沉默賴氨酸乙酰基轉(zhuǎn)移酶基因?qū)θ思谞钕偃轭^狀癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響

杜靜海，陳春悠，郭 欣，張 靜

(河北醫(yī)科大學(xué)附屬唐山工人醫(yī)院頭頸外科，河北 唐山 063000)

多數(shù)甲狀腺乳頭狀癌患者可被治愈并長期存活[1]。但也有部分甲狀腺乳頭狀癌惡性程度高，治療后容易出現(xiàn)復(fù)發(fā)、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等，預(yù)后較差[2]。因此探討甲狀腺乳頭狀癌的發(fā)病機(jī)制對抑制腫瘤進(jìn)展和尋找新的治療靶點(diǎn)具有重要意義。磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)/絲氨酸/蘇氨酸激酶(serine/threonine kinase，AKT)信號通路為甲狀腺癌細(xì)胞增殖和凋亡的主要信號通路，該信號通路的激活可促進(jìn)甲狀腺癌細(xì)胞增殖并抑制細(xì)胞凋亡[3]。賴氨酸乙酰基轉(zhuǎn)移酶(lysine acetyltransferase，Kat5)在細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡、胚胎發(fā)育、DNA損傷修復(fù)和基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控等過程中發(fā)揮非常重要的作用[4-6]。結(jié)直腸癌組織中Kat5蛋白表達(dá)下調(diào)可作為預(yù)測結(jié)直腸癌預(yù)后和化療效果的生物學(xué)指標(biāo)[7]，減少Kat5表達(dá)可促進(jìn)前列腺癌轉(zhuǎn)移[8]，Kat5為惡性胸膜間皮瘤的治療靶點(diǎn)[9]，抑制Kat5介導(dǎo)的SMAD3乙?；娃D(zhuǎn)錄活性可抑制黑素瘤進(jìn)展[10]，Kat5通過調(diào)節(jié)DNA修復(fù)促進(jìn)乳腺癌發(fā)生[11]。WEN等[12]對Kat5在甲狀腺未分化癌組織和細(xì)胞中表達(dá)的研究顯示：甲狀腺未分化癌組織和細(xì)胞中Kat5表達(dá)水平升高，上調(diào)Kat5表達(dá)水平可促進(jìn)甲狀腺未分化癌的增殖和侵襲，因此認(rèn)為 Kat5可能為甲狀腺未分化癌的新生物標(biāo)記物和治療靶標(biāo)，Kat5在甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞中的表達(dá)及其作用機(jī)制尚未明確，本文作者對甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞中Kat5表達(dá)水平及沉默Kat5基因?qū)谞钕偃轭^狀癌細(xì)胞增殖、凋亡和PI3K/AKT信號通路的影響進(jìn)行研究，探討Kat5在甲狀腺乳頭狀癌發(fā)生發(fā)展中的作用及其可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、主要試劑和儀器人甲狀腺乳頭狀癌BHP10-3、TPC-1和K1細(xì)胞和甲狀腺上皮Nthy-ori3-1細(xì)胞(美國ATCC細(xì)胞庫)。Kat5 siRNA及其陰性對照siRNA(美國OriGene公司)，RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清和二喹啉甲酸(BCA)(美國Hycloneo公司)，CCK-8試劑盒、膜聯(lián)蛋白Ⅴ-異硫氰酸熒光素(Annexin Ⅴ-FITC)/碘化丙啶(PI)細(xì)胞凋亡試劑盒、反轉(zhuǎn)錄(RT)試劑盒、熒光定量聚合酶連反應(yīng)(PCR)試劑盒(美國Sigma公司)，兔抗人Kat5單克隆抗體、兔抗人周期蛋白依賴性激酶2(CDK2)單克隆抗體、兔抗人P21單克隆抗體、兔抗人P53單克隆抗體、兔抗人活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(cleaved caspase-3)單克隆抗體、兔抗人PI3K單克隆抗體、兔抗人磷酸化PI3K(p-PI3K)單克隆抗體、兔抗人AKT單克隆抗體和兔抗人p-AKT單克隆抗體(美國Abcam公司)。ProFlex PCR儀(美國Life Technologics公司)，CLARIOstar酶標(biāo)儀(德國BMG Labtech公司)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)將細(xì)胞置于含胎牛血清和青霉素-鏈霉素雙抗的RPMI 1640培養(yǎng)基中，常規(guī)培養(yǎng)，細(xì)胞生長至80%以上融合時(shí)采用胰蛋白酶消化，并傳代培養(yǎng)，取第3代細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)研究。

1.3 熒光定量RT-PCR法檢測甲狀腺乳頭狀癌BHP10-3、TPC-1和K1細(xì)胞和甲狀腺上皮Nthy-ori3-1細(xì)胞中Kat5 mRNA表達(dá)水平采用TRIzol提取甲狀腺乳頭狀癌BHP10-3、TPC-1、K1細(xì)胞和甲狀腺上皮Nthy-ori3-1細(xì)胞中總RNA，反轉(zhuǎn)錄cDNA(按照試劑盒說明書進(jìn)行)，RT-PCR法檢測各種細(xì)胞中Kat5 mRNA表達(dá)水平。Kat5上游引物：5′-AATGTGGCCTGCATCCTAAC-3′，下游引物：5′-TGTTTTCCCTTCCACTTTGG-3′。PCR反應(yīng)條件：95 ℃、20 s；95 ℃、15 s，56 ℃、30 s，72 ℃、30 s，共42個(gè)循環(huán)。每組設(shè)7個(gè)復(fù)孔，以β-actin為內(nèi)參照。采用2-ΔΔCt法計(jì)算細(xì)胞中Kat5 mRNA水平。

1.4 Western blotting法檢測甲狀腺乳頭狀癌BHP10-3、TPC-1和K1細(xì)胞和甲狀腺上皮Nthy-ori3-1細(xì)胞中Kat5蛋白表達(dá)水平甲狀腺乳頭狀癌BHP10-3、TPC-1和K1細(xì)胞和甲狀腺上皮Nthy-ori3-1細(xì)胞中加入RIPA裂解液，充分裂解30 min，16 000 g離心10 min，提取細(xì)胞總蛋白，BCA測定細(xì)胞蛋白濃度，采用SDS-PAGE分離蛋白，半干法轉(zhuǎn)膜，脫脂牛奶封閉2 h，加入兔抗人Kat5單克隆抗體過夜孵育(一抗稀釋比例1∶300)，加入二抗孵育1 h(二抗稀釋比例1∶5 000)，加入顯色液，暗室中曝光顯影，以β-actin為內(nèi)參照，每組設(shè)7個(gè)復(fù)孔。凝膠成像系統(tǒng)獲得各種細(xì)胞中蛋白條帶圖片，Image J軟件分析細(xì)胞中Kat5蛋白表達(dá)水平。Kat5蛋白表達(dá)水平=Kat5蛋白條帶灰度值/β-actin蛋白條帶灰度值。

1.5 細(xì)胞分組和各組甲狀腺乳頭狀癌TPC-1細(xì)胞中Kat mRNA和蛋白表達(dá)水平將甲狀腺乳頭狀癌TPC-1細(xì)胞分為空白對照組、陰性對照組和沉默Kat5組(si-Kat5組)。取各組對數(shù)生長期TPC-1細(xì)胞接種至6孔板中，每孔接種2×105個(gè)細(xì)胞，每組設(shè)7個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)至細(xì)胞達(dá)85%融合時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染?？瞻讓φ战M甲狀腺乳頭狀癌TPC-1細(xì)胞不轉(zhuǎn)染，陰性對照組甲狀腺乳頭狀癌TPC-1細(xì)胞轉(zhuǎn)染陰性對照siRNA，si-Kat5組甲狀腺乳頭狀癌TPC-1細(xì)胞轉(zhuǎn)染Kat5 siRNA，轉(zhuǎn)染步驟嚴(yán)格按照LipofectamineTM2000試劑盒說明書進(jìn)行。按照1.3和1.4中方法檢測各組TPC-1細(xì)胞中Kat5 mRNA和蛋白表達(dá)水平。

1.6 CCK-8法檢測各組甲狀腺乳頭狀癌TPC-1細(xì)胞增殖活性轉(zhuǎn)染48 h后取各組TPC-1細(xì)胞接種至96孔板中，每孔5×105個(gè)細(xì)胞，每組設(shè)7個(gè)復(fù)孔。分別在培養(yǎng)1、3和5 d時(shí)各孔加入10 μL CCK-8試劑，繼續(xù)培養(yǎng)2 h，酶標(biāo)儀測定波長490 nm處各孔細(xì)胞吸光度(A)值。以A值代表細(xì)胞增殖活性。

1.7 克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測各組甲狀腺乳頭狀癌TPC-1細(xì)胞克隆形成率轉(zhuǎn)染48 h后取各組TPC-1細(xì)胞，胰蛋白酶消化，制備成單細(xì)胞懸液，接種至6孔板中，每孔接種100 μL細(xì)胞懸液(細(xì)胞密度為2×103mL-1，即每孔200個(gè)細(xì)胞)，每組設(shè)7個(gè)復(fù)孔。置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，觀察克隆形成情況，當(dāng)肉眼可見克隆出現(xiàn)時(shí)終止培養(yǎng)，去除培養(yǎng)基，加入多聚甲醛固定10 min，去除固定液，加入結(jié)晶紫染色10 min，顯微鏡下計(jì)數(shù)克隆形成數(shù)，含有多于50個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞集落為1個(gè)克隆，計(jì)算克隆形成率?？寺⌒纬陕?克隆形成數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)×100%。

1.8 流式細(xì)胞術(shù)檢測各組甲狀腺乳頭狀癌TPC-1細(xì)胞凋亡率轉(zhuǎn)染48 h后取各組TPC-1細(xì)胞，制備成密度為1×106mL-1單細(xì)胞懸液，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測各組甲狀腺乳頭狀癌TPC-1細(xì)胞凋亡率，操作嚴(yán)格按照Annexin Ⅴ-FITC/PI細(xì)胞凋亡試劑盒說明書進(jìn)行。每組重復(fù)實(shí)驗(yàn)7次。細(xì)胞凋亡率=凋亡細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.9 Western blotting法檢測各組甲狀腺乳頭狀癌TPC-1細(xì)胞中CDK2、P21、P53、cleaved caspase-3、PI3K、p-PI3K、AKT和p-AKT蛋白表達(dá)水平取轉(zhuǎn)染48 h后各組TPC-1細(xì)胞，按照1.3中方法檢測各種蛋白表達(dá)水平。

2 結(jié) 果

2.1 甲狀腺乳頭狀癌BHP10-3、TPC-1和K1細(xì)胞和甲狀腺上皮Nthy-ori3-1細(xì)胞中Kat5 mRNA和蛋白表達(dá)水平甲狀腺乳頭狀癌BHP10-3、TPC-1和K1細(xì)胞中Kat5 mRNA和蛋白表達(dá)水平均高于甲狀腺上皮Nthy-ori3-1細(xì)胞(P<0.05)。見圖1和表1。因此選擇Kat5 mRNA和蛋白表達(dá)水平最高的TPC-1細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)研究。

Lane 1：Nthy-ori3-1 cells；Lane 2：BHP10-3 cells；Lane 3：TPC-1 cells；Lane 4：K1 cells.

圖1 Western blotting 法檢測甲狀腺乳頭狀癌BHP10-3、TPC-1和K1細(xì)胞和甲狀腺上皮Nthy-ori3-1細(xì)胞中Kat5蛋白表達(dá)電泳圖

Fig.1 Electrophoregram of expressions of Kat5 protein in thyroid papillary carcinoma BHP10-3,TPC-1,and K1 cells and thyroid epithelial Nthy-ori3-1 cells detected by Western blotting method

2.2 各組TPC-1細(xì)胞中Kat5 mRNA和蛋白表達(dá)水平與空白對照組和陰性對照組比較，si-Kat5組甲狀腺乳頭狀癌TPC-1細(xì)胞中Kat5 mRNA和蛋白表達(dá)水平降低(P<0.05)；空白對照組和陰性對照組甲狀腺乳頭狀癌TPC-1細(xì)胞中Kat5 mRNA和蛋白表達(dá)水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖2和表2。

表1 甲狀腺乳頭狀癌BHP10-3、TPC-1和K1細(xì)胞和甲狀腺上皮Nthy-ori3-1細(xì)胞中Kat5 mRNA和蛋白表達(dá)水平

GroupKat5 mRNAKat5 proteinNthy-ori3-1 cells1.00±0.110.14±0.03BHP10-3 cells1.89±0.13*0.68±0.11*TPC-1 cells2.18±0.14*0.76±0.12*K1 cells 1.95±0.12*0.73±0.12*F119.54157.714P0.0000.000

*P<0.05vsNthy-ori3-1 cells.

Lane 1：Blank control group；Lane 2：Negative control group；Lane 3：si-Kat5 group.

圖2 Western blotting法檢測各組甲狀腺乳頭狀癌TPC-1細(xì)胞中Kat5蛋白表達(dá)電泳圖

Fig.2 Electrophoregram of expressions of Kat5 protein in thyroid papillary carcinoma TPC-1 cells in various groups detected by Western blotting method

表2 各組甲狀腺乳頭狀癌TPC-1細(xì)胞中Kat5 mRNA和蛋白表達(dá)水平

GroupKat5 mRNAKat5 proteinBlank control1.00±0.080.74±0.13Negative control0.97±0.070.69±0.10si-Kat5 0.32±0.04*△0.16±0.07*△F240.33368.217P0.0000.000

*P<0.05vsblank control group；△P<0.05vsnegative control group.

2.3 各組甲狀腺乳頭狀癌TPC-1細(xì)胞增殖活性與空白對照組和陰性對照組比較，si-Kat5組甲狀腺乳頭狀癌TPC-1細(xì)胞增殖活性降低(P<0.05)；空白對照組和陰性對照組甲狀腺乳頭狀癌TPC-1細(xì)胞增殖活性比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

2.4 各組甲狀腺乳頭狀癌TPC-1細(xì)胞克隆形成率與空白對照組和陰性對照組比較，si-Kat5組甲狀腺乳頭狀癌TPC-1細(xì)胞克隆形成率降低(P<0.05)；空白對照組和陰性對照組甲狀腺乳頭狀癌TPC-1細(xì)胞克隆形成率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖3(插頁六)和表4。

2.5 各組甲狀腺乳頭狀癌TPC-1細(xì)胞凋亡率與空白對照組和陰性對照組比較，si-Kat5組甲狀腺乳頭狀癌TPC-1細(xì)胞凋亡率升高(P<0.05)；空白對照組和陰性對照組甲狀腺乳頭狀癌TPC-1細(xì)胞凋亡率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖4和表4。

表3 各組甲狀腺乳頭狀癌TPC-1細(xì)胞增殖活性

Group Proliferation activity (t/d) 135Blank control0.98±0.091.95±0.322.78±0.41Negative control0.96±0.111.89±0.282.75±0.38si-Kat5 0.85±0.07*△1.43±0.21*△1.84±0.31*△F4.1007.55714.670P0.0340.0040.000

*P<0.05vsblank control group；△P<0.05vsnegative control group.

A：Blank control group；B： Negative control group；C：si-Kat5 group.

表4 各組甲狀腺乳頭狀癌TPC-1細(xì)胞克隆形成率和細(xì)胞凋亡率

GroupClone formation rate Apoptotic rate Blank control55.64±5.725.64±1.23Negative control54.73±5.646.12±1.31si-Kat5 28.49±4.83*△19.64±1.42*△F56.828252.902P0.0000.000

*P<0.05vsblank control group；△P<0.05vsnegative control group.

2.6 各組甲狀腺乳頭狀癌TPC-1細(xì)胞中CDK2、P21、P53和cleaved caspase-3蛋白表達(dá)水平與空白對照組和陰性對照組比較，si-Kat5組甲狀腺乳頭狀癌TPC-1細(xì)胞中CDK2蛋白表達(dá)水平降低(P<0.05)，P21、P53和cleaved caspase-3蛋白表達(dá)水平升高(P<0.05)；空白對照組和陰性對照組甲狀腺乳頭狀癌TPC-1細(xì)胞中CDK2、P21、P53和cleaved caspase-3蛋白表達(dá)水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖5和表5。

Lane 1：Blank control group；Lane 2：Negative control group；Lane 3：si-Kat5 group.

圖5 Western blotting法檢測各組甲狀腺乳頭狀癌TPC-1細(xì)胞中CDK2、P21、P53和cleaved caspase-3蛋白表達(dá)電泳圖

Fig.5 Electrophoregram of expressions of CDK2, P21, P53,and cleaved caspase-3 proteins in thyroid papillary carcinoma TPC-1 cells in various groups detected by Western blotting method

2.7 各組甲狀腺乳頭狀癌TPC-1細(xì)胞中PI3K/AKT信號通路相關(guān)蛋白PI3K、p-PI3K、AKT和p-AKT蛋白表達(dá)水平各組甲狀腺乳頭狀癌TPC-1細(xì)胞中PI3K和AKT蛋白表達(dá)水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與空白對照組和陰性對照組比較，si-Kat5組甲狀腺乳頭狀癌TPC-1細(xì)胞中p-PI3K和p-AKT蛋白表達(dá)水平降低(P<0.05)；空白對照組和陰性對照組甲狀腺乳頭狀癌TPC-1細(xì)胞中p-PI3K和p-AKT蛋白表達(dá)水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖6和表6。

表5 各組甲狀腺乳頭狀癌TPC-1細(xì)胞中CDK2、P21、P53和cleaved caspase-3蛋白表達(dá)水平

GroupCDK2P21P53Cleaved caspase-3Blank control0.28±0.050.16±0.040.13±0.040.21±0.05Negative control0.26±0.040.17±0.030.11±0.020.19±0.03si-Kat5 0.12±0.02*△0.93±0.12*△0.94±0.15*△0.87±0.13*△F35.467342.432192.200154.897P0.0000.0000.0000.000

*P<0.05vsblank control group；△P<0.05vsnegative control group.

Lane 1：Blank control group；Lane 2：Negative control group；Lane 3：si-Kat5 group.

圖6 Western blotting檢測各組甲狀腺乳頭狀癌TPC-1細(xì)胞中PI3K、p-PI3K、AKT和p-AKT蛋白表達(dá)電泳圖

Fig.6 Electrophoregram of expressions of PI3K, p-PI3K, AKT and p-AKT proteins in thyroid papillary carcinoma TPC-1 cells in various groups detected by Western blotting method

3 討 論

本研究結(jié)果顯示：甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞中Kat5水平升高，沉默(下調(diào))甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞中Kat5表達(dá)水平可抑制甲狀腺乳頭狀癌TPC-1細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡，降低細(xì)胞中CDK2蛋白表達(dá)水平，升高細(xì)胞中P21、P53、cleaved caspase-3蛋白表達(dá)水平。CDK2是絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，為細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶家族成員，在細(xì)胞從G1期向S期過渡過程中發(fā)揮重要作用，CDK2功能和活性在調(diào)節(jié)細(xì)胞周期運(yùn)轉(zhuǎn)中發(fā)揮關(guān)鍵性作用，與細(xì)胞周期調(diào)控關(guān)系非常密切[13]。P21為CKI基因，CKI可抑制CDK2復(fù)合物活性；P21參與細(xì)胞分化、增殖、凋亡和衰老等過程的調(diào)節(jié)；P21為P53的下游調(diào)控因子，其啟動子上有P53結(jié)合位點(diǎn)；P21參與P53介導(dǎo)的細(xì)胞周期停止過程[14]。 P53在細(xì)胞周期阻滯和抑制腫瘤發(fā)生中發(fā)揮重要作用[15]。細(xì)胞凋亡有多條通路參與，caspase途徑在細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要作用，caspase-3為caspase級聯(lián)反應(yīng)下游蛋白酶，在調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡中發(fā)揮主導(dǎo)作用，被活化的cleaved caspase-3可使細(xì)胞凋亡進(jìn)入不可逆階段，因此cleaved caspase-3可作為檢測細(xì)胞凋亡的主要指標(biāo)[16]。細(xì)胞中CDK2蛋白表達(dá)水平降低，P21、P53和cleaved caspase-3蛋白表達(dá)水平升高表明：細(xì)胞增殖受到抑制，細(xì)胞凋亡得到促進(jìn)。本研究結(jié)果表明：沉默Kat5基因水平可抑制甲狀腺乳頭狀癌TCP-1細(xì)胞增殖并促進(jìn)其凋亡。

表6 各組甲狀腺乳頭狀癌TPC-1細(xì)胞中PI3K、p-PI3K、AKT和p-AKT蛋白表達(dá)水平

GroupPI3Kp-PI3KAKTp-AKTBlank control0.71±0.150.79±0.110.46±0.080.57±0.11Negative control0.69±0.140.78±0.120.47±0.090.59±0.08si-Kat5 0.70±0.130.09±0.03*△0.48±0.070.12±0.04*△F0.036123.4200.10873.796P0.9650.0000.8980.000

*P<0.05vsblank control group；△P<0.05vsnegative control group.

PI3K/AKT信號通路為一條重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路[17]，在甲狀腺癌發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，甲狀腺癌中PI3K/AKT信號通路處于激活狀態(tài)，可促進(jìn)甲狀腺癌發(fā)生發(fā)展，抑制PI3K/AKT信號通路可抑制甲狀腺癌的發(fā)生發(fā)展[18-19]。PI3K通路下游有多種效應(yīng)底物，AKT是PI3K/AKT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路下游的直接底物，p-AKT可參與惡性腫瘤細(xì)胞的增殖和凋亡過程，增加惡性腫瘤細(xì)胞的運(yùn)動能力[20-21]。Kat5通過多種信號通路發(fā)揮作用，研究[22-23]顯示：Kat5可通過PI3K/AKT信號通路調(diào)節(jié)前列腺癌細(xì)胞的增殖過程。因?yàn)榧谞钕侔┲蠵I3K/AKT信號通路激活，Kat5可通過PI3K/AKT信號通路影響惡性腫瘤細(xì)胞的增殖，推測Kat5可能通過PI3K/AKT信號通路影響甲狀腺癌細(xì)胞增殖和凋亡。本文作者發(fā)現(xiàn)：沉默甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞中Kat5基因可降低細(xì)胞中p-PI3K和p-AKT蛋白表達(dá)水平，因此Kat5可能通過抑制PI3K/AKT信號通路抑制甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞的增殖并促進(jìn)其凋亡。

綜上所述，甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞中Kat5表達(dá)水平升高，下調(diào)Kat5表達(dá)水平可能通過抑制PI3K/AKT信號通路抑制甲狀腺乳頭狀癌發(fā)生發(fā)展。