薄荷復(fù)方煎液對齲病及牙周病常見致病菌生理活性的抑制作用

王舞妮 趙俊文 鄧彩弟 翁子梅

[摘要]目的 探討分析薄荷復(fù)方煎液對齲病及牙周病常見致病菌生理活性的抑制作用。方法 于2018年6月選取華西口腔醫(yī)學(xué)院衛(wèi)生部提供的牙齦卟啉單胞菌、血鏈球菌作為本研究的實(shí)驗(yàn)菌株，選用薄荷、白芷、川椒、細(xì)辛、石菖蒲、補(bǔ)骨脂、仙靈脾等十多味中藥制成的薄荷復(fù)方煎液作為實(shí)驗(yàn)藥物，并將其稀釋為1∶2、1∶4、1∶8、1∶16不同濃度的藥物，分別作為實(shí)驗(yàn)組1、實(shí)驗(yàn)組2、實(shí)驗(yàn)組3、實(shí)驗(yàn)組4，另外選擇不加藥液的培養(yǎng)液作為對照組。觀察不同薄荷復(fù)方煎液對兩種口腔細(xì)菌的產(chǎn)酸能力及合成水不溶性胞外多糖能力的抑制作用。結(jié)果 四個(gè)平行實(shí)驗(yàn)組和對照組的pH值均低于初始pH值，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。四個(gè)平行實(shí)驗(yàn)組的pH值均高于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），且隨著薄荷復(fù)方煎液濃度的不斷降低，pH值逐漸降低，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。四個(gè)平行實(shí)驗(yàn)組中不溶性葡聚糖含量均低于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;且隨著薄荷復(fù)方煎液濃度的不斷降低，牙齦卟啉單胞菌、血鏈球菌兩種菌株合成的不溶性葡聚糖含量逐漸升高，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論 薄荷復(fù)方煎液對齲病及牙周病常見致病菌如牙齦卟啉單胞菌、血鏈球菌的酸代謝和糖代謝均有較好的抑制作用，且隨著藥物濃度降低，兩種菌株生理活性的抑制作用有所減弱。

[關(guān)鍵詞]薄荷復(fù)方煎液;齲病;牙周病;牙齦卟啉單菌;血鏈球菌;產(chǎn)酸;產(chǎn)糖

[中圖分類號(hào)] R781.1? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A? ? ? ? ? [文章編號(hào)] 1674-4721（2019）7（b）-0109-04

[Abstract] Objective To investigate and analyze the inhibitory effect of Peppermint Compound Decoction on physiological activity of common pathogenic bacteria of dental caries and periodontal diseases. Methods In June 2018， Streptococcus sanguis and Porphyromonas gingivalis provided by Ministry of Health， West China Stomatology Medical College was selected as the experimental strain. Peppermint Compound Decoction made of Peppermint， Angelica dahurica， Sichuan pepper， Asarum， Acorus calamus， Psoralen， Xianling Spleen and so on was used as experimental medicine. And it was diluted to 1∶2， 1∶4， 1∶8， 1∶16 different concentrations of drugs as the experimental group 1， the experimental group 2， the experimental group 3， the experimental group 4. In addition， the culture medium without medication was selected as the control group. The inhibitory effect of Peppermint Compound Decoction on the acid production and the synthesis of water-insoluble extracellular polysaccharides of two kinds of oral bacteria were observed. Results The pH values of the four parallel experimental and control groups were significantly lower than those of the initial pH value （P<0.05）. The pH values of the four parallel experimental groups were significantly higher than those of the control group （P<0.05）， and the pH values gradually decreased with the decrease of the concentration of Peppermint Compound Decoction， there was significant difference between the four groups （P<0.05）. The content of insoluble dextran synthesized by Porphyromonas gingivalis and Streptococcus sanguis in the four parallel experimental groups were significantly lower than those in the control group （P<0.05）. The content of insoluble dextran increased with the decrease of the concentration of Peppermint Compound Decoction， and the difference between the four groups was statistically significant （P<0.05）. Conclusion Peppermint Compound Decoction can inhibit the acid metabolism and glucose metabolism of common pathogenic bacteria such as Porphyromonas gingivalis and Streptococcus sanguis. With the decrease of drug concentration， the inhibition of physiological activity of the two strains is weakened.

[Key words] Peppermint Compound Decoction; Caries; Periodontal disease; Porphyromonium gingivalis; Streptococcus sanguis; Acidogenesis; Sugar production

齲病、牙周病是臨床口腔的常見病和多發(fā)病[1]。研究顯示，在我國60%以上的人患有牙周病，尤其是65歲以上的老年人群，牙周病患病率更高達(dá)90%以上，恒牙的齲病患病率也在50%以上[2-3]。齲病、牙周病不僅與人們的日常生活密切相關(guān)，且已成為導(dǎo)致35歲以上人群牙齒缺失的主要原因之一，因此，如何有效抑制齲病、牙周病的口腔致病菌，改善口腔衛(wèi)生狀況成為臨床關(guān)注的重點(diǎn)[4]。常規(guī)牙齦上下潔刮術(shù)和西醫(yī)藥物治療的效果并不理想，近年來中醫(yī)藥在齲病、牙周病的防治中均得到了一定的應(yīng)用[5]。牙齦卟啉單胞菌、血鏈球菌是齲病、牙周病等口腔疾病的常見可疑致病菌[6]。既往研究顯示，薄荷、白芷、川椒、細(xì)辛、石菖蒲、補(bǔ)骨脂、仙靈脾等10味中藥制成的薄荷復(fù)方煎液對牙齦卟啉單胞菌、血鏈球菌等齲病、牙周病致病菌均有一定的殺菌作用[7]。本研究通過分析薄荷復(fù)方煎液對常見致病菌生理活性的抑制作用，進(jìn)一步探討薄荷復(fù)方煎液的抑菌機(jī)制，現(xiàn)報(bào)道如下。

1資料與方法

1.1一般資料

于2018年6月選取牙齦卟啉單胞菌、血鏈球菌作為本次研究的實(shí)驗(yàn)菌株，選用薄荷、白芷、川椒、細(xì)辛、石菖蒲、補(bǔ)骨脂、仙靈脾等十多味中藥制成的薄荷復(fù)方煎液作為實(shí)驗(yàn)藥物，將制備好的薄荷復(fù)方煎液采用加倍稀釋法稀釋為1∶2、1∶4、1∶8、1∶16濃度的藥物，分別作為實(shí)驗(yàn)組1、實(shí)驗(yàn)組2、實(shí)驗(yàn)組3、實(shí)驗(yàn)組4四個(gè)平行實(shí)驗(yàn)組，另外選取不加入薄荷復(fù)方煎液的培養(yǎng)液作為對照組。

1.2儀器和器材

選用法國生物梅里埃公司的VITEK-32AMS型全自動(dòng)細(xì)菌鑒定和藥敏分析儀、法國生物梅里埃公司的mini-VITA1型全自動(dòng)血培養(yǎng)儀、美國Shellab全自動(dòng)厭氧培養(yǎng)箱、Orion 710A型pH計(jì)、CO2培養(yǎng)箱以及超凈工作臺(tái)。齲病致病菌選取華西口腔醫(yī)學(xué)院衛(wèi)生部提供的血鏈球菌（美國ATCC1000556），牙周病致病菌選取牙齦卟啉單胞菌（ATCC33277）。

1.3實(shí)驗(yàn)藥物的制備

薄荷復(fù)方煎液組方選用薄荷15 g、白芷10 g、川椒10 g、細(xì)辛10 g、石菖蒲10 g、補(bǔ)骨脂15 g、仙靈脾10 g、蚤休15 g、露蜂房10 g以及食鹽（炒）10 g共10味中藥，藥材洗凈后加入1000 ml水中進(jìn)行文火煎煮直至100 ml左右。然后將藥液進(jìn)行過濾離心3次，去除殘?jiān)?，濃縮至1 g/ml作為薄荷復(fù)方煎液原液，消毒后將其稀釋為1∶2、1∶4、1∶8、1∶16不同濃度的藥物備用。

1.4培養(yǎng)基的配制

①TPY液體培養(yǎng)基的制備：精密稱取TPY培養(yǎng)基13.2 g加入500 ml的蒸餾水?dāng)嚢杈鶆?，然后加熱煮沸至其完全溶解，分裝后進(jìn)行高壓滅菌15 min。②腦心浸出液肉湯（BHI）的制備：精密稱取18 g BHI加入500 ml的蒸餾水?dāng)嚢杈鶆?，然后加熱煮沸至其完全溶解，分裝后同樣進(jìn)行高壓滅菌15 min。

1.5致病菌的復(fù)蘇

將1 ml TPY培養(yǎng)基加至血鏈球菌凍干粉EP管中，充分混勻后經(jīng)37℃進(jìn)行孵育保存至血鏈球菌復(fù)蘇，經(jīng)生化鑒定后將菌懸液平均分存至8個(gè)菌種保存管于-20℃中。使用接種環(huán)將菌懸液接種于血平板上并進(jìn)行分區(qū)劃線。

將1 ml小牛血清加至牙齦卟啉單胞菌凍干粉EP管中，充分混勻后將菌懸液轉(zhuǎn)移至BHI培養(yǎng)基中，在80% N2、20% CO2、37℃條件下進(jìn)行培養(yǎng)24 h，至牙齦卟啉單胞菌復(fù)蘇。經(jīng)生化鑒定后，傳代選取符合典型形態(tài)特性的代菌種作為工作菌，菌懸液平均分存至8個(gè)菌種保存管于-20℃中。使用接種環(huán)將菌懸液接種于血平板上并進(jìn)行分區(qū)劃線。

1.6分組測定

使用1 mol/L的NaOH將BHI培養(yǎng)基調(diào)至初始pH值為7.4。取5支消毒試管，實(shí)驗(yàn)組1、2、3、4四個(gè)平行實(shí)驗(yàn)組的試管中首先按10∶1的體積比加入BHI培養(yǎng)基和血鏈球菌菌懸液，然后分別加入1∶2、1∶4、1∶8、1∶16四種不同濃度的薄荷復(fù)方煎液。另外，對照組的消毒試管中則按10∶1的體積比加入BHI培養(yǎng)基和血鏈球菌菌懸液，不加入薄荷復(fù)方煎液。各組均在80% N2、20% CO2、37℃條件下進(jìn)行厭氧培養(yǎng)48 h，然后采用pH計(jì)測定各組培養(yǎng)物上清液的pH值。然后將各組培養(yǎng)液在6000 r/min的條件下離心20 min，留取沉淀物5 ml，經(jīng)蒸餾水進(jìn)行洗滌離心2次，再加入5 ml的0.4 mol/L的NaOH再進(jìn)行洗滌離心3次，最后取上清液以蒽酮法測定各組水不溶性葡聚糖（water insoluble glucans，WIG）的含量。以同樣操作方法測定不同濃度薄荷復(fù)方煎液對牙齦卟啉單胞菌的產(chǎn)酸水平和產(chǎn)糖水平的影響。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分，計(jì)數(shù)資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，采用t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1不同濃度薄荷復(fù)方煎液對血鏈球菌和牙齦卟啉單胞菌產(chǎn)酸能力的影響

四個(gè)平行實(shí)驗(yàn)組和對照組的pH值均低于初始pH值，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。四個(gè)平行實(shí)驗(yàn)組的pH值水平均高于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;且隨著薄荷復(fù)方煎液濃度的不斷降低，pH值水平呈逐漸降低趨勢，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）（表1）。

與對照組比較，#P<0.05;與同組初始pH值比較，*P<0.05

2.2不同濃度薄荷復(fù)方煎液對血鏈球菌和牙齦卟啉單胞菌產(chǎn)糖水平的影響

四個(gè)平行實(shí)驗(yàn)組中牙齦卟啉單胞菌、血鏈球菌兩種菌株合成的水不溶性葡聚糖WIG濃度均低于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;且隨著薄荷復(fù)方煎液濃度的不斷降低，不溶性葡聚糖含量呈逐漸升高趨勢，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）（表2）。

3討論

口腔屬于多菌系的環(huán)境，口腔內(nèi)的菌群趨于微生態(tài)平衡的穩(wěn)定環(huán)境保證了口腔的健康狀態(tài)。一旦這種微生態(tài)的動(dòng)態(tài)平衡被可疑病菌打破，即可能發(fā)生內(nèi)源性感染，導(dǎo)致齲病、牙周病等[8]。近年來的研究顯示，牙周病與齲齒等慢性口腔疾病的危害已不局限于影響口腔健康，還與膿血癥和菌血癥等全身系統(tǒng)性疾病的發(fā)生密切相關(guān)[9-10]，因此，有效防治齲病、牙周病對于改善口腔衛(wèi)生狀況，保證患者健康具有重要作用。齲病、牙周病均是由于口腔細(xì)菌慢性感染導(dǎo)致的感染性疾病，齲病的主要致病菌包括血鏈球菌、變形鏈球菌及粘性放線菌，牙周病的常見致病菌包括牙齦卟啉單胞菌和伴放線桿菌[11]。本研究選擇血鏈球菌和牙齦卟啉單胞菌作為實(shí)驗(yàn)菌株。

產(chǎn)酸和產(chǎn)細(xì)胞外多糖是口腔致齲和致牙周病致病菌的重要生物學(xué)特征[12]。致病菌的致齲性與其產(chǎn)酸能力直接相關(guān)，其無氧酵解代謝過程中產(chǎn)生的有機(jī)酸會(huì)使局部pH值不斷升高，當(dāng)pH值達(dá)到5.5的臨界范圍后，會(huì)使牙體硬組織脫礦形成齲齒。致病菌合成細(xì)胞外糖的能力與也其致齲性密切相關(guān)，WIG能促進(jìn)細(xì)菌的黏附和集聚，促進(jìn)菌斑生物膜的形成，而菌斑生物膜也是牙周病發(fā)病的重要始動(dòng)因子[13]。近年來，天然的中醫(yī)藥在齲病方面的治療作用逐漸被臨床重視。既往研究顯示，薄荷、白芷、川椒、細(xì)辛、石菖蒲、補(bǔ)骨脂、仙靈脾等10味中藥制成的薄荷復(fù)方煎液對于牙齦卟啉單胞菌、血鏈球菌等致病菌均有較好的抑制作用[14]。

本研究通過探討薄荷復(fù)方煎液對于牙齦卟啉單胞菌、血鏈球菌生物活性的影響，分析其抑菌機(jī)制，結(jié)果顯示，經(jīng)不同濃度薄荷復(fù)方煎液作用后的四個(gè)平行實(shí)驗(yàn)組的pH值水平均高于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;兩種菌株經(jīng)不同濃度薄荷復(fù)方煎液作用后的四個(gè)平行實(shí)驗(yàn)組的合成不溶性葡聚糖含量均低于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;牙齦卟啉單胞菌、血鏈球菌均有較強(qiáng)的產(chǎn)酸和產(chǎn)糖能力，薄荷復(fù)方煎液對其產(chǎn)酸能力和產(chǎn)糖能力具有良好的抑制作用，且這種抑制作用隨著薄荷復(fù)方煎液濃度的不斷降低而逐漸減弱，但在濃度1∶16時(shí)仍能發(fā)揮一定的抑制作用，提示薄荷復(fù)方煎液的抑菌作用可能與其能抑制致病菌的產(chǎn)酸能力和產(chǎn)糖能力等生物活性有關(guān)，這與國內(nèi)之前一些學(xué)者[15]的研究一致。不過本次研究選擇實(shí)驗(yàn)菌株種類較少，且其藥物抑制致病菌生物活性的具體作用機(jī)制還需要進(jìn)一步探討[16]。

綜上所述，薄荷復(fù)方煎液對齲病及牙周病常見致病菌如牙齦卟啉單胞菌、血鏈球菌的酸代謝和糖代謝均有較好的抑制作用，且隨著藥物濃度降低，兩種菌株生理活性的抑制作用有所減弱。

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（收稿日期：2019-01-08? 本文編輯：祁海文）