qiáng)抑菌效果的原因可能是超級(jí)NCs提供更高濃度的Ag+并且其分支結(jié)構(gòu)增加了Ag+與細(xì)菌接觸以及與細(xì)菌表面黏附的機(jī)會(huì)。

Javani等［56］探討了 DNA / Ag NCs在革蘭氏陽(yáng)性和革蘭氏陰性細(xì)菌中的抗菌特性。在測(cè)試了9種具有不同序列和長(zhǎng)度的寡核苷酸后發(fā)現(xiàn)，抗菌活性取決于所用寡核苷酸的序列。將Ag NCs按熒光顏色分組為藍(lán)色、黃色和紅色發(fā)射體，結(jié)果表明，藍(lán)色發(fā)射體產(chǎn)生的抗菌活性較差，而黃色和紅色發(fā)射體則具有與硝酸銀相似的活性。并基于以上發(fā)現(xiàn)制備了三聚體結(jié)構(gòu)，其中含有提供最佳抗菌活性的序列，其可以抑制亞微摩爾范圍內(nèi)革蘭氏陽(yáng)性和陰性細(xì)菌的生長(zhǎng)。

5 總結(jié)與展望

本文介紹了基于DNA / Ag NCs開(kāi)發(fā)的一系列生物傳感器，總結(jié)了其在分析檢測(cè)、體內(nèi)成像及抑菌方面的應(yīng)用?？偟膩?lái)說(shuō)，DNA / Ag NCs介導(dǎo)的生物傳感器可以檢測(cè)生物體內(nèi)特定酶的活性、某一段基因序列、重金屬，真菌毒素等多種靶標(biāo)分子，還可以基于細(xì)胞成像進(jìn)行癌細(xì)胞以及酶活的檢測(cè)。此外，DNA / Ag NCs的形狀以及DNA模板序列對(duì)其抑菌作用都有影響。

目前對(duì)于DNA / Ag NCs生物傳感器的研究仍處于探索階段，如何有效的控制DNA / Ag NCs核的生長(zhǎng)速率，提高材料的性能還需要繼續(xù)研究?，F(xiàn)有的研究在DNA / Ag NCs熒光的轉(zhuǎn)變以及增強(qiáng)的機(jī)制還不夠清晰，對(duì)DNA / Ag NCs的形貌調(diào)控和納米尺寸上的排布還不夠精準(zhǔn)。另外，盡管銀納米簇具有許多優(yōu)良的物理化學(xué)性質(zhì)，如尺寸小，水溶性好，耐漂白性能強(qiáng)和生物毒性小等，但穩(wěn)定性仍是限制其應(yīng)用的主要因素之一，因此，合成穩(wěn)定的銀納米簇也是未來(lái)研究工作中的重要課題之一。

雖然DNA / Ag NCs生物傳感器已經(jīng)拓展出成百上千種應(yīng)用，但衍生出的檢測(cè)方法主要基于對(duì)DNA模板的精巧設(shè)計(jì)，未來(lái)可在其他方面進(jìn)一步探究。如與新型納米材料、復(fù)合納米材料等結(jié)合，賦予DNA / Ag NCs更多優(yōu)良的性質(zhì)并研究其雜化規(guī)律，建立新的傳感方法。

DNA / Ag NCs在生物成像方面的應(yīng)用仍處于起步階段，在未來(lái)的研究中可以用其來(lái)感測(cè)細(xì)胞內(nèi)活性物質(zhì)如三磷酸腺苷（ATP）等。此外，還可以進(jìn)一步利用其成像特性來(lái)進(jìn)行藥物篩選以及藥物的定向投遞，拓展其在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用。

為了提高Ag NCs的抗菌效率，可以通過(guò)將Ag NCs與商品化抗生素結(jié)合來(lái)開(kāi)發(fā)有效的抗菌材料。另外，Ag NCs的一個(gè)獨(dú)特特性是它們顯示出強(qiáng)發(fā)光性。這可以促進(jìn)可追溯抗菌劑的開(kāi)發(fā)，除了監(jiān)視它們與細(xì)菌細(xì)胞壁的相互作用外，發(fā)光信號(hào)還可以用于檢測(cè)其細(xì)胞內(nèi)的積累。最后，還可以借助Ag NCs的發(fā)光來(lái)研究抗菌機(jī)理。銀屬于重金屬，對(duì)細(xì)胞有與一定的毒害作用。在臨床實(shí)驗(yàn)中，準(zhǔn)確了解Ag+的釋放量，可以最大程度地減少基于Ag的抗菌劑可能引起的細(xì)胞毒性，還需要對(duì)DNA / Ag NCs進(jìn)行更加深入的研究，解決這些細(xì)節(jié)問(wèn)題。