基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討降壓通脈方的作用機(jī)制

張帆 韓琳 宋林梅 李冰 沈一凡 郭維琴 秦建國

摘要 目的：運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)理念和方法探討名中醫(yī)效方降壓通脈方的可能靶點(diǎn)及作用機(jī)制，加深對(duì)名中醫(yī)效方的理解。方法：通過檢索ETCM及BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫獲取降壓通脈方成分及預(yù)測靶基因;采用STRING、Cytoscape軟件及插件構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)并分析。利用DAVID工具對(duì)關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行基因本體論（GO）功能富集分析、KEGG通路富集分析以及疾?。―O）富集分析。結(jié)果：從降壓通脈方中篩選出關(guān)鍵化合物112個(gè)，Hub靶標(biāo)113個(gè)，模塊29個(gè)。主要涉及在炎性反應(yīng)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、免疫、糖脂代謝等生物學(xué)過程中的多條信號(hào)通路。結(jié)論：初步揭示了降壓通脈方主要活性成分、靶點(diǎn)及作用機(jī)制，為進(jìn)一步深入探討其藥理學(xué)作用提供了參考。

關(guān)鍵詞 降壓通脈方;名醫(yī)經(jīng)驗(yàn);網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué);靶點(diǎn);信號(hào)通路;生物功能

Study on the Action Mechanism of Jiangya Tongmai Formula Based on Network Pharmacology

ZHANG Fan1，HAN Lin2，SONG Linmei3，LI Bing1，SHEN Yifan1，GUO Weiqin4，QIN Jianguo5

（1 Graduate School，Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100029，China; 2 College of Traditional Chinese Medicine，Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 102488，China; 3 Capital Medical University Yanjing Medical College，Beijing 101300，China; 4 Dongzhimen Hospital，Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100700，China; 5 Nephrology Department，Dongfang Hospital，Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100078，China）

Abstract Objective：To investigate the possible action mechanism of Jiangya Tongmai Formula based on network pharmacology.Methods：By searching the ETCM and BATMAN-TCM databases，the components of Jiangya Tongmai Formula and the predicted target genes were obtained; the network was constructed and analyzed by STRING，Cytoscape software and plug-ins.DAVID tools was used to perform gene ontology（GO）function enrichment analysis，KEGG pathway enrichment analysis，and disease（DO）enrichment analysis on key targets.Results：From Jiangya Tongmai Formula，112 key compounds，113 Hub targets and 29 modules were screened.It mainly involved multiple signal pathways in the biological processes of inflammation，signal transduction，immunity，and glucose and lipid metabolism，and many other signal path.Conclusion：The main active ingredients，targets and mechanism of Jiangya Tongmai Formula are initially revealed，which provides a reference for further in-depth study of its pharmacological effects.

Keywords Jiangya Tongmai Decoction;Experience of famous doctor;Network pharmacology;Targets;Signaling pathway;Biological functions

中圖分類號(hào)：R285文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2020.23.014

降壓通脈方是著名中醫(yī)藥學(xué)家郭士魁先生創(chuàng)制的效方[1]，主要用于治療冠心病合并高血壓病的患者。該方以丹參為君藥，配伍紅花、郁金及雞血藤?zèng)鲅钛袣馔ńj(luò)止痛，合用珍珠母平肝潛陽，黃芩、菊花等清肝瀉火，諸藥合用共奏活血祛瘀、平肝潛陽之功[1-2]。異病同治是中醫(yī)治療的一大特點(diǎn)，基于對(duì)疾病證候的認(rèn)識(shí)，諸多醫(yī)家將其應(yīng)用于治療高血壓心臟病、高血壓腎損害等病癥的治療，取得了良好的臨床療效。目前已基于此進(jìn)行了一系列的臨床及實(shí)驗(yàn)研究[2-12]，證實(shí)該方能增強(qiáng)左室舒張功能、左室收縮功能、調(diào)控血管活性物質(zhì)的表達(dá)、防止心肌細(xì)胞肥大從而防治左室肥厚、保護(hù)腎臟功能等作用。臨床實(shí)踐依據(jù)及基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)依據(jù)皆表明降壓通脈方在對(duì)高血壓靶器官的保護(hù)方面有很大的臨床發(fā)展優(yōu)勢與潛力，但目前對(duì)于該方的藥效作用物質(zhì)基礎(chǔ)與機(jī)制闡釋尚不明確，需要進(jìn)一步研究與挖掘。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)基于人體是一個(gè)由眾多基因或其產(chǎn)物相互作用從而構(gòu)成的一個(gè)復(fù)雜的生物網(wǎng)絡(luò)，網(wǎng)絡(luò)的失衡是疾病發(fā)生的本質(zhì)[13]的理念，提出運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)分析的方法分析藥物、疾病及靶點(diǎn)間復(fù)雜的相互作用關(guān)系[14]，可以更好的揭示非單一靶點(diǎn)的藥物的作用特點(diǎn)[15]。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對(duì)疾病本質(zhì)的認(rèn)識(shí)與中醫(yī)“以平為期”的治療觀點(diǎn)基本吻合。運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法研究復(fù)方中藥可以揭示藥物與作用靶點(diǎn)間的相互關(guān)系，闡釋中藥活性成分間的協(xié)同作用機(jī)制，確證中藥藥效的微觀生物學(xué)基礎(chǔ)[16]。

基于以上分析，本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，對(duì)降壓通脈方的預(yù)測靶點(diǎn)進(jìn)行相關(guān)網(wǎng)絡(luò)與生物功能分析，從而加深對(duì)該方的作用機(jī)制的認(rèn)識(shí)與理解，為進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證及臨床拓展應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 中醫(yī)藥百科全書數(shù)據(jù)庫ETCM（http：//www.nrc.ac.cn：9090/ETCM/）;BATMAN-TCM在線分析工具（http：//bionet.ncpsb.org/BATMAN-TCM-tcm/）;STRING在線數(shù)據(jù)庫（https：//string-db.org/）;Cytoscape軟件（版本3.7.2）及CytoNCA、cytohubba、MCODE、Enrichment Map及AutoAnnotate插件;David 6.8生物信息學(xué)分析數(shù)據(jù)庫（https：//david.ncifcrf.gov）;R語言（版本3.6.1）。

1.2 降壓通脈方活性成分的篩選及靶點(diǎn)的預(yù)測 降壓通脈方由丹參、瓜蔞、紅花、郁金、雞血藤、薤白、香附、黃芩、菊花、草決明及珍珠母共11味藥物組成。其中珍珠母運(yùn)用BATMAN-TCM在線分析工具獲取活性成分及靶點(diǎn)，其余10味藥物運(yùn)用ETCM數(shù)據(jù)庫獲取活性成分及預(yù)測靶標(biāo)。

BATMAN-TCM[17]（http：//bionet.ncpsb.org/BATMAN-TCM-tcm/）是一個(gè)在線生物信息學(xué)分析工具，具有成分靶點(diǎn)預(yù)測、生物功能分析等功能。本研究以“珍珠母”為關(guān)鍵詞檢索BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫，以得分≥20與P<0.05為臨界值，分別進(jìn)行化合物篩選及作用靶點(diǎn)預(yù)測，并刪去未預(yù)測到靶點(diǎn)的化合物。

ETCM數(shù)據(jù)庫[18]是由中國工程院院士黃璐琦研究員帶領(lǐng)中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所、中藥資源中心、北京大學(xué)中藥學(xué)院等單位共同打造的具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的在線開源中醫(yī)藥數(shù)據(jù)平臺(tái)，采用Pipeline Pilot ADMET、QED、MedChem Studio（3.0版）等多種權(quán)威算法計(jì)算藥物動(dòng)力學(xué)參數(shù)、藥物相似度及預(yù)測作用靶點(diǎn)，并給出Tanimoto評(píng)分>0.8分的高相關(guān)性作用靶點(diǎn)。本研究運(yùn)用ETCM檢索降壓通脈方中除珍珠母外的10味藥物的活性成分及預(yù)測靶標(biāo)，并刪去未預(yù)測到靶點(diǎn)的化合物。

整合以上檢索結(jié)果，最終得到降壓通脈方的活性成分及潛在靶點(diǎn)。

1.3 “藥物-活性成分-靶點(diǎn)”相互作用網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與分析 將“1.2”中篩選出的活性成分與潛在靶點(diǎn)數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2軟件構(gòu)建“藥物-活性成分-靶點(diǎn)”相互作用網(wǎng)絡(luò)。利用Cytoscape 3.7.2軟件的Network Analyzer工具及CytoNCA插件計(jì)算網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋮?shù)，得到上述網(wǎng)絡(luò)關(guān)系中的自由度（Degree）、介度中心性、（Betweeness Centrality，BC）、接近中心性（Closeness Centrality，CC）、特征向量中心性（Eigenvector Centrality，EC）等指標(biāo)。篩選標(biāo)準(zhǔn)：1）DC值大于所有節(jié)點(diǎn)DC值中位數(shù)2倍的重要節(jié)點(diǎn);2）其他幾個(gè)指標(biāo)大于所有節(jié)點(diǎn)中位數(shù)的節(jié)點(diǎn)，即得到關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)，構(gòu)成Hub節(jié)點(diǎn)靶標(biāo)基因集，簡稱Hub集。

1.4 降壓通脈方蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析?? String數(shù)據(jù)庫[19]（http：//string-db.org/cgi/input.pl，Version：11.0）是目前公認(rèn)的查詢下載蛋白相互作用關(guān)系的在線數(shù)據(jù)庫，其收集了大量被實(shí)驗(yàn)證實(shí)及預(yù)測得到的蛋白相互作用關(guān)系的數(shù)據(jù)，共涉及24.6百萬個(gè)蛋白，>2 000百萬個(gè)相互作用。采用STRING在線數(shù)據(jù)庫查詢下載蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)（PPI）數(shù)據(jù)（得分>0.9），結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2軟件繪制相互作用網(wǎng)絡(luò)。利用Cytoscape 3.7.2軟件的cytohubba插件選用最大團(tuán)中心性（Maximal Clique Centrality，MCC）[20]計(jì)算方法獲得得分前100位的關(guān)鍵靶標(biāo)，構(gòu)成MCC關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)靶標(biāo)基因集，簡稱MCC集。

作為一個(gè)復(fù)雜的自適應(yīng)系統(tǒng)，生物網(wǎng)絡(luò)由一組相互作用的單元“模塊”組成，這些單元被認(rèn)為是最小的功能實(shí)體[21]。探索這“模塊”以及它們?nèi)绾螀f(xié)同工作來執(zhí)行復(fù)雜的功能導(dǎo)致表型改變，可能是闡明這種多成分中藥復(fù)方的藥理機(jī)制的一個(gè)很有希望的機(jī)會(huì)[22]。MCODE是cytoscape中一個(gè)基于聚類算法的插件，它可以根據(jù)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)對(duì)給定的網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行聚類，找到密切聯(lián)系的功能“模塊”。其優(yōu)勢在于具有一種定向模式，允許在不考慮網(wǎng)絡(luò)其余部分的情況下對(duì)感興趣的簇進(jìn)行微調(diào)，并允許檢查與蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)相關(guān)的簇互連性[23]。利用Cytoscape 3.7.2軟件的MCODE插件進(jìn)行關(guān)鍵模塊的識(shí)別，參數(shù)設(shè)置采用默認(rèn)值。

1.5 基因功能和信號(hào)通路分析 使用DAVID在線分析工具對(duì)Hub集、MCC集及模塊進(jìn)行GO及KEGG Pathways分析。通過統(tǒng)計(jì)學(xué)P值和FDR值來評(píng)估富集結(jié)果，其中GO分析分為生物過程（Biological Process，BP），分子功能（Molecular Function，MF）和細(xì)胞組成（Cellular Component，CC）3大模塊進(jìn)行基因功能注釋。保存結(jié)果后，閾值設(shè)置為Pvalue<0.01，F(xiàn)DR<0.01進(jìn)行顯著性富集結(jié)果篩選。對(duì)模塊GO分析結(jié)果運(yùn)用Cytoscape 3.7.2軟件的Enrichment Map插件[24]進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及分析，對(duì)其中代表主要生物學(xué)主題的類似通路的簇使用AutoAnnotate插件，一個(gè)自動(dòng)運(yùn)行clusterMaker2以生成群集并根據(jù)所選屬性的單詞頻率自動(dòng)生成集群標(biāo)簽的插件，自動(dòng)集群及定義其生物學(xué)主題。

2 結(jié)果

2.1 降壓通脈方活性成分的篩選及靶標(biāo)預(yù)測 在ETCM數(shù)據(jù)庫中，分別以“丹參”“瓜蔞、“紅花”“郁金”“雞血藤”“薤白”“香附”“黃芩”“菊花”及“決明子”為關(guān)鍵詞進(jìn)行檢索，整合檢索結(jié)果，并刪去未得到高相關(guān)性的靶點(diǎn)靶點(diǎn)的化合物，最終結(jié)果顯示（截止到2019年7月）：共篩選出成分224種，其中丹參34個(gè)，紅花20個(gè)，雞血藤5個(gè)，決明子24個(gè)，菊花10個(gè)，黃芩51個(gè)，薤白21個(gè)，香附11個(gè)、郁金5個(gè)，瓜蔞43個(gè)，去掉其中重復(fù)的成分13種，共211種;共預(yù)測到靶點(diǎn)602個(gè)。

通過BATMAN-TCM工具檢索到珍珠母成分共8種，為鋁、鋅、銅、錳、鐵、硅、碳酸鈣、鍶，其中3個(gè)化合物鋅、錳、鍶未通過BATMAN-TCM在線工具預(yù)測到得分≥20的靶點(diǎn)，其余5個(gè)化合物共得到靶點(diǎn)32個(gè)，重復(fù)的靶點(diǎn)26個(gè)。

綜上所述，降壓通脈方全方共篩選出成分216種，預(yù)測到靶點(diǎn)608個(gè)。

2.2 “藥物-活性成分-靶點(diǎn)”相互作用網(wǎng)絡(luò)分析?? 通過Cytoscape 3.7.2軟件繪制降壓通脈方的“藥物-活性成分-靶點(diǎn)”相互作用網(wǎng)絡(luò)圖。見圖1。圖中正多邊形代表藥物，菱形代表活性成分，圓形代表作用靶點(diǎn)，且具有相互作用關(guān)系的節(jié)點(diǎn)間用直線連接，節(jié)點(diǎn)顏色的深淺與度值相對(duì)應(yīng)。此網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中包含了835個(gè)節(jié)點(diǎn)和11 411條邊，835個(gè)節(jié)點(diǎn)中包括11味藥物、216種活性成分及608個(gè)作用靶點(diǎn)。圖中藥物所包含的成分成方陣排列在對(duì)應(yīng)藥物下方，而兩味或多味藥物共有的8個(gè)成分單獨(dú)成行排列，其中丹參和黃芩共有的成分為黃芩苷和豆甾醇，紅花和黃芩共有的成分為棕櫚酸，紅花和瓜蔞共有的成分為月桂酸、亞麻酸及硬脂酸，丹參、紅花及黃芩三味藥共有的成分為β-谷甾醇。對(duì)該網(wǎng)絡(luò)的拓?fù)鋵W(xué)性質(zhì)進(jìn)行分析（見表1）及篩選，篩選策略為：Degree>18且EC>0.01且BC>21.61且CC>0.28，共發(fā)現(xiàn)關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)230個(gè)（見圖2）。其中藥物5味，按度值降序依次為黃芩、瓜蔞、丹參、薤白及紅花;成分112個(gè)（見表2，僅提供度值排名前20位的成分信息）;靶標(biāo)113個(gè)，構(gòu)成Hub靶標(biāo)集（簡稱Hub集）。

2.3 降壓通脈方蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析?? 蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)結(jié)果詳見圖2，圖中節(jié)點(diǎn)表示蛋白，邊表示蛋白之間的關(guān)聯(lián)，節(jié)點(diǎn)顏色的深淺與度值相對(duì)應(yīng)。圖中共涉及457個(gè)節(jié)點(diǎn)，1 900條邊，其中有160個(gè)靶標(biāo)包括1.3中篩選出的113個(gè)靶點(diǎn)中的25個(gè)（SLC22A1、SLC22A3、SLC22A8、CYP3A43、SLC22A7、SERPINA6、SLC10A6、CYP27A1、IGHG1、ATP1A1、SLCO2B1、SLCO4A1、SLCO1B3、SLCO1C1、GLTP、SLC22A6、SLC16A1、PMP2、SLCO2A1、SEC14L2、SLC22A11、NQO2、GPER、PIM1、UGT3A1）未在數(shù)據(jù)庫中找到與其他蛋白相互作用評(píng)分>0.9的相互作用關(guān)系，這160個(gè)蛋白不在相互作用網(wǎng)絡(luò)中體現(xiàn)，另MT-CO2、MT-ATP6、MT-CO1、SLC51B、NOS2、ENSG00000196689、GPER1、PTGDR2、SLC51A不在預(yù)測到的靶標(biāo)蛋白序列中，通過STRING數(shù)據(jù)庫補(bǔ)充。使用cytohubba插件中MCC方法計(jì)算后篩選出得分排在前100的靶點(diǎn)，構(gòu)成MCC靶標(biāo)集（簡稱MCC集），結(jié)果如圖3所示。

利用MCODE進(jìn)行模塊識(shí)別，得到29個(gè)模塊。其中最大的模塊為模塊6，包含38個(gè)靶標(biāo)，147個(gè)相互作用關(guān)系，評(píng)分7.946分;評(píng)分最高的模塊為模塊1，包含15個(gè)靶標(biāo)，105個(gè)相互作用關(guān)系，評(píng)分15分;評(píng)分最低的模塊為模塊29，包含4個(gè)靶標(biāo)，4個(gè)相互作用關(guān)系，評(píng)分2.667分。詳見表3（僅提供評(píng)分>5分的模塊信息）。

29個(gè)模塊共涉及靶點(diǎn)247個(gè)，其中48個(gè)靶點(diǎn)與Hub集重疊，99個(gè)靶點(diǎn)與MCC集重疊，3種方法共同篩選出的靶點(diǎn)有22個(gè)，具體包括：CYP3A4、CYP3A5、CYP3A7、GABRB3、CYP1A1、RXRA、CYP2E1、CYP1A2、CYP2B6、CYP19A1、GABRA2、GABRA1、GABRA4、GABRA3、CYP2C9、GABRA6、GABRA5、CYP2C19、SULT2B1、AKR1C3、AKR1C1、CYP2A6。

2.4 基因功能和信號(hào)通路分析 使用DAVID數(shù)據(jù)庫對(duì)Hub集、MCC集及模塊涉及的靶標(biāo)基因進(jìn)行GO及KEGG Pathways富集分析，閾值設(shè)置為Pvalue<0.01，F(xiàn)DR<0.01。

通過GO富集分析發(fā)現(xiàn)，Hub集顯著富集在30個(gè)BP、23個(gè)MF和10個(gè)CC中，MCC集顯著富集在28個(gè)BP、28個(gè)MF和20個(gè)CC中。見圖4。圖4中橫坐標(biāo)為富集的Enrichment值，縱坐標(biāo)為-log10PValue，圓點(diǎn)表示Hub集富集到的GO基因注釋信息，三角形表示MCC集富集到的基因注釋信息，圖形的顏色與大小由FDR值和相關(guān)聯(lián)的基因數(shù)量決定。其中Hub集主要富集在類固醇代謝過程、氧化還原、陰離子運(yùn)輸、一元羧酸運(yùn)輸、藥物代謝過程、有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)、對(duì)有機(jī)物的反應(yīng)、對(duì)營養(yǎng)水平的反應(yīng)、離子輸運(yùn)、維生素D代謝過程等生物學(xué)過程，膜組分、不溶性組分、細(xì)胞碎片、微粒體、泡狀部分、外模、氯通道絡(luò)合物、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、核膜-內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞組分及脂質(zhì)結(jié)合、血紅素結(jié)合、以還原黃素為組分的氧化還原酶活性、四吡咯結(jié)合、類固醇結(jié)合、芳香化酶活性、配體依賴性核受體活性、類固醇激素受體、有機(jī)陰離子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)活性、電子載流子活性等分子功能上;MCC集主要富集在氧化還原、γ-氨基丁酸信號(hào)途徑、類固醇代謝過程、甾體生物合成過程、翻譯延伸、細(xì)胞激素代謝過程、G蛋白偶聯(lián)受體蛋白信號(hào)途徑、第二信使介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、藥物代謝過程、激素生物合成過程等生物學(xué)過程，突觸后膜、微粒體、泡狀部分、氯通道絡(luò)合物、突觸部分、大核糖體亞單位、突觸、細(xì)胞器膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜、核膜-內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞組分及GABA受體活性、GABA-A受體活性、血紅素結(jié)合、四吡咯結(jié)合、電子載流子活性、以還原的黃色蛋白為組分的氧化還原酶活性、氧結(jié)合、鐵離子結(jié)合、類固醇脫氫酶活性、細(xì)胞外配體門控離子通道活性等分子功能上。兩者共同富集到的基因注釋信息有26個(gè)，包塊類固醇代謝過程、氧化還原、藥物代謝過程、細(xì)胞激素代謝過程、激素代謝過程、激素水平的調(diào)節(jié)劑及γ-氨基丁酸信號(hào)途徑7個(gè)生物學(xué)過程，膜組分、不溶性組分、細(xì)胞碎片、微粒體、泡狀部分、氯通道絡(luò)合物、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、核膜-內(nèi)質(zhì)網(wǎng)9個(gè)細(xì)胞組分及血紅素結(jié)合、以還原的黃色蛋白為組分的氧化還原酶活性、四吡咯結(jié)合、芳香化酶活性、電子載流子活性、氧結(jié)合、陰離子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性、鐵離子結(jié)合、GABA-A受體活性、GABA受體活性10個(gè)分子功能。

對(duì)MCODE中評(píng)分>5的9個(gè)模塊分別進(jìn)行GO富集分析，共得到101個(gè)顯著富集的生物學(xué)過程、54個(gè)顯著富集的細(xì)胞組分及81個(gè)顯著富集的分子功能，共236個(gè)富集結(jié)果，其中有38個(gè)重復(fù)值。對(duì)這些結(jié)果運(yùn)用Cytoscape 3.7.2軟件的Enrichment Map插件[24]及AutoAnnotate插件進(jìn)行集群分析，Enrichment Map插件參數(shù)設(shè)置Node Cutoff Q-value<0.01，Edge Cutoff（Similarity）>0.375。見圖5。圖5中包含198個(gè)節(jié)點(diǎn)，2 723條邊，共得到11個(gè)功能集群，其中最大的是離子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)功能相關(guān)集群，共包含80個(gè)節(jié)點(diǎn)、1 773條邊，最小的是類固醇脫氫酶活性和營養(yǎng)水平刺激相關(guān)功能集群，各包含2個(gè)節(jié)點(diǎn)，1條邊。

此外對(duì)Hub集和MCC集進(jìn)行KEGG分析共得到10條信號(hào)通路。見圖7。圖7中圓點(diǎn)圓點(diǎn)表示Hub集富集到的KEGG信號(hào)通路，三角形表示MCC集富集到的基因注釋信息，圖形的顏色與大小由Pvalue和相關(guān)聯(lián)的基因數(shù)量決定。對(duì)MCODE中評(píng)分>5的9個(gè)模塊進(jìn)行KEGG分析共得到17條信號(hào)通路，詳見圖6。

3 討論

中醫(yī)復(fù)方中各藥物之間不是簡單的疊加與堆砌，而是相須相使等通過配伍有機(jī)的結(jié)合成一個(gè)整體，其作用機(jī)制是單一成分或靶點(diǎn)難以解釋的。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是一種用聯(lián)系的理念看待生物體，結(jié)合生物信息學(xué)技術(shù)和網(wǎng)絡(luò)分析、藥理學(xué)等的方法來闡釋靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)的協(xié)同效應(yīng)和潛在機(jī)制的方法。因其與中醫(yī)復(fù)方特點(diǎn)與理念高度契合，成為目前較為熱門的中醫(yī)復(fù)方研究方法。降壓通脈方是名老中醫(yī)效方，在對(duì)高血壓靶器官的保護(hù)方面有良好的應(yīng)用前景。進(jìn)一步研究該方的藥效作用物質(zhì)基礎(chǔ)與機(jī)制，有助于加深對(duì)該方的作用機(jī)制的認(rèn)識(shí)與理解，為進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證及臨床拓展應(yīng)用提供依據(jù)。

本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)理念和技術(shù)，從降壓通脈方全方11味藥物中篩選出成分216個(gè)，預(yù)測到靶點(diǎn)608個(gè)。通過分析以這些成分和靶點(diǎn)構(gòu)建的網(wǎng)絡(luò)模型，共篩選出112個(gè)關(guān)鍵成分，這些成分中連接度前3名的化合物為β-谷甾醇（Β-Sitosterol）、瀉根醇酸（Bryonolic Acid）及月桂酸（Lauric Acid）。其中β-谷甾醇是一種常見的植物甾醇，有廣泛的藥理作用，如抗氧化、抗高血脂、抗炎、免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤等，特別是防治心腦血管疾病、降低膽固醇等方面?zhèn)涫荜P(guān)注[25]。瀉根醇酸是一種四環(huán)三萜類化合物，具有細(xì)胞毒性、抗炎、抗腫瘤、抗氧化等生物活性[26]。月桂酸是典型的中鏈脂肪酸，研究表明[27]可抑制高脂飼喂小鼠脂肪沉積，并在一定程度上緩解小鼠體內(nèi)的炎性反應(yīng)。網(wǎng)絡(luò)中連接度排名前三的靶點(diǎn)為CYP3A4、ABCB1和ABCG2。CYP3A4中文名為細(xì)胞色素P450 3A4酶，是細(xì)胞色素P450氧化酶家族成員之一，是藥物在體內(nèi)代謝的重要影響因素之一。ABCB1中文名為P-糖蛋白、ABCG2中文名為乳腺癌耐藥蛋白，兩者均是膜轉(zhuǎn)運(yùn)體ABC超家族的成員，是具有ATP結(jié)合區(qū)域的苦熬膜蛋白，通過主動(dòng)運(yùn)輸?shù)姆绞睫D(zhuǎn)運(yùn)多種物質(zhì)包括藥物，是藥物耐受的重要相關(guān)蛋白[28]。

蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)結(jié)果顯示降壓通脈方的靶點(diǎn)間存在著復(fù)雜的相互作用關(guān)系，其中聯(lián)系更為密切的構(gòu)成模塊單元發(fā)揮作用。經(jīng)過計(jì)算，ANXA1、ADCY1、CHRM2、CNR1、CNR2、HTR1A、ADORA1、PTGER3、PTGDR2、GABBR1、GABBR2、GPER1、SUCNR1、P2RY12、OPRK1等可能是降壓通脈方發(fā)揮作用的主要靶蛋白。此外Hub集是通過藥物成分與靶點(diǎn)間的互作關(guān)系經(jīng)計(jì)算得到的，一定意義上可以看做是復(fù)方藥物直接影響的靶點(diǎn)，MCC集是通過靶點(diǎn)間的相互作用關(guān)系計(jì)算得到的，一定意義上代表復(fù)方藥物對(duì)復(fù)雜的生物網(wǎng)絡(luò)起調(diào)節(jié)作用的關(guān)鍵靶點(diǎn)。通過比較Hub集與MCC集，有22個(gè)靶標(biāo)蛋白相重疊，說明一部分藥物直接作用的蛋白在機(jī)體調(diào)控中起到重要作用，但更多的藥物作用是通過靶點(diǎn)間的相互作用實(shí)現(xiàn)的。

通過富集分析可知，降壓通脈方的靶基因主要富集在類固醇代謝過程、氧化還原、藥物代謝過程、細(xì)胞激素代謝過程、激素代謝過程、激素水平的調(diào)節(jié)劑及γ-氨基丁酸信號(hào)途徑等生物學(xué)過程，這些生物學(xué)過程與免疫、炎性反應(yīng)、脂代謝等高度相關(guān)，可能是其作用廣泛的物質(zhì)基礎(chǔ)。KEGG通路分析篩選出10條信號(hào)通路，主要包括機(jī)體內(nèi)重要的小分子物資代謝通路：亞油酸、視黃醇、花生四烯酸及類固醇激素等，這些物質(zhì)及代謝產(chǎn)物在機(jī)體內(nèi)發(fā)揮重要作用，如在炎性反應(yīng)、免疫反應(yīng)、糖脂代謝等方面，而這些方面在心腦血管疾病、腎臟病等高血壓易損傷的靶器官的疾病發(fā)生發(fā)展過程中均起到重要的作用，提示該方在上述疾病治療中的潛力。此外還涉及到信號(hào)傳導(dǎo)的相關(guān)通路2條，分別為神經(jīng)活性配體-受體相互作用通路、PPAR信號(hào)通路。其中PPAR信號(hào)通路中PPARs是與維甲酸、類固醇和甲狀腺激素相關(guān)的配體激活轉(zhuǎn)錄因子超家族核激素受體成員，主要調(diào)節(jié)脂肪代謝酶的轉(zhuǎn)錄，從而調(diào)節(jié)能量代謝、生長發(fā)育等生物功能，還參與細(xì)胞生長、分化與凋亡的調(diào)節(jié)。

通過模塊分析可知，大多數(shù)模塊的生物功能相對(duì)集中，僅涉及1～2個(gè)方面，復(fù)雜的中藥復(fù)方通過作用靶標(biāo)間的相互作用形成一個(gè)個(gè)功能模塊，這些模塊互相影響與調(diào)節(jié)，協(xié)調(diào)發(fā)揮作用。對(duì)其中得分較高的9個(gè)模塊進(jìn)行KEGG信號(hào)通路分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其除與Hub集及MCC集共同涉及的神經(jīng)活性配體-受體相互作用、核糖體、類固醇激素生物合成、雄激素與雌激素代謝、氧化磷酸化、PPAR信號(hào)通路等信號(hào)通路外，還涉及心肌收縮、帕金森病、阿爾茨海默病、肌痿側(cè)索硬化癥等疾病的信號(hào)通路，此外還涉及糖脂代謝的信號(hào)通路：脂肪細(xì)胞因子信號(hào)通路及胰島素信號(hào)通路，與復(fù)制和轉(zhuǎn)錄相關(guān)的長期增益效應(yīng)等及與能量代謝相關(guān)的檸檬酸循環(huán)。

綜上所述，本研究以名中醫(yī)效方降壓通脈方為研究對(duì)象，通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)相關(guān)理念和方法分析降壓通脈方作用機(jī)制。研究表明此方涉及多種信號(hào)通路和生物過程，體現(xiàn)了“多成分-多靶點(diǎn)-多途徑”的協(xié)同作用特點(diǎn)，為進(jìn)一步深入研究降壓通脈方藥理作用奠定基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)

[1]焦東海.郭士魁老中醫(yī)冠心?、蛱?hào)方創(chuàng)立依據(jù)及經(jīng)驗(yàn)方[J].中成藥，1990，12（3）：23-24.

[2]王亞紅，肖文君，羅斯瓊，等.降壓通脈方對(duì)自發(fā)性高血壓大鼠血壓及左心室肥厚的影響[J].中華中醫(yī)藥雜志，2010，25（3）：369-371.

[3]王琛.降壓通脈方逆轉(zhuǎn)高血壓左室肥厚的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路機(jī)制初探[D].北京：北京中醫(yī)藥大學(xué)，2009.

[4]傅強(qiáng).降壓通脈方對(duì)左室肥厚高血壓患者的臨床及血管活性物質(zhì)改變的觀察[J].云南中醫(yī)中藥雜志，2004，25（4）：15-17.

[5]王亞紅.降壓通脈方對(duì)自發(fā)性高血壓大鼠血壓及左心室肥厚的影響及對(duì)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路蛋白表達(dá)的影響[C].南昌：第十次中國中西醫(yī)結(jié)合學(xué)會(huì)心血管病學(xué)術(shù)大會(huì)暨第五次江西省中西醫(yī)結(jié)合學(xué)會(huì)心血管病學(xué)術(shù)大會(huì)論文匯編，2010.

[6]王亞紅.降壓通脈方對(duì)自發(fā)性高血壓大鼠血壓及左心室肥厚的影響[C].西寧：第四屆全國血脂分析與臨床學(xué)術(shù)研討會(huì)暨第九屆全國脂蛋白學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編，2008.

[7]王亞紅.降壓通脈方對(duì)自發(fā)性高血壓大鼠血壓及左心室肥厚的影響[C].上海：第一屆全國中西醫(yī)結(jié)合心血管病中青年醫(yī)師論壇論文匯編，2008.

[8]曹征.降壓通脈方對(duì)自發(fā)性高血壓大鼠腎臟損害的實(shí)驗(yàn)及機(jī)理研究[D].北京：北京中醫(yī)藥大學(xué)，2007.

[9]羅斯瓊，王亞紅，王琛.降壓通脈方對(duì)血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大的影響[J].中國中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志，2009，15（8）：584-586.

[10]王碩，王碩仁，趙悅?cè)悖?降壓通脈方對(duì)高血壓病左室肥厚患者血管活性物質(zhì)的影響[J].中國中西醫(yī)結(jié)合雜志，2002，22（4）：274-276.

[11]秦建國.降壓通脈方對(duì)高血壓病腎損害大鼠尿微量白蛋白、NAG酶的調(diào)節(jié)作用[C].北京：中華中醫(yī)藥學(xué)會(huì)第二十一屆全國中醫(yī)腎病學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編，2008.

[12]羅斯瓊.活血鎮(zhèn)心法逆轉(zhuǎn)高血壓左室肥厚理論及作用機(jī)制初探[D].北京：北京中醫(yī)藥大學(xué)，2008.

[13]Tang F，Tang Q，Tian Y，et al.Network pharmacology-based prediction of the active ingredients and potential targets of Mahuang Fuzi Xixin decoction for application to allergic rhinitis[J].Journal of Ethnopharmacology，2015，176（Complete）：402-412.

[14]Hopkins A L.Network pharmacology[J].Nature Biotechnology，2007，25（10）：1110-1111.

[15]Hong H，F(xiàn)euers R，Tang K，et al.Drug Repositioning Through Network Pharmacology[J].Current Topics in Medicinal Chemistry，2016，16（30）：3646-3656.

[16]解靜，高杉，李琳，等.網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)在中藥領(lǐng)域中的研究進(jìn)展與應(yīng)用策略[J].中草藥，2019，50（10）：2257-2265.

[17]Zhongyang L，F(xiàn)eifei G，Yong W，et al.BATMAN-TCM：a Bioinformatics Analysis Tool for Molecular mechANism of Traditional Chinese Medicine[J].Scientific Reports，2016，16：6.

[18]Hai-Yu X，Yan-Qiong Z，Zhen-Ming L，et al.ETCM：an encyclopaedia of traditional Chinese medicine[J].Nucleic Acids Research，2019，47（D1）：976-982.

[19]von MC.，Jensen LJ，Snel B，et al.STRING：known and predicted protein-protein associations，integrated and transferred across organisms[J].Nucleic Acids Research，2005，33（Database issue）：D433-D437.

[20]Meghanathan N.Maximal Clique Size Versus Centrality[C].Springer India：A Correlation Analysis for Complex Real-World Network Graphs，New Delhi，2016.

[21]Sales-Pardo，Marta.The importance of being modular[J].Science，2017，357（6347）：128-129.

[22]Wang P，Dai L，Zhou W，et al.Intermodule Coupling Analysis of Huang-Lian-Jie-Du Decoction on Stroke[J].Frontiers in Pharmacology，2019，10：1288.

[23]Bader G D，Hogue C W.An automated method for finding molecular complexes in large protein interaction networks[J].BMC Bioinformatics，2003，4（1）：2.

[24]Daniele M，Ruth I，Oliver S，et al.Enrichment Map：A Network-Based Method for Gene-Set Enrichment Visualization and Interpretation[J].Plos One，2010，5（11）：e13984.

[25]劉威良，姬昱，黃艾祥.β-谷甾醇的研究及開發(fā)進(jìn)展[J].農(nóng)產(chǎn)品加工，2019，18（1）：83-85.

[26]張勝男，李煌，張玉琴，等.瀉根醇酸對(duì)NMDA誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞損傷的保護(hù)作用研究[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2015，139（1）：139-142，162.

[27]丁同慶，張楓琳，黃曉剛，等.月桂酸對(duì)高脂日糧飼喂小鼠脂肪沉積及炎癥反應(yīng)的影響[J].養(yǎng)殖與飼料，2019，18（11）：28-31.

[28]李君蕊，付盈菊，趙寶春，等.ABCB1和ABCG2基因多態(tài)性與急性藥物中毒性腦病的相關(guān)研究[J].中國急救醫(yī)學(xué)，2014，34（3）：233-237.

（2020-01-08收稿 責(zé)任編輯：蒼寧）