毛細管電泳與核酸適配體高效篩選

朱超 趙新穎 楊歌 屈鋒

摘?要?指數富集配體系統進化（SELEX）技術是核酸適配體篩選的通用技術，精準高效的篩選方法和篩選策略設計是成功篩選適配體的關鍵。本文概述了本課題組自2007年以來，應用毛細管電泳（CE）技術研究核酸適配體高效篩選的有關工作，包括CE在核酸適配體篩選前、篩選中及篩選后各環(huán)節(jié)中的分析分離應用、不同蛋白靶的分類及篩選策略、多種CE篩選模式和多尺度靶標的核酸適配體篩選。同時，探討了SELEX中存在的問題，并對其發(fā)展前景進行了展望。

關鍵詞?毛細管電泳;?核酸適配體篩選策略;?多模式篩選;?多尺度靶標;評述

1?引 言

核酸適配體（Aptamer，ssDNA[1]或RNA[2～4]）作為新型、靈活的分子識別元件，在生物學、化學、醫(yī)學、 環(huán)境和食品科學以及生物信息學領域受到廣泛關注[5]。它們可折疊為復雜的三維結構基序（Motif），具有配體、催化、基因調控等多種功能[6，7]。1990年，Tuerk和Gold建立的指數富集配體系統進化（Systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX）技術[4]，至今仍是公認的適配體篩選方法。SELEX過程各步驟的精準高效是適配體成功篩選的關鍵[8，9]。目前，適配體的高效篩選仍然面臨瓶頸，也制約著適配體的發(fā)展和應用。影響篩選效率有兩個關鍵步驟：（1）復合物的形成和分離，即靶物質與核酸庫序列結合形成復合物，復合物與未結合的核酸序列分離;（2）次級庫的高保真制備，即通過PCR擴增復合物中的核酸序列，制備高保真的次級核酸庫。

目前，普遍采用的分離方法如磁珠法、親和微柱法都需要固體介質，難以避免由介質產生的非特異性結合，增加了篩選步驟和干擾因素[10，11]。毛細管電泳法（Capillary electrophoresis，CE）不需介質參與，靶標處于自然分子狀態(tài)與核酸結合，在自由溶液中實現復合物高效分離，并且分離過程中可同時提供復合物與未結合核酸的信息[12，13]。此外，CE既可實現定性與定量分析，還可用于SELEX過程的分析評價[12]，是公認的高效篩選技術之一。目前，利用CE-SELEX技術已篩選出30余種靶標的適配體，應用結果評價較好[13]。本研究組自2007年起開展CE-SELEX方法研究以來，翻譯完成了《核酸適配體手冊》和《生物分析中的核酸適配體》兩部專著[14，15]，連續(xù)8年撰寫CE技術年度回顧[16～22]，針對適配體篩選存在的科學問題，包括適配體篩選的機理、篩選過程中的關鍵步驟及不同靶標篩選的特點等，進行了較深入研究，并建立了適配體高效篩選的策略和方法。本文對本研究組基于CE-SELEX的研究工作進行了概述總結，包括CE在適配體篩選前、篩選中及篩選后各環(huán)節(jié)中的分析分離應用、不同靶蛋白的分類及篩選策略、多種毛細管電泳篩選模式、 多尺度靶標的適配體篩選，結合SELEX研究進展，探討了SELEX研究中存在的問題。

2?毛細管電泳的分析分離應用

2.1?篩選前的表征及結合條件優(yōu)化

2.1.1?靶標的性質和質量表征?蛋白靶標的純度、穩(wěn)定性、保存條件、荷電性等參數的評價與表征非常必要，是有效篩選的前提。尤其是實驗室制備的蛋白，篩選前進行性質表征和質量評價更為必要。利用CE，僅使用極少量的樣品就可實現快速分析評價[23]，避免因樣品自身問題而影響篩選結果。對完全未知的蛋白，可使用毛細管等電聚焦、毛細管凝膠電泳準確測定其等電點（pI）和分子量，也可通過中性分子和蛋白Marker進行比較評估[24]。小分子靶標性質已知，通常樣品穩(wěn)定性相對較好，無需特別考慮。細胞和微生物樣品[25～27]具有非均一性，且受樣品培養(yǎng)條件和生產周期的影響，CE分析很難得到單一的峰，評價意義不大。

2.1.2?初始核酸庫的影響?初始核酸庫的質量是決定篩選效率的關鍵因素。商品化核酸庫可能存在質量差異和批次差異，利用CE可以快速比較生產廠家、純化方法、熒光標記、液固態(tài)樣品和樣品溶劑的影響[28]?；诔跏己怂釒熘泻怂岱肿拥倪w移速率差異建立的核酸庫的分級分離方法[29]，使大容量的核酸庫拆分為多個次級核酸庫，提高了篩選效率。比較了不同序列長度的核酸庫與不同蛋白靶標的相互作用[30，31]，結果表明，不同蛋白靶標對序列長度具有選擇性，提示隨意選擇核酸庫的長度不利于得到高效的適配體。進一步研究了初始核酸庫的容量對適配體篩選效率的影響[32]。不同容量初始核酸庫經兩輪篩選均得到了微摩爾級的適配體，說明初始核酸庫的容量對篩選效率沒有顯著影響。雖然高濃度的初始核酸庫可能增加序列的多樣性，但多樣性的序列并不決定其必然的高親和力，這也說明核酸庫中序列的多樣性可能并非是獲得高親和力適配體的關鍵，設法分離得到親和力強的核酸序列才是成功篩選的關鍵。

2.1.3?篩選條件的優(yōu)化?篩選過程中靶標與核酸庫的孵育條件（溶液體系、pH、溫度、金屬離子等）直接影響復合物的形成和適配體的應用性能。目前，絕大多數報道的孵育條件都是借鑒前人經驗，系統研究篩選條件的報道很少。利用CE優(yōu)化篩選條件，結果直觀，分離快速，耗樣極少，較常規(guī)方法大大減少工作量和研究成本[12，13]。楊歌等[31]以脫鐵轉鐵蛋白為模式蛋白進行研究，發(fā)現緩沖液種類和pH值以及孵育溫度均影響靶蛋白與核酸復合物的形成。加入低濃度的金屬離子（如K+、Ca2+、Mg2+）可促進復合物形成。因不同靶標的性質和結構不同，篩選前針對特定靶標需要確定優(yōu)化的孵育條件。

2.2?篩選中的次級核酸庫分析

2.2.1?次級核酸庫親和力分析?SELEX過程中，每輪產生的次級核酸庫與靶標親和力的提升是決定繼續(xù)或終止篩選的依據。對每輪篩選得到的次級核酸庫，應分析其與靶標的親和力，利用平衡混合物的非平衡毛細管電泳（NECEEM）[33]或非線性擬合方法[34]測定平衡解離常數（KD）。如KD值持續(xù)降低，則繼續(xù)篩選。如KD值變化不明顯或升高，可終止篩選，減少不必要的篩選過程。例如，楊歌等[30]在篩選IgG的Fc片段適配體過程中發(fā)現，二級庫、三級庫的KD值持續(xù)降低，四級庫則與三級庫的KD值相當，降低不明顯，故終止篩選，從三級庫中選擇候選序列。

2.2.2?次級核酸庫質量評價?PCR過程中因堿基的偏向擴增、錯配、突變等因素產生的副產物[35，36]不可避免。另外，實驗過程中的操作污染、試劑污染、氣溶膠污染也會導致PCR結果的不準確。因此，對次級核酸庫的質量評價非常必要，是繼續(xù)篩選的前提。利用毛細管區(qū)帶電泳表征各輪次級庫時發(fā)現，四級庫的核酸主峰右側出現了清晰的雜峰[37]，說明篩選過程中四級庫已含有非目標核酸，核酸庫質量已受到影響。篩選過程僅需使用極少量的核酸樣品，即可實現高分辨率、快速的次級庫質量評價。

2.3?篩選后的適配體親和力測定?目前，文獻報道了多種測定適配體親和力的方法，包括表面等離子共振法、膜干涉法、等溫量熱滴定法、微量熱泳動法、紫外光譜和熒光光譜法等，但不同方法間測定KD值的評價標準還未建立，主要因為這些方法原理不同、測定條件不同，導致測定的KD難以相互比較[38，39]，甚至有數量級的差異。CE是一種非平衡結合過程，測得的KD通常比其它方法大，但并不意味實際的親和力更弱[40]。即使同是利用基于毛細管電泳的非線性擬合與NECEEM方法，其結果也有差異[37]。另外，采用NECEEM方法時，濃度比、分離溫度等實驗條件均影響峰面積和KD值。通過基于積分偏差的方法[41]對NECEEM計算KD值時的誤差進行分析，結果表明，當峰面積在10%的偏差區(qū)間內，KD值的最大相對偏差小于7%，故條件引起的峰面積誤差可忽略。

3?不同蛋白靶標的篩選策略

CE具有在線可視化的優(yōu)勢，通過直觀地觀察復合物峰和核酸庫峰可快速評估蛋白靶與初始核酸庫的結合強弱，并可測定KD值。根據CE特征電泳圖，可將蛋白靶標歸屬為高、中、低親和力三類，建立不同靶蛋白的篩選策略[42]。高親和力蛋白的電泳圖中可見明顯的蛋白-核酸復合物峰，并使核酸庫峰面積降低達50%以上，初始KD<50 μmol/L。這說明高親和力類蛋白對核酸序列的選擇性不高，應重點考慮特異性篩選。中親和力蛋白的電泳圖可見，小的復合物峰及復合物解離區(qū)，核酸庫峰面積降低約30%，初始KD<1 mmol/L，對其親和力和特異性篩選應處于同等考慮。低親和力蛋白的電泳圖中難以看到復合物峰和解離區(qū)，且核酸庫的峰面積降低小于10%，初始KD>1 mmol/L，說明核酸庫中有極少量的序列與蛋白結合。低親和力蛋白與核酸的復合物難以形成，需優(yōu)化篩選條件，或者使用修飾的核酸庫，提升蛋白對核酸庫的親和力，才能獲得較高親和力的適配體。

本研究組評價了40種靶蛋白與初始核酸庫結合的電泳圖譜特征、KD值、逐輪篩選時序列的親和力和特異性進化效率，并逐一分析了已報道的20多種靶蛋白的CE-SELEX篩選過程，發(fā)現這些蛋白及篩選方法都符合本研究組提出的蛋白靶分類模型和篩選策略。此外，由于堿性蛋白在毛細管壁存在吸附，篩選時要采用抑制吸附的分離方法[43，44]。利用CE分析蛋白與核酸庫的親和力，根據特征圖譜，可針對不同蛋白采取不同的篩選策略和篩選方案，避免盲目篩選，顯著提高篩選效率。

4?多功能毛細管電泳篩選模式

2004年，Bowser課題組首次利用CE-SELEX篩選適配體[34]，至今約有10種改進的篩選方法，如低pH CE 篩選（Low-pH-CE-SELEX[44]）、 一步在線反應CE篩選（Single step CE-SELEX，ssCE-SELEX[37]）、 同步競爭CE篩選（Synchronized competition CE-SELEX，scCE-SELEX[45]）、 平衡混合物的非平衡毛細管電泳（Non-equilibrium capillary electrophoresis of equilibrium mixtures，NECEEM[33]）、平衡混合物的平衡毛細管電泳（Equilibrium capillary electrophoresis of equilibrium mixtures，ECEEM[46]）、Non-SELEX[47]、 理想分離CE篩選（Ideal filter capillary electrophoresis，IFCE[48]）、 片段式收集CE篩選（Fraction collection CE-SELEX，FCE-SELEX[49]）、 高分子聚合物輔助的毛細管瞬時等速電泳篩選（Polymer-enhanced capillary transient isotachophoresis，PectI-SELEX[50]）的研究進展。2019年，本研究組[13]系統總結了CE-SELEX，并結合本研究組的研究經驗，對CE篩選適配體的各技術環(huán)節(jié)進行了詳細介紹?；诤Y選中的問題導向，本研究組建立了3種新篩選模式。

4.1?Low-pH-CE-SELEX模式[44]

實現了靶蛋白-核酸復合物與核酸的反向遷移和完全分離，使復合物收集更準確方便。低pH條件下抑制了電滲流，克服堿性蛋白吸附，可增加進樣時間，增大進樣體積。

4.2?ssCE-SELEX模式[37，51]

一步電泳完成靶蛋白與核酸庫的混合、孵育、柱上反應、分離、檢測、收集，實現一步柱上反應篩選。該模式中，僅通過改變蛋白和核酸進樣時間，即可調控反應摩爾比?？刂齐妷嚎蓪崿F在線孵育。篩選僅消耗幾十納升樣品，適合貴重、稀有、難制備蛋白的適配體篩選。

4.3?scCE-SELEX模式[45]

實現雙靶蛋白的同時篩選和競爭篩選。基于CE的高分辨分離，一次電泳可收集兩種復合物，一步篩選可得到兩種蛋白的高親和力和高特異性適配體，大大提高了篩選效率。并且，兩種蛋白共存，互為反篩靶，明顯降低了非特異性結合，提高了適配體的親和力和特異性。

上述模式的建立和應用充分體現了CE的多功能和實用性，可實現高效、快速的適配體篩選。

5?多尺度靶標的核酸適配體篩選

核酸適配體的靶標范圍涵蓋小分子[52]、蛋白[53，54]、細胞[55]和微生物[56]等多種目標物。研究結果和實踐經驗表明，CE-SELEX可用于各種靶標的適配體篩選，特別是在蛋白靶標的適配體篩選方面具有明顯的優(yōu)勢。目前，本研究組已經進行了從小分子、蛋白質到細胞和微生物的適配體篩選研究。

5.1?蛋白質

利用多功能毛細管電泳篩選模式，篩選了脫鐵轉鐵蛋白[31]、人凝血酶[37]、牛乳鐵蛋白[57]、鈣網蛋白[58]、Ig G（Fc片段）[30]、NSE[32]、spyCas9、Rec A、OGG1和PDGF-BB等十余種蛋白的核酸適配體。在2020年的新冠疫情期間，本研究組在14天內快速篩選了新冠病毒結合蛋白Spike及ACE2的適配體，擬用于阻斷Spike蛋白與其受體ACE2的結合。此外，還建立了研究蛋白與其它小分子、肽核酸、蛋白相互作用的多模式毛細管電泳方法[59～65]，以及一些靈敏的檢測方法[66～70]，為適配體篩選前的表征和檢測應用提供指導。

5.2?小分子

與核酸形成的復合物的遷移速率與核酸自身的遷移速率差距很小，難以直接分離得到復合物，前述的篩選模式都不適合。但有些小分子可以通過收集核酸庫峰前面的一段區(qū)域（電泳圖中不可見的解離區(qū)）進行篩選。據此方法篩選了鹽酸克倫特羅的適配體[40]。此外，本研究組還設計了針對對映體分子分離的雙區(qū)段串聯填充毛細管電泳（ppPF-CE）模式，為手性分子的適配體篩選奠定了基礎[71]。

5.3?細胞和微生物

針對全細胞的適配體篩選，建立了3種細胞（U251、Hela、PC3）與核酸庫結合的評價方法。3種細胞與核酸庫形成的復合物峰有明顯區(qū)別，收集復合物區(qū)域可進行后續(xù)篩選[72]。針對微生物的適配體篩選，以大腸桿菌（革蘭氏陰性菌）和嗜酸乳桿菌（革蘭氏陽性菌）為模式細菌，建立了毛細管區(qū)帶電泳和毛細管親和電泳表征和評價方法。由于細菌與核酸庫的結合較弱，難以判斷復合物峰，也可以采用小分子的篩選方法。細菌去壁后的原生質體與核酸庫的結合顯著增強，類似于全細胞，可采用全細胞的篩選方法[73]。

6?總 結

自2004年CE-SELEX用于適配體篩選以來，已展示了其所需樣品和試劑量少、實驗結果可視化和成本低等明顯的優(yōu)勢。本研究組經過十余年CE-SELEX的研究積累，建立了一系列CE方法，實現了適配體篩選的高效快速分離、相互作用分析、結合條件優(yōu)化和篩選過程的監(jiān)測，解決了同步正負篩選、多靶篩選等問題，克服了其它篩選方法的不足。結合目前適配體篩選的研究進展[8，74～76]以及本研究組的實踐經驗，SELEX技術還存在一些共性問題，如無標準化的篩選程序和方法，難以控制次級庫制備和測序中PCR擴增的偏性，缺少對高通量測序產生的海量數據進行有效分析和選擇的法則，也缺少適配體親和力的一致性評價方法，以及如何實現在適配體實際應用環(huán)境下的高效篩選和適配體的修飾和功能提升等，這也是本研究組未來SELEX研究的方向。

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