CRISPR/Cas9技術(shù)編輯OsRhoGDI2基因?qū)е滤景氚?/h1>
2020-05-07 12:29:50王凱婕安文靜劉亞菲劉迪馮連杰王俊杰黃俊駿劉肖飛梁衛(wèi)紅
生物工程學(xué)報 2020年4期
王凱婕，安文靜，劉亞菲，劉迪，馮連杰，王俊杰，黃俊駿，劉肖飛，梁衛(wèi)紅
·農(nóng)業(yè)生物技術(shù)·
CRISPR/Cas9技術(shù)編輯基因?qū)е滤景氚?/p>
王凱婕，安文靜，劉亞菲，劉迪，馮連杰，王俊杰，黃俊駿，劉肖飛，梁衛(wèi)紅
河南師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453007
是通過酵母雙雜交從水稻幼穗中分離的一個與Rho蛋白家族成員OsRacD相互作用蛋白的編碼基因，但功能尚不明確。本研究利用CRISPR/Cas9技術(shù)創(chuàng)制水稻基因敲除突變體。檢測結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因水稻T0代獲得2種純合突變體，T1代獲得8種純合突變體。序列分析顯示，在敲除水稻中，該基因的編輯靶點附近發(fā)生了堿基的替換或缺失，預(yù)期生成喪失RhoGDI保守結(jié)構(gòu)域的截短蛋白。表型比對分析發(fā)現(xiàn)，敲除水稻與對照相比，株高顯著降低，統(tǒng)計學(xué)分析結(jié)果顯示，敲除水稻株高降低源于第Ⅱ和第Ⅲ莖節(jié)的縮短，提示基因可能與水稻株高控制相關(guān)。
CRISPR/Cas9技術(shù)，水稻，，株高
CRISPR/Cas9技術(shù)是近些年發(fā)展起來的一種簡捷高效的基因編輯技術(shù)[1]。該技術(shù)通過sgRNA與基因組靶序列結(jié)合，引導(dǎo)Cas9內(nèi)切酶對靶序列進行切割產(chǎn)生DSB，在DSB修復(fù)過程中可能產(chǎn)生堿基的插入、缺失等[2]，從而實現(xiàn)基因的編輯。近年來，CRISPR/Cas9技術(shù)因其操作簡單、成本低、效率高，迅速發(fā)展并廣泛應(yīng)用于動物、植物、微生物等研究中[3-6]。例如高彩霞課題組率先利用該技術(shù)實現(xiàn)了水稻基因組編輯[7]；邵高能等利用CRISPR/Cas9技術(shù)成功編輯了水稻香味基因，加速香稻品種的選育進程[8]；朱健康課題組相關(guān)研究表明，CRISPR/Cas9系統(tǒng)可高效編輯水稻特異基因，并且基因突變能夠穩(wěn)定遺傳[9]。
植物Rho/Rop蛋白，屬于小G蛋白家族，在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中起“分子開關(guān)”的作用。已明確，植物RhoGDIs是一類與Rho/Rop相互作用的互作蛋白。RhoGDIs已知的功能涉及調(diào)節(jié)根毛[10]、花粉管生長、維持花粉管細胞穩(wěn)態(tài)[11]、幼苗發(fā)育以及葉片細胞形態(tài)發(fā)生[12]等過程。是水稻Rho蛋白OsRacD互作蛋白的編碼基因[13]。啟動子功能鑒定以及表達模式分析發(fā)現(xiàn)，基因在葉鞘與節(jié)中高效表達[14]；OsRhoGDI2蛋白亞細胞定位分析表明，該蛋白主要分布在細胞膜、細胞質(zhì)與細胞核[15]。目前，基因的功能尚不明確。為此，本研究利用CRISPR/Cas9技術(shù)對水稻進行編輯，旨在篩選純合敲除植株，通過表型分析，確定該基因可能涉及的生物學(xué)過程，為后續(xù)以敲除水稻為材料開展的功能研究奠定基礎(chǔ)。
1 材料與方法
1.1 植物材料
本研究所用實驗材料為粳稻栽培品種日本晴(L.cv. Nipponbare)。
1.2 菌株與載體
大腸桿菌DH5α與根癌農(nóng)桿菌EHA105由本實驗室保存，載體pw-A-cas9與pw-B由武漢伯遠公司提供。
1.3 主要試劑及試劑盒
限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶、質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒均購自大連TaKaRa公司?？敲顾亍⒊泵顾?、酵母浸膏等試劑均購自北京鼎國生物技術(shù)有限公司。
1.4 引物
本文所用引物均采用Primer Premier 5軟件設(shè)計，委托英濰捷基(上海) 貿(mào)易有限公司合成 (表1)。
1.5 OsRhoGDI2編輯靶位點的選擇
將(AY364312) 提交至NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/) 進行檢索，找到全基因序列，獲得外顯子信息。根據(jù)gRNA設(shè)計原則，在1號外顯子上設(shè)計2個gRNA靶位點，并將其與水稻基因組blast比對分析驗證，確認靶序列的特異性。
1.6 中間載體的構(gòu)建
通過P1/P2引物退火，制備gRNA1片段，反應(yīng)體系如下：P1/P2各5 μL，H2O 40 μL；反應(yīng)條件如下：95 ℃變性10 min、55 ℃退火10 min。gRNA2片段通過P3/P4引物退火制備，體系同上。
將制備的2個gRNA片段分別與載體pw-A-cas9和pw-B連接，酶切連接體系如下：gRNA片段2 μL，載體1.5 μL，Ⅰ 0.5 μL，T4 DNA連接酶0.5 μL，T4緩沖液1 μL，H2O 4.5 μL，混勻后于37 ℃反應(yīng)2 h。
表1 本研究所用的引物
Note:Ⅰ restriction site is underlined.
以熱激法分別將上述2個連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細胞，經(jīng)陽性轉(zhuǎn)化子的篩選、檢測，將測序驗證后的重組中間載體分別命名為GDI2-A與GDI2-B。
1.7 植物表達載體pW-T-OsRhoGDI2的構(gòu)建
取適量的GDI2-A與GDI2-B質(zhì)粒，按照以下體系進行酶切連接反應(yīng)。體系如下：GID2-A 1 μL，GID2-B 1.5 μL，Ⅰ 0.5 μL，T4 DNA連接酶 0.5 μL，T4緩沖液1 μL，加ddH2O至10 μL，混勻后于37 ℃反應(yīng)2 h。以熱激法進行連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化，進行陽性轉(zhuǎn)化子的篩選、檢測并測序，確認后的載體命名為pW-T-。
1.8 水稻的遺傳轉(zhuǎn)化及篩選
以農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將pW-T-載體轉(zhuǎn)化日本晴水稻愈傷組織，常規(guī)方法篩選。待再生水稻(T0代) 長至四葉期時，提取葉片基因組DNA，以P5/P6引物組合進行基因組DNA的PCR檢測，擴增體系為10 μL：2×EsMaster Mix 5 μL，P5/P6各0.4 μL，DNA 0.4 μL，ddH2O 3.8 μL；擴增條件為：94 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃ 30 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 20 s，進行34個循環(huán)；72 ℃終延伸 2 min，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增結(jié)果。采用相同體系，以P7/P8引物組合擴增包含編輯靶點序列，并對PCR產(chǎn)物膠回收測序，測序結(jié)果采用Primer Premier、DNAMAN與Chromas軟件分析。
轉(zhuǎn)基因水稻T1代篩選方法同上。
1.9 OsRhoGDI2編輯水稻的表型分析
選擇3株T1代純合的編輯水稻植株，觀察其與野生型水稻日本晴的差異。待生長至成熟期時，測量其株高、穗與莖節(jié)的長度，獲得的數(shù)據(jù)用Microsoft Excel 2018進行統(tǒng)計學(xué)分析，并用DPS軟件進行數(shù)據(jù)差異性分析，用Origin85軟件作圖。
2 結(jié)果與分析
2.1 OsRhoGDI2編輯靶位點的選擇及載體構(gòu)建
序列檢索顯示，該基因由5個外顯子和4個內(nèi)含子構(gòu)成。根據(jù)編輯靶點設(shè)計原則，在1號外顯子選擇兩個靶位點(圖1)。其中，靶位點1 (Target 1) 位于1號外顯子第230?252 bp處；靶位點2 (Target 2) 位于1號外顯子第153?175 bp處的互補鏈上，且兩個靶位點相隔54 bp。
通過引物退火制備gRNA1與gRNA2，它們分別與載體pw-A-cas9和pw-B連接，制備中間載體GDI2-A與GDI2-B。通過2個中間載體酶切連接，最終構(gòu)建植物表達載體pW-T-(圖2)，該載體中的基因和基因均由CaMV35S啟動子驅(qū)動，gRNA1與gRNA2均由啟動子驅(qū)動，以NOS終止子終止。
2.2 OsRhoGDI2敲除水稻的篩選與鑒定
經(jīng)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻愈傷轉(zhuǎn)化及篩選，在T0代共獲得11株獨立的再生植株。潮霉素基因引物擴增結(jié)果顯示，11株均為轉(zhuǎn)基因水稻。編輯靶點序列的擴增結(jié)果顯示，均擴增出與預(yù)期598 bp大小相符的目的片段(圖3)。
圖1 OsRhoGDI2基因結(jié)構(gòu)及編輯靶點的位置
圖2 pW-T-OsRhoGDI2表達載體的構(gòu)建
圖3 編輯靶點序列擴增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳
將上述PCR產(chǎn)物測序，并進行序列分析。結(jié)果顯示(表2)，T0代獲得雜合株系6個(占54.5%)、雙等位突變株系2個(占18.2%)、純合株系2個(占18.2%)、未被編輯株系1個(占9.1%)。T0代11個株系與野生型進行編輯靶點序列比對，發(fā)現(xiàn)6個雜合株系中有2個(#1、#5) 在靶位點2處發(fā)生突變，4個(#2、#3、#8、#11) 在靶位點1處發(fā)生突變；2個雙等位突變株系(#7、#9) 均在靶位點1處發(fā)生突變；2個純合株系(#6、#10) 均在靶位點1處發(fā)生突變(圖4)。
對153株(來自T0代的雜合與雙等位突變種子#1、#2、#3、#5、#7、#8、#9、#11) T1代水稻篩選，結(jié)果顯示(表2) 有65個雜合株系(占42.5%)、 6個雙等位突變株系(占3.9%)、45個純合株系(占29.4%)、37個未被編輯株系(占24.2%)。T1代純合株系與野生型進行編輯靶點序列比對，發(fā)現(xiàn)靶位點2處發(fā)生突變的有1種(#5-1)；靶位點1處發(fā)生突變的有6種(#5-2與#9-1、#7-1、#7-2、#8-1、#8-2、#11-1)；靶位點1與靶位點2均發(fā)生突變的有1種(#1-1) (圖4)。
表2 T0與T1代轉(zhuǎn)基因水稻突變類型比較
圖4 T0代與T1代轉(zhuǎn)基因植株編輯靶點序列比對
對24株(來自T0代的純合突變種子#10) T1代水稻篩選，結(jié)果顯示，24株(#10-1) 均為靶位點1處缺失4個堿基“AGAT”，突變位點與T0代#10一致。序列分析證明，T1代產(chǎn)生移碼突變的株系共有6種(#1-1、#5-1、#5-2與#9-1與#10-1、#8-1、#8-2、#11-1)，另外，在對編輯靶點擴增和測序的分析中發(fā)現(xiàn)，后代沒有出現(xiàn)大片段刪除事件。
選取3個產(chǎn)生移碼突變的T1代純合株系與野生型進行預(yù)期OsRhoGDI2蛋白的氨基酸序列比對(圖5)。由于3個純合敲除株系靶位點發(fā)生堿基缺失，導(dǎo)致該基因產(chǎn)生移碼突變與無義突變，翻譯提前終止，生成的截短蛋白中保守的RhoGDI結(jié)構(gòu)域丟失，因此轉(zhuǎn)基因水稻中將無法產(chǎn)生正常的OsRhoGDI2蛋白。
為評估2個靶位點的脫靶效應(yīng)，本研究選取T1代的3株純合突變體(#1-1、#5-1、#5-2)進行評估。對5個潛在的脫靶位點進行PCR擴增，測序比對發(fā)現(xiàn)，所有被檢測植株的潛在脫靶位點均未出現(xiàn)突變(表3)。
圖5 野生型與T1代純合敲除株系內(nèi)源OsRhoGDI2氨基酸序列的對比
2.3 OsRhoGDI2敲除水稻表型分析
對大田種植的敲除水稻和野生型水稻進行觀察。在成熟期，3個敲除水稻株系株高相比野生型明顯降低，統(tǒng)計學(xué)分析顯示，3個敲除株系株高平均下降9.3%，且差異達到極顯著水平(圖6A, C)。對成熟期水稻莖節(jié)與穗長度進行測量，結(jié)果顯示，3個敲除株系第Ⅱ莖節(jié)與第Ⅲ莖節(jié)長度相比野生型平均降低19.0%與27.0%，在統(tǒng)計學(xué)上，差異均達到極顯著水平(圖6B, 6D)。但是3個敲除株系的穗長與野生型相比無統(tǒng)計學(xué)上的差異。
表3 潛在脫靶位點的分析
Note: mismatching bases are in red fonts; PAM sequences are underlined.
圖6 野生型與T1代轉(zhuǎn)基因株系表型比較
3 討論
有報道顯示，利用CRISPR/Cas9技術(shù)編輯水稻，當堿基插入或缺失引起移碼突變或蛋白結(jié)構(gòu)改變時，靶基因的功能就會被破壞[16-17]。本研究利用雙靶點CRISPR/Cas9表達載體對水稻基因進行定點編輯，實現(xiàn)了基因的敲除。
有研究顯示，利用CRISPR/Cas9技術(shù)編輯水稻產(chǎn)生的突變可以穩(wěn)定遺傳到后代植株[18-19]。本研究在T0代獲得2種純合敲除水稻，分別為缺失3個堿基株系(#6) 與4個堿基株系(#10)。由于缺失3或3倍數(shù)的堿基突變不會造成移碼突變，株系#6是無效的，因此需要在T1代繼續(xù)進行純合株系的篩選，獲得足夠的突變材料。對T1代水稻(24株來自T0代純合種子#10，153株來自T0代雜合突變與雙等位突變種子#1、#2、#3、#5、#7、#8、#9、#11) 繼續(xù)篩選，共獲得8種純合敲除水稻。對T1代純合敲除水稻編輯靶點的分析發(fā)現(xiàn)，在T0代純合的#10株系其后代均保持與T0代相同的突變類型，說明T0代獲得的純合株系在T1代可以穩(wěn)定遺傳，也說明采用CRISPR/Cas9技術(shù)在T0代便有可能篩選到純合敲除水稻，這與王美娜等[20]的研究結(jié)果一致，證明CRISPR/Cas9技術(shù)具有高效性與穩(wěn)定性。
利用T1代純合敲除株系進行初步的表型分析，發(fā)現(xiàn)最顯著的差異體現(xiàn)在株高這一性狀上。株高是直接影響水稻品種抗倒性能與產(chǎn)量的重要農(nóng)藝學(xué)性狀[21]，研究株高對于更好地了解植物的生長發(fā)育規(guī)律以及植物分子育種具有重要意義[22]。但是，株高的調(diào)控是一個復(fù)雜的過程。Liang等將達到正常植株高度50%與50%?100%的植株分別定義為矮化和半矮化植株[23]，本研究所分析的3種基因T1代純合敲除水稻株系相比野生型，株高均處于野生型株高50%?100%之間，屬于半矮化類型。半矮化植株在第一次“綠色革命”時被用來培育抗倒伏作物新品種，從而大幅度提高了糧食產(chǎn)量[24]。已知水稻節(jié)間數(shù)目與節(jié)間長度影響株高[25]。Takahashi與Takeda等根據(jù)水稻各莖節(jié)的長短，將水稻矮化突變體分為、、、與5種類型，本文獲得的突變體均出現(xiàn)第Ⅱ和第Ⅲ莖節(jié)顯著縮短的現(xiàn)象，屬于類。目前，植物RhoGDI與株高相關(guān)研究尚未見報道，而敲除水稻的株高相比野生型均有極顯著降低，提示基因與株高控制關(guān)系密切，值得深入研究其作用機制。
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Disruption ofby CRISPR/Cas9 technology leads to semi-dwarf in rice
Kaijie Wang, Wenjing An, Yafei Liu, Di Liu, Lianjie Feng, Junjie Wang, Junjun Huang, Xiaofei Liu, and Weihong Liang
College of Life Sciences,Henan Normal University, Xinxiang 453007, Henan, China
was isolated as a putative partner of Rho protein family member OsRacD from rice panicles by yeast two-hybrid, but its function remains unknown. In order to identify the function of,knockout mutants were created by CRISPR/Cas9 technology. The results showed that two different homozygous mutants were obtained in T0generation, and eight kinds homozygous mutants were identified in T1generation. Sequence analysis revealed that the base substitution or base deletion occurred near the editing targets of the gene in knockout rice, and it could be expected that the truncated OsRhoGDI2 proteins lacking the RhoGDI conserved domain would be generated. Phenotype analysis showed that theknockout rice plants were significantly lower than the control plants. Statistical analysis confirmed that the significant decrease of plant height was due to the shortening of the second and third internodes, suggesting thatgene may be related with rice height control.
CRISPR/Cas9 technology, rice,, plant height
July 24, 2019;
September 11, 2019
Supported by: National Natural Science Foundation of China (Nos. U1704101, 31701070, 31701508), Program for Innovative Research Team (in Science and Technology) in University of Henan Province (No. 15IRTSTHN020).
Weihong Liang. Tel: +86-373-3326340; E-mail: liangwh@htu.cn
國家自然科學(xué)基金 (Nos. U1704101, 31701070, 31701508)，河南省高校科技創(chuàng)新團隊支持計劃 (No. 15IRTSTHN020) 資助。
2019-10-10
http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1998.q.20191010.1048.006.html
10.13345/j.cjb.190333
王凱婕, 安文靜, 劉亞菲, 等.CRISPR/Cas9技術(shù)編輯基因?qū)е滤景氚? 生物工程學(xué)報, 2020, 36(4): 707–715.
Wang KJ, An WJ, Liu YF, et al. Disruption ofby CRISPR/Cas9 technology leads to semi-dwarf in rice. Chin J Biotech, 2020, 36(4): 707–715.
(本文責編 陳宏宇)
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王凱婕，安文靜，劉亞菲，劉迪，馮連杰，王俊杰，黃俊駿，劉肖飛，梁衛(wèi)紅
·農(nóng)業(yè)生物技術(shù)·
CRISPR/Cas9技術(shù)編輯基因?qū)е滤景氚?/p>
王凱婕，安文靜，劉亞菲，劉迪，馮連杰，王俊杰，黃俊駿，劉肖飛，梁衛(wèi)紅
河南師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453007
是通過酵母雙雜交從水稻幼穗中分離的一個與Rho蛋白家族成員OsRacD相互作用蛋白的編碼基因，但功能尚不明確。本研究利用CRISPR/Cas9技術(shù)創(chuàng)制水稻基因敲除突變體。檢測結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因水稻T0代獲得2種純合突變體，T1代獲得8種純合突變體。序列分析顯示，在敲除水稻中，該基因的編輯靶點附近發(fā)生了堿基的替換或缺失，預(yù)期生成喪失RhoGDI保守結(jié)構(gòu)域的截短蛋白。表型比對分析發(fā)現(xiàn)，敲除水稻與對照相比，株高顯著降低，統(tǒng)計學(xué)分析結(jié)果顯示，敲除水稻株高降低源于第Ⅱ和第Ⅲ莖節(jié)的縮短，提示基因可能與水稻株高控制相關(guān)。
CRISPR/Cas9技術(shù)，水稻，，株高
CRISPR/Cas9技術(shù)是近些年發(fā)展起來的一種簡捷高效的基因編輯技術(shù)[1]。該技術(shù)通過sgRNA與基因組靶序列結(jié)合，引導(dǎo)Cas9內(nèi)切酶對靶序列進行切割產(chǎn)生DSB，在DSB修復(fù)過程中可能產(chǎn)生堿基的插入、缺失等[2]，從而實現(xiàn)基因的編輯。近年來，CRISPR/Cas9技術(shù)因其操作簡單、成本低、效率高，迅速發(fā)展并廣泛應(yīng)用于動物、植物、微生物等研究中[3-6]。例如高彩霞課題組率先利用該技術(shù)實現(xiàn)了水稻基因組編輯[7]；邵高能等利用CRISPR/Cas9技術(shù)成功編輯了水稻香味基因，加速香稻品種的選育進程[8]；朱健康課題組相關(guān)研究表明，CRISPR/Cas9系統(tǒng)可高效編輯水稻特異基因，并且基因突變能夠穩(wěn)定遺傳[9]。
植物Rho/Rop蛋白，屬于小G蛋白家族，在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中起“分子開關(guān)”的作用。已明確，植物RhoGDIs是一類與Rho/Rop相互作用的互作蛋白。RhoGDIs已知的功能涉及調(diào)節(jié)根毛[10]、花粉管生長、維持花粉管細胞穩(wěn)態(tài)[11]、幼苗發(fā)育以及葉片細胞形態(tài)發(fā)生[12]等過程。是水稻Rho蛋白OsRacD互作蛋白的編碼基因[13]。啟動子功能鑒定以及表達模式分析發(fā)現(xiàn)，基因在葉鞘與節(jié)中高效表達[14]；OsRhoGDI2蛋白亞細胞定位分析表明，該蛋白主要分布在細胞膜、細胞質(zhì)與細胞核[15]。目前，基因的功能尚不明確。為此，本研究利用CRISPR/Cas9技術(shù)對水稻進行編輯，旨在篩選純合敲除植株，通過表型分析，確定該基因可能涉及的生物學(xué)過程，為后續(xù)以敲除水稻為材料開展的功能研究奠定基礎(chǔ)。
1 材料與方法
1.1 植物材料
本研究所用實驗材料為粳稻栽培品種日本晴(L.cv. Nipponbare)。
1.2 菌株與載體
大腸桿菌DH5α與根癌農(nóng)桿菌EHA105由本實驗室保存，載體pw-A-cas9與pw-B由武漢伯遠公司提供。
1.3 主要試劑及試劑盒
限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶、質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒均購自大連TaKaRa公司?？敲顾亍⒊泵顾?、酵母浸膏等試劑均購自北京鼎國生物技術(shù)有限公司。
1.4 引物
本文所用引物均采用Primer Premier 5軟件設(shè)計，委托英濰捷基(上海) 貿(mào)易有限公司合成 (表1)。
1.5 OsRhoGDI2編輯靶位點的選擇
將(AY364312) 提交至NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/) 進行檢索，找到全基因序列，獲得外顯子信息。根據(jù)gRNA設(shè)計原則，在1號外顯子上設(shè)計2個gRNA靶位點，并將其與水稻基因組blast比對分析驗證，確認靶序列的特異性。
1.6 中間載體的構(gòu)建
通過P1/P2引物退火，制備gRNA1片段，反應(yīng)體系如下：P1/P2各5 μL，H2O 40 μL；反應(yīng)條件如下：95 ℃變性10 min、55 ℃退火10 min。gRNA2片段通過P3/P4引物退火制備，體系同上。
將制備的2個gRNA片段分別與載體pw-A-cas9和pw-B連接，酶切連接體系如下：gRNA片段2 μL，載體1.5 μL，Ⅰ 0.5 μL，T4 DNA連接酶0.5 μL，T4緩沖液1 μL，H2O 4.5 μL，混勻后于37 ℃反應(yīng)2 h。
表1 本研究所用的引物
Note:Ⅰ restriction site is underlined.
以熱激法分別將上述2個連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細胞，經(jīng)陽性轉(zhuǎn)化子的篩選、檢測，將測序驗證后的重組中間載體分別命名為GDI2-A與GDI2-B。
1.7 植物表達載體pW-T-OsRhoGDI2的構(gòu)建
取適量的GDI2-A與GDI2-B質(zhì)粒，按照以下體系進行酶切連接反應(yīng)。體系如下：GID2-A 1 μL，GID2-B 1.5 μL，Ⅰ 0.5 μL，T4 DNA連接酶 0.5 μL，T4緩沖液1 μL，加ddH2O至10 μL，混勻后于37 ℃反應(yīng)2 h。以熱激法進行連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化，進行陽性轉(zhuǎn)化子的篩選、檢測并測序，確認后的載體命名為pW-T-。
1.8 水稻的遺傳轉(zhuǎn)化及篩選
以農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將pW-T-載體轉(zhuǎn)化日本晴水稻愈傷組織，常規(guī)方法篩選。待再生水稻(T0代) 長至四葉期時，提取葉片基因組DNA，以P5/P6引物組合進行基因組DNA的PCR檢測，擴增體系為10 μL：2×EsMaster Mix 5 μL，P5/P6各0.4 μL，DNA 0.4 μL，ddH2O 3.8 μL；擴增條件為：94 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃ 30 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 20 s，進行34個循環(huán)；72 ℃終延伸 2 min，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增結(jié)果。采用相同體系，以P7/P8引物組合擴增包含編輯靶點序列，并對PCR產(chǎn)物膠回收測序，測序結(jié)果采用Primer Premier、DNAMAN與Chromas軟件分析。
轉(zhuǎn)基因水稻T1代篩選方法同上。
1.9 OsRhoGDI2編輯水稻的表型分析
選擇3株T1代純合的編輯水稻植株，觀察其與野生型水稻日本晴的差異。待生長至成熟期時，測量其株高、穗與莖節(jié)的長度，獲得的數(shù)據(jù)用Microsoft Excel 2018進行統(tǒng)計學(xué)分析，并用DPS軟件進行數(shù)據(jù)差異性分析，用Origin85軟件作圖。
2 結(jié)果與分析
2.1 OsRhoGDI2編輯靶位點的選擇及載體構(gòu)建
序列檢索顯示，該基因由5個外顯子和4個內(nèi)含子構(gòu)成。根據(jù)編輯靶點設(shè)計原則，在1號外顯子選擇兩個靶位點(圖1)。其中，靶位點1 (Target 1) 位于1號外顯子第230?252 bp處；靶位點2 (Target 2) 位于1號外顯子第153?175 bp處的互補鏈上，且兩個靶位點相隔54 bp。
通過引物退火制備gRNA1與gRNA2，它們分別與載體pw-A-cas9和pw-B連接，制備中間載體GDI2-A與GDI2-B。通過2個中間載體酶切連接，最終構(gòu)建植物表達載體pW-T-(圖2)，該載體中的基因和基因均由CaMV35S啟動子驅(qū)動，gRNA1與gRNA2均由啟動子驅(qū)動，以NOS終止子終止。
2.2 OsRhoGDI2敲除水稻的篩選與鑒定
經(jīng)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻愈傷轉(zhuǎn)化及篩選，在T0代共獲得11株獨立的再生植株。潮霉素基因引物擴增結(jié)果顯示，11株均為轉(zhuǎn)基因水稻。編輯靶點序列的擴增結(jié)果顯示，均擴增出與預(yù)期598 bp大小相符的目的片段(圖3)。
圖1 OsRhoGDI2基因結(jié)構(gòu)及編輯靶點的位置
圖2 pW-T-OsRhoGDI2表達載體的構(gòu)建
圖3 編輯靶點序列擴增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳
將上述PCR產(chǎn)物測序，并進行序列分析。結(jié)果顯示(表2)，T0代獲得雜合株系6個(占54.5%)、雙等位突變株系2個(占18.2%)、純合株系2個(占18.2%)、未被編輯株系1個(占9.1%)。T0代11個株系與野生型進行編輯靶點序列比對，發(fā)現(xiàn)6個雜合株系中有2個(#1、#5) 在靶位點2處發(fā)生突變，4個(#2、#3、#8、#11) 在靶位點1處發(fā)生突變；2個雙等位突變株系(#7、#9) 均在靶位點1處發(fā)生突變；2個純合株系(#6、#10) 均在靶位點1處發(fā)生突變(圖4)。
對153株(來自T0代的雜合與雙等位突變種子#1、#2、#3、#5、#7、#8、#9、#11) T1代水稻篩選，結(jié)果顯示(表2) 有65個雜合株系(占42.5%)、 6個雙等位突變株系(占3.9%)、45個純合株系(占29.4%)、37個未被編輯株系(占24.2%)。T1代純合株系與野生型進行編輯靶點序列比對，發(fā)現(xiàn)靶位點2處發(fā)生突變的有1種(#5-1)；靶位點1處發(fā)生突變的有6種(#5-2與#9-1、#7-1、#7-2、#8-1、#8-2、#11-1)；靶位點1與靶位點2均發(fā)生突變的有1種(#1-1) (圖4)。
表2 T0與T1代轉(zhuǎn)基因水稻突變類型比較
圖4 T0代與T1代轉(zhuǎn)基因植株編輯靶點序列比對
對24株(來自T0代的純合突變種子#10) T1代水稻篩選，結(jié)果顯示，24株(#10-1) 均為靶位點1處缺失4個堿基“AGAT”，突變位點與T0代#10一致。序列分析證明，T1代產(chǎn)生移碼突變的株系共有6種(#1-1、#5-1、#5-2與#9-1與#10-1、#8-1、#8-2、#11-1)，另外，在對編輯靶點擴增和測序的分析中發(fā)現(xiàn)，后代沒有出現(xiàn)大片段刪除事件。
選取3個產(chǎn)生移碼突變的T1代純合株系與野生型進行預(yù)期OsRhoGDI2蛋白的氨基酸序列比對(圖5)。由于3個純合敲除株系靶位點發(fā)生堿基缺失，導(dǎo)致該基因產(chǎn)生移碼突變與無義突變，翻譯提前終止，生成的截短蛋白中保守的RhoGDI結(jié)構(gòu)域丟失，因此轉(zhuǎn)基因水稻中將無法產(chǎn)生正常的OsRhoGDI2蛋白。
為評估2個靶位點的脫靶效應(yīng)，本研究選取T1代的3株純合突變體(#1-1、#5-1、#5-2)進行評估。對5個潛在的脫靶位點進行PCR擴增，測序比對發(fā)現(xiàn)，所有被檢測植株的潛在脫靶位點均未出現(xiàn)突變(表3)。
圖5 野生型與T1代純合敲除株系內(nèi)源OsRhoGDI2氨基酸序列的對比
2.3 OsRhoGDI2敲除水稻表型分析
對大田種植的敲除水稻和野生型水稻進行觀察。在成熟期，3個敲除水稻株系株高相比野生型明顯降低，統(tǒng)計學(xué)分析顯示，3個敲除株系株高平均下降9.3%，且差異達到極顯著水平(圖6A, C)。對成熟期水稻莖節(jié)與穗長度進行測量，結(jié)果顯示，3個敲除株系第Ⅱ莖節(jié)與第Ⅲ莖節(jié)長度相比野生型平均降低19.0%與27.0%，在統(tǒng)計學(xué)上，差異均達到極顯著水平(圖6B, 6D)。但是3個敲除株系的穗長與野生型相比無統(tǒng)計學(xué)上的差異。
表3 潛在脫靶位點的分析
Note: mismatching bases are in red fonts; PAM sequences are underlined.
圖6 野生型與T1代轉(zhuǎn)基因株系表型比較
3 討論
有報道顯示，利用CRISPR/Cas9技術(shù)編輯水稻，當堿基插入或缺失引起移碼突變或蛋白結(jié)構(gòu)改變時，靶基因的功能就會被破壞[16-17]。本研究利用雙靶點CRISPR/Cas9表達載體對水稻基因進行定點編輯，實現(xiàn)了基因的敲除。
有研究顯示，利用CRISPR/Cas9技術(shù)編輯水稻產(chǎn)生的突變可以穩(wěn)定遺傳到后代植株[18-19]。本研究在T0代獲得2種純合敲除水稻，分別為缺失3個堿基株系(#6) 與4個堿基株系(#10)。由于缺失3或3倍數(shù)的堿基突變不會造成移碼突變，株系#6是無效的，因此需要在T1代繼續(xù)進行純合株系的篩選，獲得足夠的突變材料。對T1代水稻(24株來自T0代純合種子#10，153株來自T0代雜合突變與雙等位突變種子#1、#2、#3、#5、#7、#8、#9、#11) 繼續(xù)篩選，共獲得8種純合敲除水稻。對T1代純合敲除水稻編輯靶點的分析發(fā)現(xiàn)，在T0代純合的#10株系其后代均保持與T0代相同的突變類型，說明T0代獲得的純合株系在T1代可以穩(wěn)定遺傳，也說明采用CRISPR/Cas9技術(shù)在T0代便有可能篩選到純合敲除水稻，這與王美娜等[20]的研究結(jié)果一致，證明CRISPR/Cas9技術(shù)具有高效性與穩(wěn)定性。
利用T1代純合敲除株系進行初步的表型分析，發(fā)現(xiàn)最顯著的差異體現(xiàn)在株高這一性狀上。株高是直接影響水稻品種抗倒性能與產(chǎn)量的重要農(nóng)藝學(xué)性狀[21]，研究株高對于更好地了解植物的生長發(fā)育規(guī)律以及植物分子育種具有重要意義[22]。但是，株高的調(diào)控是一個復(fù)雜的過程。Liang等將達到正常植株高度50%與50%?100%的植株分別定義為矮化和半矮化植株[23]，本研究所分析的3種基因T1代純合敲除水稻株系相比野生型，株高均處于野生型株高50%?100%之間，屬于半矮化類型。半矮化植株在第一次“綠色革命”時被用來培育抗倒伏作物新品種，從而大幅度提高了糧食產(chǎn)量[24]。已知水稻節(jié)間數(shù)目與節(jié)間長度影響株高[25]。Takahashi與Takeda等根據(jù)水稻各莖節(jié)的長短，將水稻矮化突變體分為、、、與5種類型，本文獲得的突變體均出現(xiàn)第Ⅱ和第Ⅲ莖節(jié)顯著縮短的現(xiàn)象，屬于類。目前，植物RhoGDI與株高相關(guān)研究尚未見報道，而敲除水稻的株高相比野生型均有極顯著降低，提示基因與株高控制關(guān)系密切，值得深入研究其作用機制。
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Disruption ofby CRISPR/Cas9 technology leads to semi-dwarf in rice
Kaijie Wang, Wenjing An, Yafei Liu, Di Liu, Lianjie Feng, Junjie Wang, Junjun Huang, Xiaofei Liu, and Weihong Liang
College of Life Sciences,Henan Normal University, Xinxiang 453007, Henan, China
was isolated as a putative partner of Rho protein family member OsRacD from rice panicles by yeast two-hybrid, but its function remains unknown. In order to identify the function of,knockout mutants were created by CRISPR/Cas9 technology. The results showed that two different homozygous mutants were obtained in T0generation, and eight kinds homozygous mutants were identified in T1generation. Sequence analysis revealed that the base substitution or base deletion occurred near the editing targets of the gene in knockout rice, and it could be expected that the truncated OsRhoGDI2 proteins lacking the RhoGDI conserved domain would be generated. Phenotype analysis showed that theknockout rice plants were significantly lower than the control plants. Statistical analysis confirmed that the significant decrease of plant height was due to the shortening of the second and third internodes, suggesting thatgene may be related with rice height control.
CRISPR/Cas9 technology, rice,, plant height
July 24, 2019;
September 11, 2019
Supported by: National Natural Science Foundation of China (Nos. U1704101, 31701070, 31701508), Program for Innovative Research Team (in Science and Technology) in University of Henan Province (No. 15IRTSTHN020).
Weihong Liang. Tel: +86-373-3326340; E-mail: liangwh@htu.cn
國家自然科學(xué)基金 (Nos. U1704101, 31701070, 31701508)，河南省高校科技創(chuàng)新團隊支持計劃 (No. 15IRTSTHN020) 資助。
2019-10-10
http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1998.q.20191010.1048.006.html
10.13345/j.cjb.190333
王凱婕, 安文靜, 劉亞菲, 等.CRISPR/Cas9技術(shù)編輯基因?qū)е滤景氚? 生物工程學(xué)報, 2020, 36(4): 707–715.
Wang KJ, An WJ, Liu YF, et al. Disruption ofby CRISPR/Cas9 technology leads to semi-dwarf in rice. Chin J Biotech, 2020, 36(4): 707–715.
(本文責編 陳宏宇)
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