基于微流控芯片的核酸適配體篩選技術研究進展

姜浩 呂雪飛 趙可心

摘?要?適配體（Aptamer）是通過指數(shù)富集的配體系統(tǒng)進化技術（SELEX）篩選得到的，可與靶標分子以高親和力特異性結合的單鏈DNA或RNA，在生物分離分析、臨床診斷和疾病靶向治療等領域應用廣泛。適配體的發(fā)展與篩選技術的進步密切相關，以SELEX為基礎，研究者開發(fā)了磁珠SELEX和毛細管電泳SELEX等多種適配體體外篩選技術，但這些方法存在篩選輪次多、篩選周期長和樣品消耗量大、對小分子篩選效率低等缺點。微流控芯片具有體積小、高通量和易集成等特點，基于微流控芯片的SELEX技術在一定程度上可解決上述問題，實現(xiàn)適配體快速、高通量的體外篩選。本文在總結SELEX及其關鍵技術要點的基礎上，重點評述了基于微流控和微陣列芯片SELEX技術的研究進展，并對SELEX技術中未來的發(fā)展方向進行了總結和展望。

關鍵詞?適配體;篩選;指數(shù)富集的配體系統(tǒng)進化技術;微流控芯片;微陣列芯片;評述

1?引 言

適配體是通過指數(shù)富集的配體系統(tǒng)進化技術（Systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX）在體外篩選得到的一段寡聚核糖核苷酸（RNA）或單鏈脫氧核糖核苷酸（ssDNA）序列，與靶標分子之間具有特異性相互作用，借助范德華力、氫鍵、疏水作用和靜電作用等分子間作用力，折疊成復雜穩(wěn)定的3D結構，如莖環(huán)[1]、發(fā)夾[2]和G四鏈體[3]等。自1990年Ellington[4]和Tuerk[5]從含有1015種寡核苷酸文庫中篩選出RNA適配體以來，研究者陸續(xù)篩選出許多適配體，其靶標范圍覆蓋了金屬離子、三磷酸腺苷（ATP）、氨基酸等小分子物質(zhì);生長因子和細胞粘附分子等蛋白質(zhì)以及其它大分子有機物，甚至可通過靶向特定的膜蛋白識別病毒、細菌和細胞。目前，適配體已被廣泛用于靶向藥物遞送[6]、生物分子識別和檢測[7]等領域，并已嘗試用于臨床治療方面[8]。

適配體與靶標分子的親和力可達mmol/L～pmol/L級別，與抗體水平相當[9]。適配體具有抗體不能比擬的優(yōu)勢，如更高的選擇性和穩(wěn)定性、制備簡單、易修飾、無免疫原性等，因此受到研究者關注。

適配體的發(fā)展與篩選技術的進步密切相關。研究者根據(jù)SELEX的關鍵技術要點對傳統(tǒng)篩選技術進行了改良，如依據(jù)結合與未結合寡核苷酸的分離技術，提出了基于磁珠分離法的SELEX技術[10]和基于毛細管電泳分離法的SELEX技術[11]等;提出了基于不對稱PCR法[12]、λ核酸外切酶法[13]和磁珠法的次級文庫制備技術[14]。但是，SELEX技術仍存在篩選輪次多、篩選周期長、文庫合成量大、利用率低、樣品消耗量大等問題。微流控芯片具有體積小、高通量和易集成等特點，基于微流控芯片的SELEX技術在一定程度上可解決上述問題，為實現(xiàn)適配體快速、高通量的體外篩選提供了新思路。

本文依據(jù)近年來適配體篩選技術的研究進展，在總結SELEX及其關鍵技術要點的基礎之上，重點評述了基于微流控芯片和微陣列芯片SELEX技術的研究進展。

2?SELEX及其關鍵技術要點

2.1?SELEX技術

SELEX技術首先需構建一個特定長度、庫容量為1014～1015的寡核苷酸文庫，理論上，該文庫應包含所有序列的適配體;然后，將文庫與靶標分子孵育、洗滌后，將未結合和結合不牢固的寡核苷酸洗掉，收集牢固結合的寡核苷酸與靶標分子復合物，采用聚合酶鏈式反應（Polymerase chain reaction，PCR）對收集到的寡核苷酸進行擴增，制備次級文庫，用于下一輪的篩選;經(jīng)過十余輪的篩選即可得到與靶標分子具有較高親和力的適配體候選物;最后，通過克隆與測序，得到相應的適配體序列。

2.2?結合與未結合寡核苷酸的分離技術

2.2.1?基于磁珠的結合與未結合寡核苷酸的分離技術?磁珠表面可修飾多種功能化基團，如鏈霉親和素、氨基、羧基和甲苯磺?；龋m用于不同靶標分子的固定[10]，并可利用磁場實現(xiàn)快速分離。因此，磁珠SELEX技術是目前應用最廣的固定靶標的適配體篩選技術。

本研究組在前期的工作中，建立了基于磁珠分離法的SELEX技術（磁珠SELEX），用于生物大分子的適配體篩選。例如，Xiao等[15]通過磁珠SELEX技術篩選出一組特異性與胰蛋白酶結合的適配體，并作為酶的固載介質(zhì)，制備了基于適配體的酶反應器，與質(zhì)譜技術聯(lián)用，用于蛋白質(zhì)的在線酶解。Zhang等[16]通過磁珠SELEX技術篩選得到一組肌酸激酶同工酶的適配體，并進一步優(yōu)化出可結合肌酸激酶同工酶不同位點的一對適配體，建立了基于雙適配體夾心的熒光側向流層析技術，實現(xiàn)了肌酸激酶同工酶的定量檢測。

但是，磁珠SELEX技術存在靶標分子易過度修飾問題，過高密度的靶標分子間的協(xié)同作用會降低每輪篩選中寡核苷酸的富集效率[17]，可能對篩選進程產(chǎn)生影響。Hünniger等[18]建立了快速磁分離和固相乳液PCR（emPCR）的適配體篩選技術，將文庫與靶標分子的孵育、洗滌和洗脫等步驟集成為“FISHing”自動化程序，將所得的洗脫液直接通過emPCR進行擴增。所建立的篩選技術用于葡萄酒澄清劑中溶菌酶的適配體篩選，得到了親和力在nmol/L級的適配體（Kd=4.0～20.7 nmol/L），與以往報道的溶菌酶的適配體親和力（Kd=2.8～52.9 nmol/L）相當[19]。

2.2.2?基于毛細管電泳的結合與未結合寡核苷酸的分離技術?毛細管電泳（Capillary electrophoresis，CE）可根據(jù)寡核苷酸與寡核苷酸-靶標復合物在電場中的遷移速度不同實現(xiàn)分離。通常情況下，復合物的遷移較寡核苷酸慢，與之對應的篩選技術為毛細管電泳SELEX技術（CE-SELEX）。不同于磁珠SELEX，CE-SELEX技術無需固定靶標，只需2～4輪即可篩選出能結合靶標的適配體，大大加快了篩選進程。但是，CE-SELEX技術會出現(xiàn)結合與未結合靶標分子的寡核苷酸均向毛細管電泳儀的出口端移動，會對適配體的篩選產(chǎn)生一些干擾，因此需要嚴格控制篩選時間，這可能會導致文庫富集率低等問題[20]。

研究人員先后在CE-SELEX技術的改良方面做了很多創(chuàng)新性的工作，提出了低pH CE-SELEX技術（LpH-CE-SELEX）[21]、分流收集CE-SELEX技術（FCE-SELEX）[22]和同步競爭CE-SELEX技術（scCE-SELEX）[20]等，其中，LpH-CE-SELEX在一定程度上避免了未結合靶標分子的寡核苷酸對篩選過程的干擾，F(xiàn)CE-SELEX有效降低了被其它寡核苷酸污染的可能性，scCE-SELEX可實現(xiàn)多個靶標分子適配體的同時篩選。

2.3?次級文庫的制備技術

作為新一輪SELEX的起點，次級文庫中寡核苷酸的數(shù)量和質(zhì)量對篩選結果至關重要。因此，次級文庫制備技術成為適配體篩選的關鍵技術之一。

2.3.1?磁珠法制備次級文庫?利用鏈霉親和素與生物素之間的非共價相互作用以及磁珠在磁場下易操作的特點，磁珠在次級文庫制備中發(fā)揮了重要作用[14]。首先，利用生物素標記的引物進行PCR擴增得到生物素化的雙鏈DNA;然后，生物素化的雙鏈DNA與鏈霉親和素修飾的磁珠共同孵育;最后，在堿性條件下，雙鏈DNA變性解鏈，磁分離后，上清液中不帶生物素的正義鏈經(jīng)乙醇沉淀回收，即為制備的次級文庫。

2.3.2?λ核酸外切酶法制備次級文庫?λ核酸外切酶作用于5端修飾有磷酸基團的雙鏈DNA，可通過其對5端磷酸化的雙鏈DNA的水解制備次級文庫[13]。首先，利用帶磷酸基團標記的引物進行PCR擴增，得到5端磷酸化的雙鏈DNA;其次，λ核酸外切酶水解5端磷酸化的雙鏈DNA，使其反義鏈從5端逐步降解;最后，利用乙醇沉淀等方式將正義鏈回收，即得到所需的次級文庫。

2.3.3?不對稱PCR法制備次級文庫?不對稱PCR法是利用不等量的一對引物擴增產(chǎn)生大量單鏈DNA的方法，在次級文庫制備和核苷酸序列分析中具有重要作用[12]。通過控制限制引物和非限制引物濃度的比例（1∶50～1∶100）達到制備單鏈DNA的目的。反應初期的主要產(chǎn)物為雙鏈DNA，待限制引物用盡后，反應產(chǎn)生的均為正義鏈。最后，對正義鏈和雙鏈DNA進行電泳分離，回收得到的正義鏈即為制備的次級文庫。

3微流控芯片SELEX技術

3.1?微流控芯片概念及特點

微流控芯片又稱為微全分析系統(tǒng)，是由Manz等[23]在20世紀90年代首次提出并發(fā)展起來的跨學科分析技術。通過微加工技術，在硅、玻璃或有機聚合物基質(zhì)上構建流體微通道、反應微腔室和儲液池等微結構單元，將分析過程的樣品制備、反應、分離、檢測等基本操作單元集成到一塊微米尺度的芯片上，自動完成分析全過程。微流控芯片具有集成化、小型化、自動化等特點，以及樣品和試劑消耗量少、反應速度快、可大量平行處理等優(yōu)點，在生物、化學和醫(yī)學等領域表現(xiàn)出巨大的發(fā)展?jié)摿?。目前，微流控芯片技術已被廣泛用于細胞培養(yǎng)[24]、基因擴增與分析[25～27]和蛋白質(zhì)檢測[28]等領域。

基于微流控芯片的SELEX技術是近年發(fā)展起來的一種快速高效的適配體篩選體系。將微流控芯片與SELEX技術結合，可將樣品和試劑的消耗量降至微升級，大大降低了篩選成本，提升了分析速度和準確性。目前，已發(fā)展的微流控芯片SELEX技術主要包括磁珠法[29]和溶膠-凝膠法[30]等。

3.2?微流控芯片SELEX技術篩選適配體

3.2.1?基于磁珠的微流控SELEX技術?基于磁珠的微流控SELEX技術主要包括連續(xù)流磁激活分離芯片（Continuous-flow magnetic activated chip-based separation，CMACS）系統(tǒng)和微磁分離（Micro magnet separation，MMS）系統(tǒng)。

Soh研究組[31]利用CMACS系統(tǒng)，通過芯片連續(xù)流磁分離對重組A型肉毒桿菌神經(jīng)毒素輕鏈的適配體進行篩選（圖1）。首先，通過PCR擴增制備DNA文庫，并通過1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺（EDC）介導法將靶標分子固定在磁珠上;然后，將DNA文庫與固定有靶標分子的磁珠共同孵育，在CMACS芯片上進行連續(xù)洗滌;最后，用生物素化的反義引物進行PCR擴增，通過磁珠法制備次級文庫，并測定其親和力。

然而，CMACS系統(tǒng)使用過程會出現(xiàn)微氣泡導致的氣流扭曲，以及微通道阻塞導致的磁珠聚集等問題，影響適配體的純度和回收率。在后續(xù)的研究中，Soh研究組[32]開發(fā)了MMS系統(tǒng)（圖2），將鐵磁材料整合到微通道中，通過芯片中鎳材料和緩沖液間磁導率的相對差異，實現(xiàn)對通道內(nèi)流體動力和磁致動力的精確控制[33]，減少了磁珠和適配體候選物的損失，實現(xiàn)了較高的分子分配效率。

Huang等[34]在MMS芯片的基礎上，將反應池、分離通道和微加熱系統(tǒng)整合到一塊芯片上，成功篩選出C反應蛋白的適配體，與傳統(tǒng)SELEX技術相比，基于微流控芯片的SELEX技術在單輪篩選時間和樣品消耗量上均大大降低。

Ahmad等[35]利用MMS芯片高效的捕獲能力和可高流速洗滌的特點，成功篩選出3種蛋白質(zhì)的適配體：人血小板衍生生長因子BB（Kd=0.028 nmol/L）、凝血酶（Kd=0.33 nmol/L）和載脂蛋白E3（Kd=3.1 nmol/L）。通過低濃度蛋白篩選和高流速、長時間洗滌，降低了非特異性吸附和弱結合的情況，獲得了與文獻[36，37]不同的人血小板衍生生長因子BB和凝血酶的適配體序列，而且親和力也有了較大程度的提升。研究人員還發(fā)現(xiàn)適配體的親和力受蛋白質(zhì)帶電狀態(tài)的影響，由人血小板衍生生長因子BB在不同pH條件下的篩選結果發(fā)現(xiàn)，在酸性緩沖液中，其與適配體具有更高的親和力。

Stoltenburg等[38]使用常規(guī)磁珠SELEX技術經(jīng)13輪篩選得到鏈霉親和素的適配體，其解離常數(shù)約為56～86 nmol/L。而使用MMS系統(tǒng)經(jīng)3輪分離后即得到了解離常數(shù)在25～65 nmol/L之間的適配體。由此可見，基于微流控芯片的微磁分離SELEX技術比常規(guī)的磁珠SELEX技術更高效。

3.2.2?基于溶膠-凝膠的微流控SELEX技術?溶膠-凝膠是用含高化學活性的化合物作為前體，在液相下均勻混合并進行水解、縮合等反應，形成穩(wěn)定的透明溶膠體系，經(jīng)過膠粒間緩慢聚合，形成三維空間網(wǎng)絡結構的凝膠。凝膠經(jīng)過干燥、燒結、固化，制備出納米乃至亞納米結構的材料。通過溶膠-凝膠及其衍生物材料固定蛋白質(zhì)，無需親和試劑標記，加入硅酸鹽可最大程度地保持蛋白質(zhì)的生物活性[39]，且可長期保存不失活[40]。此外，溶膠-凝膠材料價格相對便宜，與芯片底板材料性質(zhì)相近，具有極好的相容性。這些特點為溶膠-凝膠在微流控芯片上的應用和這一類型芯片的大規(guī)模生產(chǎn)奠定了基礎[41]。

基于溶膠-凝膠的微流控SELEX技術中，靶標分子包裹于具有多孔納米結構的硅酸鹽水凝膠中，寡核苷酸進入納米孔與靶標分子結合[42]。因此，溶膠-凝膠顆粒的加工工藝極為關鍵[43～45]。首先，溶膠-凝膠基質(zhì)中納米孔結構的尺寸必須與靶標分子匹配;其次，溶膠-凝膠顆粒須在點樣后長時間穩(wěn)定存在，并且有足夠強的粘附力，以防洗滌過程中顆粒丟失;最后，每個顆粒的形態(tài)與尺寸必須統(tǒng)一，這對采用計算機自動分析實驗結果至關重要。

Ahn等[46]在芯片上集成溶膠-凝膠腔室和微加熱器等結構單元，用于文庫的洗脫和篩選（圖3）。該芯片帶有一組鋁電極、5個相連的六邊形腔室和聚二甲基硅氧烷（Polydimethylsiloxane，PDMS）微通道，各腔室靶標分子競爭性結合寡核苷酸鏈。每個腔室內(nèi)單個溶膠-凝膠顆粒的體積約為7 nL，每個顆粒可容納30 fmol蛋白質(zhì)。將該技術用于酵母TATA結合蛋白和幾種同源蛋白質(zhì)的適配體篩選，僅經(jīng)過6輪篩選，得到了解離常數(shù)為2.7 nmol/L的TATA結合蛋白的適配體。

小分子適配體的體外篩選工作極具挑戰(zhàn)性，一是因為小分子難以固定;二是受小分子本身結合位點數(shù)的限制，篩選出的適配體與小分子的結合也會受到影響。通過改變?nèi)苣z-凝膠顆?？讖降某叽纾珊芎玫貙崿F(xiàn)小分子靶標的固定。Bae等[47]加工了具有納米孔徑和微米通道的溶膠-凝膠顆粒，寡核苷酸可在微米通道內(nèi)自由移動，但與小分子靶標相互作用后，被截留在溶膠-凝膠顆粒中。通過基于溶膠-凝膠法的微流控SELEX技術，采用7輪篩選得到了黃嘌呤的適配體，解離常數(shù)為4.2 μmol/L。

微流控芯片與SELEX技術結合，提高了適配體的篩選效率，降低了篩選成本。但是，基于微流控芯片的適配體篩選技術在流體流動過程中常會產(chǎn)生氣泡[48]，對靶標分子與適配體的識別，以及后續(xù)的PCR擴增等均會產(chǎn)生影響。

4?微陣列芯片SELEX技術篩選適配體

4.1?微陣列芯片及其分類

微陣列芯片是通過微點陣技術或微顆粒填充技術將數(shù)以萬計的生物探針固定在基板上，通過生物探針與溶液中的待測分子特異性結合完成分析和檢測過程。微陣列芯片表面不存在微通道、微腔室等微結構，無需考慮流體在芯片內(nèi)部流動造成的堵塞和氣泡等問題，降低了芯片加工和使用的難度。另外，微陣列芯片的實驗結果可通過計算機陣列分析技術獲得。

4.1.1?核酸微陣列芯片與蛋白質(zhì)微陣列芯片

核酸微陣列芯片常以玻璃、硅和塑料作為基板材料，通過光引導原位合成技術[49]或物理遞送技術制造高密度核酸陣列，其中，物理遞送技術，如噴墨或微噴射沉積[50]，可將納升甚至皮升的溶液體積分配和點樣到微陣列芯片的特定部位。微陣列芯片上檢測探針與帶有修飾的報告探針（如熒光、化學發(fā)光、放射性同位素等）結合，通過檢測報告探針完成信號檢測[51]。

與核酸微陣列芯片相同，蛋白質(zhì)微陣列芯片的構建最初是直接將蛋白質(zhì)點樣在相關載體上。常用于制作蛋白質(zhì)微陣列芯片的載體有硝酸纖維素膜、硅樹脂、玻璃和塑料等[52]。載體的固定對蛋白質(zhì)的生物活性和空間結構的維持有一定的影響。另外，常見的蛋白質(zhì)微陣列芯片的制備工藝中通常只點樣一種蛋白質(zhì)，將多種蛋白質(zhì)點樣在一塊微陣列芯片上的報道較少[53]。

4.1.2?微顆粒陣列芯片?微顆粒因其具有比表面積大、結合動力學快的特點而在生化分析中得到廣泛應用[54]。與傳統(tǒng)的平面微陣列芯片相比，微顆粒微陣列芯片利用其上的微顆?？蓪崿F(xiàn)對生物分子的更快、更靈敏的檢測[55]。同時，微顆粒微陣列芯片易實現(xiàn)多種蛋白質(zhì)的固定[56]。

Zhu等[54]通過光聚合反應，以4-二甲氨基吡啶（4-Dimethylaminopyridine，DMAP）作為光引發(fā)劑，將摻雜DMAP和丙烯酰胺/雙丙烯酰胺的溶液按照掩膜圖案進行交聯(lián)反應，形成微陣列芯片的微結構，并采用物理俘獲法實現(xiàn)微顆粒在微陣列芯片上的填充，有效克服了靜電自組裝和電場輔助組裝中微顆粒必須帶電的問題。每塊芯片上有40個凝膠墊陣列單元，每個單元外周均以聚乙二醇微柱作為親水屏障，將試劑和樣品限制在微陣列芯片上。他們利用該芯片初步實現(xiàn)了前列腺特異性抗原和人絨毛膜促性腺激素的免疫測定。Kim等[57]報道了一種微顆粒陣列芯片的加工工藝，即用停流光刻法進行微顆粒的加工，通過負壓法實現(xiàn)微顆粒在陣列芯片上的填充。另外，他們還通過改變掩膜圖案，制作出形狀各異的微顆粒，并成功生成了防偽應用程序的二維粒子陣列代碼。

微陣列芯片不存在氣泡等問題帶來的干擾，而且微陣列芯片上固定的靶標數(shù)量大、種類多。特別是微顆粒陣列芯片的出現(xiàn)，可使不同靶標分子固定于不同微顆粒上，再將這些微顆粒填充于相應區(qū)域，便于檢測且不會產(chǎn)生干擾。微陣列芯片與SELEX技術的結合為發(fā)展新型適配體篩選技術提供了思路。

4.2?微陣列芯片SELEX在適配體篩選中的應用

4.2.1?基于溶膠-凝膠的微陣列SELEX技術篩選適配體?基于微陣列SELEX技術篩選適配體時，研究者將蛋白質(zhì)靶標包裹于凝膠顆粒內(nèi)，再點樣于微陣列芯片上，可有效維持蛋白質(zhì)的生物活性和空間結構。例如，Park等[58]將包裹有蛋白質(zhì)的凝膠顆粒點樣在微加熱器上，在微混合器的作用下，先后在微陣列芯片上完成寡核苷酸文庫與靶標分子的結合、洗滌和洗脫等過程。目前，利用該芯片可同時實現(xiàn)5種靶標分子適配體的篩選。

溶膠-凝膠顆粒已廣泛用于大分子的捕獲，但將其應用于小分子的捕獲時仍存在一定挑戰(zhàn)，原因在于，若將溶膠-凝膠設計為截留小分子，通常會損害溶膠-凝膠顆粒與常規(guī)基質(zhì)（如微量滴定孔板聚合物）的粘附性[59]。Ahn等[60]基于陽極刻蝕技術和電化學工藝開發(fā)了一種多孔聚苯乙烯（PS）基質(zhì)，該材料可有效錨定多種不同孔徑的溶膠-凝膠顆粒（圖4）。研究者將包裹雙酚A的溶膠-凝膠顆粒固定在PS基質(zhì)上，考察了基于溶膠-凝膠顆粒的微陣列芯片SELEX技術篩選雙酚A適配體的可行性，為小分子適配體的篩選開辟了一條通用途徑。

4.2.2?微陣列耦合微流控的SELEX技術篩選適配體?微流控芯片技術能較好地集成靶標分子與寡核苷酸文庫的結合、洗滌和洗脫等篩選步驟，而微陣列芯片的超高通量的特點也有助于實現(xiàn)多個靶標分子適配體的同時篩選。因此，微陣列耦合微流控的SELEX技術在適配體篩選中具有更大的優(yōu)勢，可發(fā)揮更大的作用。

Liu等[61]發(fā)展了一種微陣列耦合微流控芯片的SELEX技術（Protein microarray integrated with a microfluidic chip，PMM-SELEX），用于篩選蛋白質(zhì)的適配體（圖5）。利用物理俘獲法將靶標分子吸附在微陣列芯片的蛇形微通道上，在靶標分子與寡核苷酸文庫結合后，通過微陣列芯片掃描技術檢測靶標分子與寡核苷酸文庫的結合情況。研究結果表明，PMM-SELEX技術省時、高效，僅需5輪篩選即可得到對乳鐵蛋白具有較高親和力（Kd=0.63 nmol/L）的適配體。

Gortrik等[62]通過將寡核苷酸文庫固定在微陣列芯片上，篩選出多條適配體候選物，并通過微流控技術和高通量測序技術分別實現(xiàn)了適配體的分離與測序，克服了篩選過程輪次多、鑒定耗時等缺點。

適配體對（Aptamer pairs）可同時識別靶標分子不同表位，有助于增強檢測的靈敏度和特異性[63]。然而，適配體對很難通過篩選得到，因為在常規(guī)篩選過程中會優(yōu)先產(chǎn)生可識別顯性“熱點”表位的適配體，而熱點表位適配體的確定，對另一表位的結合存在一定的阻礙作用[64]。Cho等[65]建立的基于微陣列芯片的適配體對篩選平臺（Array-based discovery platform for multivalent aptamers process，AD-MAP）有效克服了這一問題，實現(xiàn)了適配體對的篩選（圖6）。首先，通過微流控芯片分離結合與未結合靶標分子的寡核苷酸;然后，通過高通量測序獲得適配體候選物的序列信息，并將這些適配體候選物點樣在陣列芯片上;最后，通過平行親和力檢測獲得與靶標分子親和性最高的適配體，并將二者形成復合物，該復合物可有效阻斷靶標分子上的主要結合位點。將復合物與微陣列芯片上的適配體候選物共同孵育，即可獲得與蛋白質(zhì)次要表位結合的適配體。他們通過AD-MAP平臺篩選出了一對能識別人血管生成素2（Ang 2）不同表位的適配體，該適配體對具有較強的穩(wěn)定性，即使在未稀釋的血清中也能準確識別Ang 2的表位。

適配體的發(fā)展與篩選技術的進步密切相關，目前報道的適配體篩選技術各有優(yōu)缺點，尚未形成一個標準化的模式。表1對磁珠SELEX、毛細管電泳SELEX、微流控芯片SELEX以及微陣列芯片SELEX的篩選輪次數(shù)、單輪篩選時間，以及各自優(yōu)缺點進行了對比。

4.2.3?基于微流控及微陣列芯片SELEX技術的適配體篩選進程監(jiān)測技術?適配體的篩選過程必須配合實時監(jiān)測技術[66]，從而有效地獲得具有更高親和力、更強穩(wěn)定性的適配體。

表面等離子體共振（Surface plasmon resonance，SPR）通過適配體候選物與靶標分子結合引起的金屬膜表面共振角的改變對SELEX篩選進程進行監(jiān)測。雖然，利用SPR容易對適配體候選物與靶標分子的結合情況進行評估，但早期研究發(fā)現(xiàn)，大多情況下，第1輪篩選并未檢測到SPR信號的變化[67]，顯然傳統(tǒng)的SPR并不適于高通量檢測。將金納米顆粒引入SPR的局域表面等離子體共振（Localized surface plasmon resonance，LSPR）可有效增強SPR信號的輸出。Gifford等[68]使用金納米顆粒增強的SPR成像技術（Surface plasmon resonance imaging，SPRI）實現(xiàn)了PCR產(chǎn)物的高靈敏檢測。與金納米顆粒相比，銀納米顆?？僧a(chǎn)生更強的共振信號，據(jù)此構建的“金核銀殼”結構可更好地監(jiān)測篩選過程[69]。Jia等[70]將微流控芯片和SPRI技術整合至SELEX過程中，利用十面體銀納米顆粒（Ag10）增強表面等離子體共振信號強度，完成了對乳鐵蛋白的適配體的篩選，將檢測信號提高了128倍。在后續(xù)的研究中，Jia等[71]利用十面體銀納米顆粒探針（Ag10-NPs-RP15）在實時監(jiān)測SELEX過程的同時，消除了因靶標分子末端固定導致的其與適配體候選物親和力降低的影響，篩選得到了脂質(zhì)運載蛋白-1（Lipocalin-1）的適配體。

小分子與適配體分子量差異較大，兩者親和力的表征也是難點之一，目前尚無通用的表征方法。Ahn等[60]將包埋有BPA的溶膠-凝膠顆粒固定在微陣列芯片上，利用熒光素標記BPA適配體候選物，與小分子結合的適配體候選物無法從溶膠-凝膠顆粒中逃逸，從而可觀察到顆粒的熒光。但是，這種熒光標記探針的方式對適配體的折疊有潛在影響，可能會進一步影響適配體與靶標分子的結合[72]。表征小分子與適配體親和力的另一種方法是反向散射干涉術（Back scattering interferometry，BSI），即利用激光照射樣品，光束在通道內(nèi)被反射和折射，形成特定的條紋圖案，并由電耦合器件（Charge coupled device，CCD）實現(xiàn)陣列檢測。監(jiān)測過程中，適配體和靶標分子均游離在溶液中，無需固定和標記。Kammer等[73]成功地將該技術用于抗生素（如替諾福韋、表阿霉素、氨芐青霉素和四環(huán)素）以及激素、神經(jīng)遞質(zhì)等小分子與適配體的親和力表征研究中。

5?總結與展望

近年來，適配體篩選技術有了長足的發(fā)展，但是，傳統(tǒng)基于磁珠和毛細管電泳技術的SELEX方法存在篩選輪次多、篩選周期長和樣品消耗量大、對小分子篩選效率低等問題。近幾年，研究者利用微流控芯片和微陣列芯片的高通量、低樣品消耗和易集成等特點，開發(fā)了基于微流控芯片和微陣列芯片的SELEX技術篩選適配體。然而，到目前為止，僅是將篩選環(huán)節(jié)中部分關鍵步驟（如分離和檢測等操作單元）轉(zhuǎn)移至芯片上，在芯片上并未實現(xiàn)所有適配體篩選環(huán)節(jié)。隨著微納米技術的發(fā)展，利用微流控芯片高集成和微陣列芯片超高通量的特點，未來SELEX技術的全部過程將有可能都在芯片上實現(xiàn)。因此，將微流控和微陣列芯片與高通量測序等技術結合，實現(xiàn)自動化篩選過程，將是適配體篩選工作的發(fā)展趨勢之一。

適配體篩選技術可從以下幾方面加強研究：（1）增加適配體篩選過程中的監(jiān)測手段，如結合微陣列芯片點陣掃描技術，及時發(fā)現(xiàn)問題，并對篩選過程進行優(yōu)化;（2）加強適配體與靶標分子結合的機理研究，結合靶標分子自身特點和結合位點的作用機制，合理設計適配體序列及結構，提高篩選成功率;（3）加快適配體數(shù)據(jù)庫的建設，除適配體序列、親和性和特異性等信息之外，也應該附有最新的篩選技術信息如微磁技術的改進等，為適配體的篩選提供理論指導;（4）努力建立通用型篩選模式，簡化篩選過程，如利用微流控芯片易集成的特點，將進樣、結合、洗脫、擴增和測序等技術集成于多塊甚至是一塊芯片上?？深A見，隨著新的分離技術、次級文庫制備技術和監(jiān)測技術的不斷發(fā)展，適配體的篩選過程會變得更加快速、便捷和高效，而適配體也會在生物醫(yī)學檢測、靶向識別和疾病治療等領域發(fā)揮更大的作用。

References

1?Li J，F(xiàn)u H E，Wu L J，Zheng A X，Yang H H. Anal. Chem.，2012，84（12）： 5309-5315

2?Jiang B，Li F，Yang C，Xie J，Xiang Y，Yuan R. Anal. Chem.，2015，87（5）： 3094-3098

3?Leung K H，He B Y，Yang C，Leung C H，Wang H M D，Ma D L. ACS Appl. Mater. Interfaces，2015，7（43）： 24046-24052

4?Ellington A D，Szostak J W. Nature，1990，346（6287）： 818-822

5?Tuerk C，Gold L. Science，1990，249（4968）： 505-510

6?Wang C，Liu B，Lu J，Zhang G，Lu A. J. Nanosci. Nanotechnol.，2014，14（1）： 501-512

7?Ilgu M，Nilsen-Hamilton M. Analyst，2016，141（5）： 1551-1568

8?Zhou J，Rossi J. Nat. Rev. Drug Discov.，2017，16（3）： 181-202

9?Chang A L，McKeague M，Liang J C，Smolke C D. Anal. Chem.，2014，86（7）： 3273-3278

10?Ozer A，Pagano J M，Lis J T. Mol. Ther-Nucl. Acids，2014，3（8）： 183-200

11?Zhu C，Wang X，Li L，Hao C，Hu Y，Rizvi A S，Qu F. Biochem. Biophys. Res. Commun.，2018，506（1）： 169-175

12?Sanchez J A，Pierce K E，Rice J E，Wangh L J. Proc. Natl. Acad. Sci. USA，2004，101（7）： 1933-1938

13?Avci-Adali M，Paul A，Wilhelm N，Ziemer G，Wendel H P. Molecules，2010，15（1）： 1-11

14?Costa G，Leamon J，Rothberg J，Weiner M. U.S. Patent Application. No.10/767，894. 2004

15?Xiao P，Lv X，Wang S，Iqbal J，Qing H，Li Q，Deng Y. Anal. Biochem.，2013，441（2）： 123-132

16?Zhang J，Lv X F，F(xiàn)eng W，Li X Q，Li K J，Deng Y L. Microchim. Acta，2018，185（8）： 364-371

17?Wang J，Rudzinski J F，Gong Q，Soh H T，Atzberger P J. PLoS One，2012，7（8）： e43940

18?Hünniger T，Wessels H，F(xiàn)ischer C，Paschke-Kratzin A，F(xiàn)ischer M. Anal. Chem.，2014，86（21）： 10940-10947

19?Han B，Zhao C，Yin J，Wang H. J. Chromatogr. B，2012，903： 112-117

20?Zhu C，Yang G，Ghulam M，Li L S，Qu F. Biotechnol. Adv.，2019，37（8）： 9734-9750

21?Li Q，Zhao X，Liu H，Qu F. J. Chromatogr. A，2014，1364： 289-294

22?Luo Z，Zhou H，Jiang H，Ou H，Li X，Zhang L. Analyst，2015，140（8）： 2664-2670

23?Manz A，F(xiàn)ettinger J C，Verpoorte E，Lüdi H，Widmer H，Harrison D J. TrAC-Trend. Anal. Chem.，1991，10（5）： 144-149

24?Li R，Zhang X，Lv X，Geng L，Li Y，Qin K，Deng Y. Anal. Biochem.，2017，539： 48-53

25?Qin K，Lv X，Xing Q，Li R，Deng Y. Anal. Methods，2016，8（12）： 2584-2591

26?Xu J，Lv X，Wei Y，Zhang L，Li R，Deng Y，Xu X. Sens. Actuators B，2015，212： 472-480

27?Zhang C，Lv X，Yasmeen S，Qing H，Deng Y. Anal. Methods，2017，9（24）： 3619-3625

28?Yu L，Li X，Hu X，Yu S，Lv X，Li Q，Deng Y. 2015 8th International Conference on Biomedical Engineering and Informatics （BMEI），2015： 328-332

29?Li J L，Chang K W，Wang C H，Yang C H，Shiesh S C，Lee G B. Biosens. Bioelectron.，2016，79： 887-893

30?Xu Y，Yang X，Wang E. Anal. Chim. Acta，2010，683（1）： 12-20

31?Lou X，Qian J，Xiao Y，Viel L，Gerdon A E，Lagally E T，Atzberger P，Tarasow T M，Heeger A J，Soh H T. Proc. Natl. Acad. Sci. USA，2009，106（9）： 2989-2994

32?SOh S，Ahmad K M，Cho M，Kim S，Xiao Y，Soh H T. Anal. Chem.，2011，83（17）： 6883-6889

33?Qian J，Lou X，Zhang Y，Xiao Y，Soh H T. Anal. Chem.，2009，81（13）： 5490-5495

34?Huang C J，Lin H I，Shiesh S C，Lee G B. Biosens. Bioelectron.，2010，25（7）： 1761-1766

35?Ahmad K M，Oh S S，Kim S，McClellen F M，Xiao Y，Soh H T. PloS One，2011，6（11）： e27051

36?Bock L C，Griffin L C，Latham J A，Vermaas E H，Toole J J. Nature，1992，355（6360）： 564-566

37?Green L S，Jellinek D，Jenison R，stman A，Heldin C H，Janjic N. Biochemistry-US，1996，35（45）： 14413-14424

38?Stoltenburg R，Reinemann C，Strehlitz B. Biomol. Eng.，2007，24（4）： 381-403

39?Gill I. Chem. Mater.，2001，13（10）： 3404-3421

40?Livage J，Coradin T，Roux C. J. Phys.Condens.Mat.，2001，13（33）： R673-R691

41?Pastor I，F(xiàn)errer M L，Lillo M P，Gómez J，Mateo C R. J. Phys. Chem. B，2007，111（39）： 11603-11610

42?Kim Y Y，Chae S Y，Kim S，Byun Y，Bae Y H. J. Biomater. Sci. Polym. Edit.，2005，16（12）： 1521-1535

43?Besanger T R，Easwaramoorthy B，Brennan J D. Anal. Chem.，2004，76（21）： 6470-6475

44?Cho E J，Bright F V. Anal. Chem.，2002，74（6）： 1462-1466

45?Rupcich N，Goldstein A，Brennan J D. Chem. Mater.，2003，15（9）： 1803-1811

46?Ahn J Y，Jo M，Dua P，Lee D K，Kim S. Oligonucleotides，2011，21（2）： 93-100

47?Bae H，Ren S，Kang J，Kim M，Jiang Y，Jin M M，Min I M，Kim S. Nucleic Acid Ther.，2013，23（6）： 443-449

48?Huang C J，Lin H I，Shiesh S C，Lee G B. Biosens. Bioelectron.，2012，35（1）： 50-55

49?Hughes T R，Mao M，Jones A R，Burchard J，Marton M J，Shannon K W，Lefkowitz S M，Ziman M，Schelter J M，Meyer M R. Nat. Biotechnol.，2001，19（4）： 342-347

50?Okamoto T，Suzuki T，Yamamoto N. Nat. Biotechnol.，2000，18（4）： 438-441

51?Jain K. Science，2001，294（5542）： 621-623

52?Albala J S. Expert Rev.Mol.Diagn.，2001，1（2）： 145-152

53?Butun S，Sahiner N. Polymer，2011，52（21）： 4834-4840

54?Zhu Q，Trau D. Anal. Chim. Acta，2012，751： 146-154

55?Verpoorte E. Lab Chip，2003，3（4）： 60N-68N

56?Kawaguchi H. Prog. Polym. Sci.，2000，25（8）： 1171-1210

57?Kim J J，Bong K W，Retegui E，Irimia D，Doyle P S. Nat.Mater.，2017，16（1）： 139

58?Park S M，Ahn J Y，Jo M，Lee D K，Lis J T，Craighead H G，Kim S. Lab Chip，2009，9（9）： 1206-1212

59?Ressine A，Ekstrom S，Marko-Varga G，Laurell T. Anal. Chem.，2003，75（24）： 6968-6974

60?Ahn J Y，Lee S，Jo M，Kang J，Kim E，Jeong O C，Laurell T，Kim S. Anal. Chem.，2012，84（6）： 2647-2653

61?Liu X，Li H，Jia W，Chen Z，Xu D. Lab Chip，2017，17（1）： 178-185

62?Gotrik M R，F(xiàn)eagin T A，Csordas A T，Nakamoto M A，Soh H T. Acc. Chem. Res.，2016，49（9）： 1903-1910

63?Lao Y H，Peck K，Chen L C. Anal. Chem.，2009，81（5）： 1747-1754

64?Fitter S，James R. J. Biol. Chem.，2005，280（40）： 34193-34201

65?Cho M，Oh S S，Nie J，Stewart R，Radeke M J，Eisenstein M，Coffey P J，Thomson J A，Soh H T. Anal. Chem.，2014，87（1）： 821-828

66?Tran D T，Knez K，Janssen K P，Pollet J，Spasic D，Lammertyn J. Biosens. Bioelectron.，2013，43： 245-251

67?Dausse E，Barré A，Aimé A，Groppi A，Rico A，Ainali C，Salgado G，Palau W，Daguerre E，Nikolski M. Biosens. Bioelectron.，2016，80： 418-425

68?Gifford L K，Sendroiu I E，Corn R M，Luptk A. J. Am. Chem. Soc.，2010，132（27）： 9265-9267

69?Hobbs K，Cathcart N，Kitaev V. Chem. Commun.，2016，52（63）： 9785-9788

70?Jia W，Li H，Wilkop T，Liu X，Yu X，Cheng Q，Xu D，Chen H Y. Biosens. Bioelectron.，2018，109： 206-213

71?Jia W，Lu Z，Yang H，Li H，Xu D. Anal. Chim. Acta，2018，1043： 158-166

72?Ruscito A，de Rosa M C. Front.Chem.，2016，4： 14

73?Kammer M N，Olmsted I R，Kussrow A K，Morris M J，Jackson G W，Bornhop D J. Analyst，2014，139（22）： 5879-5884