牦牛CSRP3基因的克隆及組織表達分析

白佳靈 王會 柴志欣 王吉坤 王嘉博 武志娟信金偉 鐘金城 陳智華 姬秋梅

（1. 西南民族大學 青藏高原動物遺傳資源保護與利用四川省 教育部重點實驗室，成都 610041；2. 西南民族大學 青藏高原研究院，成都 610041；3. 省部共建青稞和牦牛種質(zhì)資源與遺傳改良國家重點實驗室，拉薩 850000）

富含半胱氨酸蛋白（Cysteine and glycine-rich proteins，CRPs）基因家族是LIM結(jié)構(gòu)域蛋白質(zhì)超家族的一個分支，其特點是富含半胱氨酸和甘氨酸，包括CSRP1、CSRP2、CSRP3和TLP四個基因，CSRP3基因編碼的CRP3蛋白，又稱MLP蛋白（Muscle LIM protein）或CLP蛋白（Cardiac LIM protein），主要在橫紋肌組織中表達［1］。CSRP3基因最早于大鼠的組織中獲得，經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)人和大鼠的CSRP3基因均含6個外顯子和5個內(nèi)含子，起始密碼子位于第二外顯子，編碼194個氨基酸，主要是在心肌和骨骼肌中表達，且其表達與肌分化過程一致，是一個肌發(fā)生的正調(diào)節(jié)因子［2-4］。越來越多的研究表明，CRP3在肌源性分化和肌細胞結(jié)構(gòu)中發(fā)揮重要作用。CRP3蛋白可通過多種方式調(diào)控肌肉發(fā)育和肌肉細胞結(jié)構(gòu)維持，同時也可作為機械傳感器蛋白，與許多細胞骨架蛋白相互作用，參與基于肌動蛋白的細胞骨架組裝［5-7］；或通過其 LIM結(jié)構(gòu)域在自噬過程中與LC3（微管相關蛋白1輕鏈3）相互作用，促進細胞自噬［8］；或與心肌肌球蛋白MyBP-C結(jié)合形成CRP3/MyBP-C復合物，參與肌纖維形成過程，并通過調(diào)節(jié)肌動蛋白ATP酶活性，在成肌細胞分化中發(fā)揮重要作用［9］。

研究發(fā)現(xiàn)CSRP3基因不僅對人類疾病有一定影響，對畜禽肉質(zhì)及其生長性能方面也有重要影響。已有研究表明，CSRP3基因突變會導致人肥厚性心肌?。?0］。敲除小鼠CSRP3基因也會導致心肌肥大和心衰［6］。CSRP3基因缺陷小鼠的骨骼肌的肌小節(jié)與肌纖維長度都比正常小鼠短，表明CRP3在維護正常的肌肉結(jié)構(gòu)和功能中起重要作用［3］。對豬CSRP3基因進行克隆及鑒定表明CSRP3基因是影響豬肉品質(zhì)的潛在功能候選基因［11］。干擾CSRP3 mRNA的表達會抑制雞的骨骼肌衛(wèi)星細胞向肌管分化，表明CSRP3可能會通過促進雞骨骼肌衛(wèi)星細胞的分化從而促進肌肉生長［12］。對秦川牛CSRP3基因進行SNP分析發(fā)現(xiàn)，群體中某些組合基因型與生長和胴體性狀顯著或極顯著相關，證明CSRP3作為一種標記基因在提高生長性能和胴體性狀方面有著巨大潛力［13］。研究發(fā)現(xiàn)CSRP3在小尾寒羊心臟組織中的表達量顯著高于杜泊羊，而在肌肉（背長肌和股二頭?。┙M織中則相反［1］。

牦牛（Bos grunniens）是以我國青藏高原為起源地的大型反芻動物，也是“世界屋脊”著名的景觀牛種，素有“高原之舟”的美稱，是一個極其難得的、寶貴的基因庫［14-15］。牦牛肉品質(zhì)好、口感好，是無污染的綠色食品，符合高蛋白、低脂肪的現(xiàn)代人健康飲食要求［16］，研究肌肉發(fā)育調(diào)控的相關基因?qū)μ岣哧笈Ｈ馄焚|(zhì)具有重要意義，已有研究［1，11-13］發(fā)現(xiàn)CSRP3基因參與調(diào)節(jié)肌肉發(fā)育過程，對畜禽生長性能和肉品質(zhì)具有重要影響，而關于牦牛CSRP3基因的研究尚未見報道。故本實驗通過對牦牛CSRP3基因進行克隆及組織表達譜分析，以期為后續(xù)提高牦牛肉品質(zhì)的研究提供基礎數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗樣品采集于西藏自治區(qū)昌都市類烏齊縣，選取3頭0.5歲健康類烏齊牦牛，分別采集心臟、肝臟、脾臟、肺臟、臀大肌和臀脂，用DEPC水清洗干凈后，包裹于錫箔紙中并做好標記，迅速置于液氮中保存?zhèn)溆谩?/p>

主要試劑：Taq DNA聚合酶、dNTPs購自博邁德生物公司；RNA提取試劑Trizol購自Invitrogen公司；RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒（PrimeScriptTMRTReagent Kit with gDNA Eraser［Perfect Real Time］）、pGEM-T Vector cloning kit、DH5α感受態(tài)細胞、2 000 bp DNA Marker、TB Green Premix Ex Taq Ⅱ均購自 TaKaRa 公司；瓊脂糖凝膠DNA純化回收試劑盒購自北京天根生化科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 總RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄 使用TRIzol法提取組織總RNA，用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA純度，紫外分光光度計檢測RNA濃度及OD260nm/280nm值。利用RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA，存于-20℃冰箱備用。

1.2.2 牦牛CSRP3基因的克隆 根據(jù)GenBank中野牦牛CSRP3mRNA序列（XM_005900673.2），內(nèi)參基因GAPDH（XM_014482068），利用Primer Premier 5軟件和NCBI Primer-BLAST在線軟件設計引物擴增CSRP3基因CDS區(qū)，再用克隆所得CSRP3基因序列設計實時熒光定量PCR引物（表1），引物由成都擎科梓熙生物技術(shù)有限公司合成。

PCR擴增體系（總體積為25 μL）：上下游引物各 1 μL、cDNA 模 板 1 μL、ddH2O 9.5 μL、2×Taq PCR MasterMix 12.5 μL。PCR反應條件：95℃預變性5 min，94℃變性 30 s，65℃退火 30 s，72℃延伸 45 s，循環(huán)35次，72℃延伸7 min，4℃保存。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測并進行膠回收。

將純化回收得到的PCR產(chǎn)物連接到pGEM-T載體，并置于16℃恒溫的金屬浴中過夜連接。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細胞中，篩選出陽性重組質(zhì)粒，進行菌液PCR鑒定，并將篩選出來的菌液送成都擎科梓熙生物技術(shù)有限公司測序。

表1 牦牛CSRP3基因引物序列信息

1.2.3 組織表達差異分析 根據(jù)測序得到的序列設計實時熒光定量PCR引物，檢測CSRP3基因在心臟、肝臟、脾臟、肺臟、臀達肌和臀脂組織的表達量。反應體系（10 μL）：TB Green Premix Ex Taq Ⅱ 5 μL、上下游引物各0.4 μL、無菌去離子水3.2 μL、模板cDNA 1 μL。反應程序：95℃預變性30 s，95℃變性5 s，55℃退火30 s，共39個循環(huán)。其中每個樣本設置3個生物學重復3個技術(shù)重復，獲得每個樣品的Ct值后，采用2-ΔΔCt法計算目的基因相對表達量，GAPDH作為內(nèi)參基因?qū)颖径拷Y(jié)果進行處理。利用SPSS 20.0軟件對CSRP3基因在不同組織器官中的差異進行單因素方差分析，P<0.05為差異顯著。

1.2.4 生物信息學分析 對牦牛CSRP3基因進行生物信息學分析，利用DNAStar中的MegAlign軟件對牦牛與其他12個物種的CSRP3基因CDS區(qū)序列做同源性分析，使用MEGA 7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，其他所用到的在線軟件如表2所示。

表2 生物信息學分析在線軟件網(wǎng)址

2 結(jié)果

2.1 牦牛CSRP3基因CDS區(qū)擴增及克隆測序

CSRP3基因PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，獲得與預期牦牛CSRP3基因片段大小一致的單一清晰條帶，大小為673 bp（圖1），測序驗證后得到牦牛CSRP3基因CDS區(qū)大小為585 bp，編碼194個氨基酸殘基，相關序列信息已提交NCBI，登錄號為MN695918。

圖1 牦牛CSRP3基因PCR擴增結(jié)果

2.2 牦牛CSRP3基因序列相似性及系統(tǒng)進化樹分析

利用MegAlign軟件將克隆得到的牦牛CSRP3基因序列與家貓、斑馬魚、褐家鼠、黃牛、家雞、獼猴、黑猩猩、野豬、家犬、綿羊、熱帶爪蟾、蘇門答臘猩猩的該基因序列進行相似性比對，其中牦牛與黃牛的序列相似性高達100%，與斑馬魚的序列相似性為75.0%（表3）。利用MEGA 7.0 軟件采用NJ聚類法構(gòu)建牦牛CSRP3基因系統(tǒng)進化樹（圖2），結(jié)果顯示牦牛與黃牛的親緣性最近；其次是綿羊；而與斑馬魚和熱帶爪蟾等較低等脊椎動物相距最遠。

2.3 CRP3蛋白的理化性質(zhì)預測

利用在線軟件ExPASy中的ProtParam程序預測CRP3蛋白的理化性質(zhì)，結(jié)果表明：該蛋白的分子式為C903H1403N263O275S19，由2 863個原子組成，分子質(zhì)量為20 952.81，氨基酸總數(shù)為194，含量最多的是甘氨酸（13.4%）；其次是賴氨酸和半胱氨酸（10.3%和8.2%）；帶負電荷的殘基總數(shù)（Asp + Glu）為17，帶正電荷的殘基總數(shù)（Arg + Lys）為27，說明該蛋白帶正電荷；總平均親水性（GRAVY）為-0.561，為親水性蛋白；理論等電點為8.89，為偏堿性蛋白；摩爾消光系數(shù)為23 920，在哺乳動物網(wǎng)織紅細胞內(nèi)的半衰期為30 h，不穩(wěn)定指數(shù)為40.16，脂肪指數(shù)為43.81，根據(jù)Guruprasad方法表明CRP3為不穩(wěn)定蛋白。

利用在線軟件ExPASy中的ProtScale程序預測CRP3蛋白的親水性/疏水性（圖3），147位點處有最大值為1.222，97位點處有最小值為-2.256，故CRP3蛋白變現(xiàn)為親水性，與理化性質(zhì)預測的結(jié)果一致。

表3 牦牛與其它12個物種CSRP3基因序列相似性比對

圖2 NJ法構(gòu)建的牦牛CSRP3基因系統(tǒng)進化樹

2.4 CRP3蛋白跨膜結(jié)構(gòu)預測與信號肽分析

通過在線軟件ExPASy 中TMpred程序預測蛋白跨膜結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，CRP3蛋白無跨膜結(jié)構(gòu)（圖4），不屬于跨膜蛋白。利用在線軟件SignalP 4.1進行蛋白質(zhì)信號肽分析，發(fā)現(xiàn)無信號肽，說明CRP3蛋白不屬于分泌蛋白。

圖3 牦牛CRP3蛋白的親水性/疏水性分析

圖4 牦牛CRP3蛋白跨膜結(jié)構(gòu)預測結(jié)果

2.5 CRP3蛋白磷酸化位點和糖基化位點預測

通過在線軟件NetPhos 3.1 Server，對CRP3蛋白序列進行磷酸化位點預測，結(jié)果（圖5）顯示在牦牛CSRP3基因編碼的氨基酸中有12個絲氨酸（S）磷酸化位點、6個蘇氨酸（T）磷酸化位點、4個酪氨酸（Y）磷酸化位點。利用NetNGlyc 1.0 對其進行糖基化位點預測，結(jié)果（圖6）顯示CRP3有2個N-糖基化位點（Asn107和Asn158），7個O-糖基化位點（Thr95、Thr101、Thr103、Thr104、Thr105、Thr106和Thr109）。

圖5 牦牛CRP3蛋白磷酸化位點預測結(jié)果

圖6 牦牛CRP3蛋白N-糖基化位點預測結(jié)果

2.6 CRP3蛋白保守結(jié)構(gòu)域預測及亞細胞定位分析

利 用NCBI中 的Conserved Domain Database（CDD）數(shù)據(jù)庫對CRP3蛋白的保守結(jié)構(gòu)域進行預測，結(jié)果（圖7）顯示該蛋白為LIM蛋白超家族成員，在第9-61位之間和第119-171位之間存在兩個LIM結(jié)構(gòu)域，LIM結(jié)構(gòu)域存在于多個發(fā)育途徑的關鍵調(diào)控因子中，兩個結(jié)構(gòu)域均含有8個Zn2+結(jié)合位點。

利用在線軟件PSORT II Prediction分析牦牛CRP3蛋白的亞細胞定位發(fā)現(xiàn)，該蛋白在細胞核內(nèi)分布最多（78.3%）；其次為細胞質(zhì)（17.4%），線粒體中也有少量分布（4.3%）。

圖7 牦牛CRP3蛋白保守結(jié)構(gòu)域預測結(jié)果

2.7 CRP3蛋白的高級結(jié)構(gòu)預測

使用在線軟件ExPASy 中的SOPMA程序預測牦牛CRP3的二級結(jié)構(gòu)，分析結(jié)果顯示，該蛋白以無規(guī)則卷曲為主，其中α-螺旋18個占總鏈的9.28%，延伸鏈28個占總鏈的14.43%，β-轉(zhuǎn)角10個占總鏈的5.15%，無規(guī)則卷曲138個占總鏈的71.13%（圖 8）。

圖8 牦牛CRP3 蛋白二級結(jié)構(gòu)預測結(jié)果

利用在線軟件SWISS-MODEL對牦牛CRP3蛋白進行同源模建，預測其三級結(jié)構(gòu)模型，其最佳模型是1b8t.1.A（圖9），序列一致性為67.43%；另一模型是2xjy.1.A，序列一致性為21.43%。該蛋白的三級結(jié)構(gòu)表明，他們組成的多肽鏈有兩個高度相似的LIM結(jié)構(gòu)域。

圖9 牦牛CRP3蛋白三級結(jié)構(gòu)預測結(jié)果

2.8 牦牛CSRP3基因組織表達分析

通過實時熒光定量PCR檢測CSRP3基因在心臟、肝臟、脾臟、肺臟、臀大肌和臀脂組織的表達量，并用SPSS 20.0軟件對其進行單因素方差分析。結(jié)果顯示，CSRP3基因在心臟表達量最高，并極顯著高于其他組織（P<0.01）；其次是臀大肌，在肝臟中的表達量最低（圖10）。

3 討論

研究表明CSRP3基因能夠參與調(diào)節(jié)肌肉發(fā)育，其編碼的CRP3蛋白可以通過蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)相互作用在肌肉發(fā)育過程中起重要調(diào)控作用。研究發(fā)現(xiàn)CSRP3基因在豬［11］、綿羊［1］、黃牛［13］、雞［12］等畜禽的肌肉發(fā)育過程中發(fā)揮著重要作用，說明該基因?qū)π笄萆L性能和產(chǎn)肉品質(zhì)具有重要影響。但關于牦牛CSRP3基因的相關研究尚未見報道，而被譽為“高原之舟”的牦牛，其肉質(zhì)在很大程度上能決定其價值，因此對牦牛CSRP3基因的研究具有重要意義。本研究成功克隆了CSRP3基因的CDS區(qū)序列并對其進行了生物信息學分析，通過熒光定量PCR檢測其在牦牛不同組織中的表達量。

圖10 牦牛CSRP3基因的mRNA的組織表達分析

對克隆得到的牦牛CSRP3基因序列進行分析，發(fā)現(xiàn)該基因CDS區(qū)序列長585 bp，編碼194個氨基酸。甘氨酸具有獨特的甜味，是形成肉品香味所必需的前體氨基酸，與肉質(zhì)的鮮味有直接的關系，同一種食物鮮味氨基酸含量越高，滋味就越好［17］。賴氨酸作為必需氨基酸可以合成骨骼肌等多種蛋白，抑制部分肌纖維蛋白質(zhì)降解，賴氨酸殘基是骨膠原交聯(lián)的主要構(gòu)成物質(zhì)，羥賴氨酸參與膠原蛋白的糖基化修飾，而膠原蛋白和鈣磷等礦物質(zhì)是構(gòu)成骨骼的主要成分，因此賴氨酸對骨骼代謝有重要影響［18］。半胱氨酸可以通過促進谷胱甘肽的合成來提高反芻動物的生長性能［19］。本研究顯示牦牛CRP3蛋白甘氨酸、賴氨酸和半胱氨酸的含量分別為13.4%、10.3%和8.2%，表明牦牛CSRP3基因?qū)∪獍l(fā)育過程有一定調(diào)控作用并可能會影響其肉質(zhì)和生長性能。帶負電荷的殘基總數(shù)（Asp + Glu）小于帶正電荷的殘基總數(shù)（Arg + Lys），故CSRP3基因編碼的蛋白質(zhì)帶正電荷，該蛋白理論等電點為8.89，是偏堿性蛋白，其不穩(wěn)定指數(shù)為40.16，是不穩(wěn)定蛋白，對其親水性/疏水性進行預測發(fā)現(xiàn)該蛋白為親水性蛋白。預測結(jié)果顯示，CSRP3基因編碼的蛋白含有22個磷酸化位點，2個N-糖基化位點和7個O-糖基化位點。磷酸化是一種廣泛存在的重要的翻譯后蛋白質(zhì)修飾作用，蛋白質(zhì)磷酸化作用為調(diào)控蛋白質(zhì)合成和代謝，分子識別和信號傳導，肌肉收縮等，糖基化屬于蛋白修飾，其作用是維持蛋白的空間構(gòu)象，調(diào)節(jié)細胞表面受體的表達和功能，影響細胞生長和凋亡［20］。牦牛CRP3蛋白主要分布在細胞核中，線粒體和細胞質(zhì)中也有少量分布。有關研究表明［21］，在細胞核中，CRP3是肌生成的正向調(diào)控因子，促進肌源性分化，CRP3過表達導致肌管分化增強，這是由于CRP3與MyoD、肌原蛋白、MRF4等肌分化轉(zhuǎn)錄因子直接相關；在細胞質(zhì)中突變或缺乏CRP3會造成心臟細胞結(jié)構(gòu)的嚴重破壞和肌纖維的紊亂，這種細胞骨架效應主要是通過其在z盤上的定位及其與不同z盤組件的相互作用介導的，說明CRP3蛋白在細胞核和細胞質(zhì)中均可發(fā)揮作用。

CSRP3基因所屬的CRPs基因家族是LIM結(jié)構(gòu)域蛋白質(zhì)超家族的一個分支，該家族成員含有的典型結(jié)構(gòu)域為LIM結(jié)構(gòu)域，對CRP3蛋白結(jié)構(gòu)域的預測結(jié)果顯示，其含有兩個LIM結(jié)構(gòu)域，與CRP3蛋白的三級結(jié)構(gòu)預測結(jié)果一致。LIM結(jié)構(gòu)域廣泛存在于真核生物蛋白中，LIM由兩個不同的鋅指亞結(jié)構(gòu)域組成，其結(jié)構(gòu)高度保守，主要與蛋白質(zhì)結(jié)合，可以在細胞核和細胞質(zhì)中介導蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用，在信號轉(zhuǎn)導、細胞分化和細胞骨架的形成中發(fā)揮重要作用。含有LIM結(jié)構(gòu)域的CRP蛋白亞家族與細胞骨架相關，在黏附斑塊和肌動蛋白微絲組織中具有作用，參與細胞骨架的重建和平滑肌的分化［22］。

實時熒光定量PCR檢測結(jié)果顯示，牦牛CSRP3基因主要在心臟中表達；其次是臀大肌。與He［13］發(fā)現(xiàn)CSRP3基因在黃牛肌肉中表達量最高；其次是心臟的研究結(jié)果存在差異。這種差異表達可能是因為CSRP3基因在牦牛和黃牛肌肉細胞生長和分化中的調(diào)控機制存在差異；也可能是所選取的發(fā)育階段不同造成的；另外也可能與牦牛生活在高海拔低氧地區(qū)，心臟在高原低氧適應中扮演重要角色有關［23］，具體原因需要進一步研究。CRP3蛋白在心肌細胞和慢收縮骨骼肌細胞中均有表達［24］，研究發(fā)現(xiàn)CRP3是一種參與心肌細胞結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)，siRNA沉默CSRP3基因之后，可使由苯腎上腺素誘導的心肌細胞肥大和CSRP3過表達發(fā)生逆轉(zhuǎn)，說明CSRP3基因在心臟保護方面能夠發(fā)揮重要作用［10］。CRP3蛋白在大鼠慢肌中組成性的表達，在快肌中低表達，并在快型骨骼肌蛋白轉(zhuǎn)換為慢型骨骼肌蛋白過程中上調(diào)表達［25］。Vafiadaki等［26］發(fā)現(xiàn)了 CRP3 蛋白的剪接變異體（CRP3-b），CRP3-b定位于分化橫紋肌的肌節(jié)，可直接與z盤成分結(jié)合，作為肌管形成的負調(diào)節(jié)因子參與肌發(fā)生過程。綜上所述，前人研究結(jié)果均表明CSRP3基因是心臟和骨骼肌功能的主要調(diào)節(jié)因子。本研究結(jié)果表明CRP3在牦牛臀大肌中具有較高表達量，推測該基因在牦牛肉品質(zhì)的調(diào)控中發(fā)揮著重要作用。

4 結(jié)論

本研究成功克隆了牦牛CSRP3基因，得到長為585 bp的CDS區(qū)序列，編碼194個氨基酸殘基；生物信息學分析結(jié)果顯示，CRP3蛋白含有兩個LIM結(jié)構(gòu)域，主要分布在細胞核中，可正向調(diào)控肌肉發(fā)育過程；實時熒光定量PCR結(jié)果顯示牦牛CSRP3基因在臀大肌中具有較高表達量。以上研究結(jié)果為牦牛CSRP3基因在牦牛肉品質(zhì)方面的調(diào)控機制研究提供了基礎數(shù)據(jù)。