三酶級(jí)聯(lián)催化L-蘇氨酸生產(chǎn)L-2-氨基丁酸

付妍，張君軒，付雪蓉，解雨晨，任泓宇，劉佳，陳修來，劉立明,3

·生物技術(shù)與方法·

三酶級(jí)聯(lián)催化L-蘇氨酸生產(chǎn)L-2-氨基丁酸

付妍1,2，張君軒1,2，付雪蓉1,2，解雨晨1,2，任泓宇1,2，劉佳1，陳修來1，劉立明1,2,3

1 江南大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫 214122 2 江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無錫 214122 3 江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫 214122

L-2-氨基丁酸(L-ABA) 是一種重要的化工原材料和手性醫(yī)藥中間體，為了實(shí)現(xiàn)L-ABA的高效生產(chǎn)，本研究在大腸桿菌BL21 (DE3) 中分別表達(dá)大腸桿菌來源的蘇氨酸脫氨酶 (Threonine deaminase，TD)、蘇云金芽孢桿菌來源的亮氨酸脫氫酶 (Leucine dehydrogenase，LDH) 和博伊丁假絲酵母來源的甲酸脫氫酶(Formate dehydrogenase，F(xiàn)DH)，構(gòu)建體外級(jí)聯(lián)酶催化反應(yīng)實(shí)現(xiàn)L-蘇氨酸向L-ABA的轉(zhuǎn)化，體系中TD、LDH和FDH添加最適比例為1∶1∶0.2。為了簡化生產(chǎn)工藝，將3種酶在一株菌3FT+L中共表達(dá)并實(shí)現(xiàn)上述配比，在30 L發(fā)酵罐中用3FT+L全細(xì)胞轉(zhuǎn)化12 h，L-ABA的產(chǎn)量為68.5 g/L，底物L(fēng)-蘇氨酸的摩爾轉(zhuǎn)化率達(dá)到99.0%。該工藝路線綠色高效，為未來大規(guī)模生產(chǎn)L-ABA提供借鑒。

L-2-氨基丁酸，三酶級(jí)聯(lián)，共表達(dá)重組菌，全細(xì)胞轉(zhuǎn)化，L-蘇氨酸

L-2-氨基丁酸(L-ABA) 作為一種非天然氨基酸和重要的醫(yī)藥中間體，廣泛應(yīng)用于藥物合成領(lǐng)域，如抑菌抗結(jié)核藥物鹽酸乙胺丁醇[1-2]、新型抗癲癇藥物左乙拉西坦和布瓦西坦[3]等。L-ABA合成方法包括化學(xué)法和生物法?；瘜W(xué)法主要采用酮丁酸還原法[4]、脫硫反應(yīng)法[5]、鹵代氨解法[6-7]、化學(xué)拆分法[8]，但缺點(diǎn)是易形成消旋體，不利于手性化合物的合成，且反應(yīng)條件嚴(yán)苛、環(huán)境污染嚴(yán)重、不易進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)。生物法因反應(yīng)條件溫和、立體選擇性高和綠色環(huán)保等特點(diǎn)而廣受關(guān)注，其中生物發(fā)酵法是對(duì)生產(chǎn)L-蘇氨酸的大腸桿菌進(jìn)行代謝改造，在含有30 g/L葡萄糖的培養(yǎng)基中合成5.4 g/L的L-ABA[9]。另一方法是生物酶催化法，包括腈水解酶法、轉(zhuǎn)氨酶法和氨基酸脫氫酶法等。腈水解酶法是以DL-氨基丁腈為底物，直接水解L-氨基丁腈獲得L-ABA，或通過腈水合酶結(jié)合L-氨基酸酰胺酶將L-氨基丁腈轉(zhuǎn)化成L-ABA[10]。轉(zhuǎn)氨酶法是以2-酮丁酸(2-OBA) 及提供氨基供體的L-天冬氨酸或L-谷氨酸等為底物，通過氨基轉(zhuǎn)移酶或者氨基酸脫氫酶制備L-ABA，這一方法缺點(diǎn)是副產(chǎn)物草酰乙酸容易脫羧得到丙酮酸，進(jìn)而生成副產(chǎn)物L(fēng)-丙氨酸，不利于后續(xù)分離純化[11-12]。L-氨基酸脫氫酶法是借助于中間型高溫放線菌的亮氨酸脫氫酶(LDH) 將2-OBA轉(zhuǎn)化為36 g/L L-ABA，產(chǎn)率達(dá)到88%[12]。但由于2-OBA成本高且不穩(wěn)定，因此，研究人員利用蘇氨酸脫氨酶(TD) 將較為廉價(jià)的L-蘇氨酸轉(zhuǎn)化為生產(chǎn)2-OBA，在此基礎(chǔ)上通過過量表達(dá)LDH和輔酶NADH再生用酶甲酸脫氫酶(FDH)，高效制備L-ABA。如Tao等[13]在BL21 (DE3) 中分別過表達(dá)TD、LDH、FDH，轉(zhuǎn)化體系中需要同時(shí)添加3種濕菌體，采用“一鍋法”在30 L轉(zhuǎn)化體系中將30 mol L-蘇氨酸轉(zhuǎn)化為29.2 mol L-ABA，產(chǎn)率為97.3%。

脫氫酶法具有底物成本低廉和反應(yīng)不可逆等優(yōu)點(diǎn)，但是上述研究的催化體系中通常需要添加多種酶液，并進(jìn)行酶活優(yōu)化配比[12-13]，增加了工藝的復(fù)雜性和生產(chǎn)成本，若將TD、LDH和FDH這3種酶在單一細(xì)胞中表達(dá)，可以簡化生產(chǎn)工藝便于對(duì)反應(yīng)條件進(jìn)行精確調(diào)整和優(yōu)化。本研究利用TD、LDH和FDH構(gòu)建了體外催化L-蘇氨酸生產(chǎn)L-ABA的級(jí)聯(lián)路徑，在.BL21中對(duì)3種酶共表達(dá)方式進(jìn)行優(yōu)化，構(gòu)建了重組菌株3FT+L，實(shí)現(xiàn)三酶的協(xié)調(diào)穩(wěn)定表達(dá)，并對(duì)轉(zhuǎn)化體系進(jìn)行優(yōu)化，最終實(shí)現(xiàn)了L-ABA的高效生產(chǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒

本研究使用的質(zhì)粒pET28a、pETDuet、pRSFDuet均購自Novagen公司，使用的菌株見 表1。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

分子生物學(xué)工具酶、SDS-PAGE Protein Marker、質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒等分子生物學(xué)試劑購自TaKaRa有限公司；2-OBA和L-ABA標(biāo)準(zhǔn)品購自Sigma公司；異丙基-β-D-硫代半乳糖(IPTG)、硫酸卡那霉素(Kan)、氨芐青霉素(Amp) 購自生工生物工程 (上海) 股份有限公司；其余常規(guī)試劑購自國藥集團(tuán)。

1.2 方法

1.2.1 重組菌株的構(gòu)建

使用特異性引物分別從不同微生物中克隆編碼TDLDH和FDH的目的基因，限制內(nèi)切酶雙酶切目的條帶，然后連接于同樣雙酶切的表達(dá)載體pET28a獲得重組質(zhì)粒，將構(gòu)建完成質(zhì)粒導(dǎo)入BL21 (DE3) 后獲得基因工程菌株。

構(gòu)建共表達(dá)菌株時(shí)，從蘇云金芽孢桿菌基因組中克隆編碼LDH的基因，連接于高拷貝質(zhì)粒pRSFDuet，構(gòu)建重組質(zhì)粒pRSFDuet-；將博伊丁假絲酵母來源的基因連接于pETDuet，構(gòu)建重組質(zhì)粒pETDuet-，從K12基因組中克隆編碼TD的基因連接于質(zhì)粒pETDuet-，構(gòu)建重組質(zhì)粒pETDuet--，將上述兩種重組質(zhì)粒導(dǎo)入BL21 (DE3)，在含有Amp和Kan的平板上篩選陽性克隆，得到雙質(zhì)粒共表達(dá)菌株FT+L。

FT+L菌株中重復(fù)表達(dá)基因，即在pETDuet--質(zhì)粒上分別通過一步克隆試劑盒連接不同個(gè)數(shù)的基因構(gòu)建質(zhì)粒pETDuet- 2、pETDuet-3和pETDuet- 4。

1.2.2 培養(yǎng)基與培養(yǎng)方法

LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g/L，酵母粉5 g/L，NaCl 10 g/L，用于質(zhì)粒的構(gòu)建、擴(kuò)增和種子液的培養(yǎng)。

宏觀來講，其中涉及到長時(shí)期演變——不同朝代的營造活動(dòng)本身的時(shí)代特征；以及短時(shí)期演變——重大歷史事件帶來的影響，如移民活動(dòng)等。中觀來看不同區(qū)域的匠派發(fā)展具有其特殊的傳承脈絡(luò)。隨著工具的進(jìn)步、社會(huì)的發(fā)展及審美等的變化，本身匠派的營造發(fā)展也隨之變化，結(jié)構(gòu)更為穩(wěn)定，同時(shí)更追求美觀。具體而微，匠師個(gè)人的接受與傳承活動(dòng)本身就具有一定的變化與不確定性。

TB培養(yǎng)基：甘油4 g/L，胰蛋白胨12 g/L，酵母粉24 g/L，KH2PO42.31 g/L，K2HPO412.54 g/L，用于重組菌株發(fā)酵培養(yǎng)。

補(bǔ)料培養(yǎng)基：甘油500 g/L，MgSO4·7H2O 30 g/L。

種子培養(yǎng)條件：從斜面保藏培養(yǎng)基中接一環(huán)菌種至25 mL LB培養(yǎng)基中，根據(jù)重組菌選擇壓力添加100 μg/mL Kan或Amp，37 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)10 h。

搖瓶培養(yǎng)與誘導(dǎo)條件：取 1 mL的種子培養(yǎng)液接種于25 mL TB培養(yǎng)基中，根據(jù)重組菌選擇壓力添加100 mg/L Kan或Amp，37 ℃、200 r/min培養(yǎng)600至0.6時(shí)，添加100 mg/L的IPTG于25 ℃下誘導(dǎo)8–12 h。

發(fā)酵罐培養(yǎng)與誘導(dǎo)條件：將種子液按照5%接種量轉(zhuǎn)接于發(fā)酵罐，初始發(fā)酵溫度37 ℃、500 r/min下培養(yǎng)至600為12–14時(shí)，溶氧突然上升，此時(shí)開始流加補(bǔ)料培養(yǎng)基，通過補(bǔ)料控制溶氧水平在30%–40%，當(dāng)600在25左右時(shí)，添加5 g/L的乳糖于25 ℃下誘導(dǎo)，總發(fā)酵周期24 h，發(fā)酵結(jié)束后發(fā)酵液經(jīng)4 ℃離心收集菌體。

1.2.3 共表達(dá)重組菌轉(zhuǎn)化條件

250 mL搖瓶轉(zhuǎn)化條件優(yōu)化：轉(zhuǎn)速為 200 r/min，溫度為30 ℃，根據(jù)不同條件添加不同酶活TD、LDH、FDH，不同濃度的L-蘇氨酸，甲酸銨與蘇氨酸摩爾濃度比為1∶1，NAD+30 mg/L，使用20 mmol/L磷酸鹽緩沖液 (pH 7.5) 定容至 20 mL。

30 L發(fā)酵罐全細(xì)胞轉(zhuǎn)化條件：攪拌轉(zhuǎn)速 400 r/min，通氣量15 L/min，溫度37 ℃，用4 mol/L NaOH溶液控制pH 8.0，濕菌體20 g/L，L-蘇氨酸80 g/L，甲酸銨與蘇氨酸摩爾濃度比為1∶1，NAD+為30 mg/L，反應(yīng)體積為15 L。

1.2.4 酶活測(cè)定

單酶表達(dá)重組菌株使用凍干菌體或純酶檢測(cè)酶活。共表達(dá)菌株超聲破碎細(xì)胞，離心取上清液檢測(cè)粗酶液酶活。TD、LDH、FDH的酶活性測(cè)定參考文獻(xiàn)報(bào)道[14-16]。

1.2.5 檢測(cè)方法

高效液相色譜法檢測(cè)L-Thr、2-OBA和L-ABA濃度[13-14]。

表1 本文所用的菌株

2 結(jié)果與分析

2.1 L-蘇氨酸合成L-ABA的級(jí)聯(lián)反應(yīng)設(shè)計(jì)與體外構(gòu)建

如圖1所示，L-蘇氨酸轉(zhuǎn)化生產(chǎn)L-ABA的反應(yīng)分為兩步：第一步是利用L-蘇氨酸脫氨酶(L-threonine deaminase，TD，EC 4.3.1.19) 將L-蘇氨酸脫去羥基和氨基轉(zhuǎn)化為2-OBA；第二步反應(yīng)利用亮氨酸脫氫酶(Leucine dehydrogenase, LDH, EC1.4.1.9) 將2-OBA的羰基不對(duì)稱還原為氨基生成L-ABA。由于第二步是氧化還原反應(yīng)，需要輔酶NADH參與，因此在設(shè)計(jì)級(jí)聯(lián)反應(yīng)時(shí)需要偶聯(lián)輔酶再生系統(tǒng)。

通過Brenda數(shù)據(jù)庫(https://www.brenda- enzymes.org/)，選取來源于枯草芽孢桿菌、谷氨酸棒桿菌和K12的TD，因其具有較高的比酶活[17]，將3種酶基因克隆表達(dá)于BL21中，構(gòu)建獲得重組菌株BL21-BsTD、BL21-CgTD和BL21-EcTD。搖瓶發(fā)酵14 h收集濕菌體冷凍干燥，測(cè)定不同來源的TD對(duì)L-蘇氨酸活性，BL21- BsTD、BL21-CgTD和BL21-EcTD的凍干細(xì)胞 對(duì)L-蘇氨酸的比活力分別為2.04、3.21 U/mg、15.8 U/mg，因此選擇來源于的TD用于第一步轉(zhuǎn)化反應(yīng)。采用類似的策略，將來源于、地衣芽孢桿菌、熱醋穆爾氏菌、的亮氨酸脫氫酶LDH[12,18]，分別克隆表達(dá)于BL21構(gòu)建重組菌株BL21-BtLDH、BL21-BsLDH、BL21-BlLDH、BL21-MtLDH、BL21-TiLDH。搖瓶發(fā)酵14 h收集濕菌體冷凍干燥，測(cè)定不同菌株的LDH對(duì)2-OBA的酶活，其中BL21-BsLDH和BL21-BlLDH對(duì)2-OBA無催化活性，BL21-BtLDH、BL21-MtLDH和BL21-TiLDH的凍干細(xì)胞對(duì)2-OBA比活力分別為1.56、0.28、1.01 U/mg，因此選擇來源的LDH用于第二步轉(zhuǎn)化。由于來源的FDH具有廣泛的工業(yè)應(yīng)用潛力[19-20]，因此在BL21(DE3)中表達(dá)來源構(gòu)建重組菌BL21-CbFDH，比活力為1.38 U/mg。

圖1 L-蘇氨酸合成L-ABA級(jí)聯(lián)反應(yīng)的設(shè)計(jì)[13]

使用鎳柱將TD、LDH和FDH進(jìn)行蛋白質(zhì)純化(圖2A)，將純化所獲得的純酶添加到 5 mL的體外轉(zhuǎn)化體系中，添加10 g/L底物L(fēng)-蘇氨酸，采用LC-MS結(jié)構(gòu)鑒定轉(zhuǎn)化液中是否催化合成了L-ABA，對(duì)轉(zhuǎn)化液中產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，L-ABA分子量為103.1，使用陰離子色譜檢測(cè)分子量為102.05 (圖2B)，證明獲得目標(biāo)產(chǎn)物L(fēng)-ABA，說明采用TD、LDH和FDH級(jí)聯(lián)催化L-蘇氨酸生成L-ABA是可行的。為了獲得更高的轉(zhuǎn)化率，對(duì)體外轉(zhuǎn)化體系的3種酶的濃度及其配比進(jìn)行優(yōu)化。L-蘇氨酸濃度為50 g/L，固定TD酶活為12 U/mL，優(yōu)化TD與LDH酶活比例，結(jié)果如圖2C所示，在TD與LDH酶活比為1.0︰1–2.0︰1時(shí)，L-ABA產(chǎn)量((40.7±0.2) g/L) 和摩爾轉(zhuǎn)化率(94.0%±0.5%) 達(dá)到較高水平。固定TD與LDH酶活比為1︰1 (固定LDH酶活為12 U/mL)，體系中添加LDH與FDH酶活比為1︰0.05–1︰0.3，結(jié)果如圖2D所示。當(dāng)酶活比例為1︰0.2–1︰0.3時(shí)，L-ABA產(chǎn)量達(dá)到40.0 g/L以上，當(dāng)?shù)陀谠摫壤龝r(shí)，L-ABA產(chǎn)量和摩爾轉(zhuǎn)化率均下降，說明體系中FDH酶活至少達(dá)到LDH的20%及以上，才能夠保證提供充足的輔酶NADH。因此確定TD、LDH和FDH最佳比例為1︰1︰0.2，此時(shí)酶添加量最低且能夠保證L-蘇氨酸高效轉(zhuǎn)化。

圖2 體外催化TD、LDH和FDH酶活比例優(yōu)化

2.2 三酶級(jí)聯(lián)菌株的構(gòu)建與優(yōu)化

為了進(jìn)一步簡化工藝，將TD、LDH和FDH在BL21(DE3)中共表達(dá)，使用pRSFDuet質(zhì)粒連接，質(zhì)粒pETDuet將與串聯(lián)表達(dá)，構(gòu)建重組菌株FT+L，菌體破碎后進(jìn)行蛋白電泳驗(yàn)證，結(jié)果如圖3A所示。TD、LDH和FDH理論蛋白分子量分別為56.2、39.8、40.4 kDa，目的蛋白條帶大小符合預(yù)期，由于LDH和FDH蛋白分子量相近，出現(xiàn)重疊條帶。對(duì)重組菌FT+L的催化性能進(jìn)行評(píng)價(jià)，在20 mL體系中添加L-蘇氨酸10– 50 g/L，底物與濕菌體質(zhì)量比為2.5︰1。當(dāng)L-蘇氨酸濃度從10增加至50 g/L時(shí)，摩爾轉(zhuǎn)化率 從95.0%降至45.2%，而中間產(chǎn)物2-OBA濃度從0.43 g/L上升至25.8 g/L (圖3B)。其原因是3種酶的酶活不均衡導(dǎo)致2-OBA無法持續(xù)轉(zhuǎn)化為L-ABA，進(jìn)一步測(cè)定濕細(xì)胞中3種酶的酶活，在FT+L濕細(xì)胞中，TD、LDH和FDH酶活分別為1508.8、885.0、117.1 U/g，酶活比為1.7︰1︰0.13，與體外最佳比例為1︰1︰0.2不符，F(xiàn)DH酶活偏低導(dǎo)致NADH再生效率低下，轉(zhuǎn) 化通路不平衡，導(dǎo)致中間產(chǎn)物出現(xiàn)積累，因此對(duì)FT+L進(jìn)行表達(dá)水平優(yōu)化。

重復(fù)表達(dá)目標(biāo)基因可以顯著提高目標(biāo)酶的酶活[21-22]，在FT+L中重復(fù)表達(dá)基因2–4次獲得重組菌株2FT+L、3FT+L和4FT+L，蛋白電泳圖譜如圖4所示，表達(dá)的目的蛋白條帶大小與理論值一致，菌株構(gòu)建成功。檢測(cè)FT+L、2FT+L、3FT+L和4FT+L濕菌體中TD、LDH和FDH酶活，結(jié)果如圖5A所示。隨著重復(fù)次數(shù)的增加，F(xiàn)DH酶活從117.1 U/g分 別上升至164.6、179.0、191.9 U/g，TD酶活從1 508.8 U/g分別下降至1 158.0、855.9、706.3 U/g，LDH酶活呈略微下降的趨勢(shì)。結(jié)果顯示，3FT+L中TD、LDH和FDH酶活比接近1︰1︰0.2。以3FT+L為催化劑，L-ABA產(chǎn)量達(dá)到42.4 g/L，摩爾轉(zhuǎn)化率達(dá)到98.0%，質(zhì)量轉(zhuǎn)化率為84.8%，未檢測(cè)到 L-Thr積累，2-OBA殘留僅0.23 g/L(圖5B)，表明反應(yīng)體系中輔酶NADH供應(yīng)正常，3種酶實(shí)現(xiàn)均衡協(xié)調(diào)表達(dá)。

圖3 重組菌株E. coli FT+L的構(gòu)建與轉(zhuǎn)化效果評(píng)價(jià)

2.3 5 L發(fā)酵罐上E. coli 3FT+L生產(chǎn)L-ABA條件優(yōu)化

為了進(jìn)一步提高L-ABA的生產(chǎn)效率，5 L發(fā)酵罐上對(duì)轉(zhuǎn)化條件進(jìn)行優(yōu)化。固定濕菌體質(zhì)量為25 g/L，不同L-蘇氨酸濃度(70–90 g/L)對(duì)L-ABA生產(chǎn)的影響如圖6A所示。當(dāng)蘇氨酸濃度達(dá)到80 g/L時(shí)，L-ABA產(chǎn)量達(dá)到最高為62.6 g/L，摩爾轉(zhuǎn)化率為90.4%，繼續(xù)增加L-蘇氨酸的濃度，L-ABA產(chǎn)量不再增加。在此基礎(chǔ)上，固定L-蘇氨酸濃度為80 g/L，不同濕菌體濃度(15–35 g/L) 對(duì)L-ABA生產(chǎn)的影響如圖6B所示。當(dāng)添加濕菌體為20 g/L時(shí)，L-ABA產(chǎn)量達(dá)到63.7 g/L，摩爾轉(zhuǎn)化率為92.0%，繼續(xù)增加濕菌體質(zhì)量，L-ABA產(chǎn)量也不增加。

圖4 fdh重復(fù)表達(dá)菌株的SDS-PAGE分析

圖5 fdh基因重復(fù)表達(dá)菌株酶活檢測(cè)與轉(zhuǎn)化效果評(píng)價(jià)

圖6 L-蘇氨酸和菌體濃度對(duì)L-ABA產(chǎn)量及轉(zhuǎn)化率的影響

考察不同溫度對(duì)3FT+L全細(xì)胞級(jí)聯(lián)催化性能的影響，在3FT+L濕菌體20 g/L、L-蘇氨酸80 g/L時(shí)，研究不同轉(zhuǎn)化溫度(25–45 ℃)對(duì)L-ABA生產(chǎn)的影響，當(dāng)轉(zhuǎn)化最適溫度為37 ℃，16 h時(shí)摩爾轉(zhuǎn)化率達(dá)到96.5%；當(dāng)轉(zhuǎn)化溫度低于37 ℃，轉(zhuǎn)化周期延長至22 h以上；當(dāng)轉(zhuǎn)化溫度為45 ℃時(shí)，摩爾轉(zhuǎn)化率只能達(dá)到88.2% (圖7A)。于是在37 ℃下考察不同pH對(duì)全細(xì)胞轉(zhuǎn)化生產(chǎn)L-ABA的影響，在pH 7.0–8.5范圍內(nèi)，L-ABA摩爾轉(zhuǎn)化率均能達(dá)到95.0%以上，在最適pH為8.0時(shí)轉(zhuǎn)化周期最短為14 h，L-ABA摩爾轉(zhuǎn)化率達(dá)到98.2% (圖7B)。

2.4 30 L發(fā)酵罐規(guī)模化生產(chǎn)L-ABA

在30 L發(fā)酵罐上采用分批補(bǔ)料的方式培養(yǎng)3FT+L，隨著菌體濃度不斷增加，酶活不斷提高，發(fā)酵24 h濕菌體濃度達(dá)到105.9 g/L，此時(shí)發(fā)酵液中TD、LDH和FDH的酶活分別達(dá)到114.7、101.0、22.3 U/mL (圖8A)，TD、LDH和FDH酶活比為1︰1︰0.2。

30 L發(fā)酵罐中轉(zhuǎn)化體積為15 L，3FT+L濕菌體20 g/L，L-蘇氨酸80 g/L，溫度37 ℃，使用NaOH調(diào)節(jié)pH為8.0，隨著轉(zhuǎn)化時(shí)間的增加，L-ABA逐漸積累，當(dāng)12 h時(shí)L-ABA產(chǎn)量最高達(dá)到68.5 g/L，摩爾轉(zhuǎn)化率達(dá)到99.0%，質(zhì)量轉(zhuǎn)化率達(dá)到85.6%，L-ABA生產(chǎn)速率為5.71 g/(L·h) (圖8B)。

圖7 溫度和pH對(duì)轉(zhuǎn)化反應(yīng)的影響

圖8 E. coli 3FT+L高密度發(fā)酵與轉(zhuǎn)化生產(chǎn)L-ABA

3 結(jié)論

利用TD、LDH和FDH三酶級(jí)聯(lián)轉(zhuǎn)化L-蘇氨酸生產(chǎn)L-ABA，目前存在輔因子NADH再生用酶的效率較低、多酶催化的轉(zhuǎn)化速率協(xié)同性差、需要培養(yǎng)多種基因工程菌使成本高等問題。針對(duì)上述問題，本研究開發(fā)了一種高效簡約制備L-ABA工藝路線，采用一次性投料，轉(zhuǎn)化體系中添加單一細(xì)胞3FT+L 20 g/L，轉(zhuǎn)化12 h，L-ABA產(chǎn)量達(dá)到68.5 g/L，摩爾轉(zhuǎn)化率達(dá)99.0%，為后續(xù)酶法規(guī)?；a(chǎn)L-ABA奠定一定的理論基礎(chǔ)。

[1] Goncalves RSB, da Silva ET, de Souza N, et al. An environmentally friendly, scalable and highly efficient synthesis of (S, S)-ethambutol, a first line drug against tuberculosis. Lett Org Chem, 2015, 12(7): 478–481.

[2] Bai GY, Chen LG, Xing P, et al. Synthesis of ethambutol. Fine Chem, 2004, 21(12): 943–945, 949 (in Chinese). 白國義, 陳立功, 邢鵬, 等. 乙胺丁醇的合成. 精細(xì)化工, 2004, 21(12): 943–945, 949.

[3] Shin JS, Kim BG. Transaminase-catalyzed asymmetric synthesis of L-2-aminobutyric acid from achiral reactants. Biotechnol Lett, 2009, 31(10): 1595–1599.

[4] Fujii C, Yasui M, Ishimathu Y. Process for production of (+)-2-amino-1-butanol: US, 3979457, 1976-09-07.

[5] Zhou XB, Xu GY, Zhou Y, et al. Synthesis of anticonvulsant drug levetiracetam. Fine Chem Intermed, 2005, 35(2): 27–28 (in Chinese). 周先波, 徐廣宇, 周伊, 等. 抗癲癇治療藥物左乙拉西坦的合成研究. 精細(xì)化工中間體, 2005, 35(2): 27–28.

[6] Yin XQ, Sun F, Ge SX. Development of synthesis of α-aminobutyric acid. Fine Chem Intermed, 2010, 40(1): 12–14 (in Chinese). 尹先清, 孫芳, 葛勝祥. α-氨基丁酸化學(xué)合成研究進(jìn)展. 精細(xì)化工中間體, 2010, 40(1): 12–14.

[7] Jeffery EA, Meisters A. Electrochemical synthesis of amino acids by reductive amination of keto acids. I. Reduction at mercury electrodes. Aust J Chem, 1978, 31(1): 73–78.

[8] Synoradzki L, Ru?kowski P, Berna? U. Tartaric acid and its-acyl derivatives. Part 1. Synthesis of tartaric acid and-acyl tartaric acids and anhydrides. Org Prep Proced Int, 2005, 37(1): 37–63.

[9] Zhang KC, Li H, Cho KM, et al. Expanding metabolism for total biosynthesis of the nonnatural amino acid L-homoalanine. Proc Natl Acad Sci USA, 2010, 107(14): 6234–6239.

[10] Fotheringham IG, Grinter N, Pantaleone DP, et al. Engineering of a novel biochemical pathway for the biosynthesis of L-2-aminobutyric acid inK12. Bioorgan Med Chem, 1999, 7(10): 2209–2213.

[11] Li T, Kootstra AB, Fotheringham IG. Nonproteinogenic α-amino acid preparation using equilibrium shifted transamination. Orga Proc Res Dev, 2002, 6(4): 533–538.

[12] Galkin A, Kulakova L, Yoshimura T, et al. Synthesis of optically active amino acids from alpha-keto acids withcells expressing heterologous genes. Appl Environ Microbiol, 1997, 63(12): 4651–4656.

[13] Tao RS, Jiang Y, Zhu FY, et al. A one-pot system for production ofL-2-aminobutyric acid fromL-threonine byL-threonine deaminase and a NADH-regeneration system based onL-leucine dehydrogenase and formate dehydrogenase. Biotechol Lett, 2013, 36(4): 835–841.

[14] Umbarger HE, Brown B. Threonine deamination in. II. Evidence for twoL-threonine deaminases. J Bacteriol, 1957, 73(1): 105–112.

[15] Ansorge MB, Kula MR. Production of recombinant L-leucine dehydrogenase fromin pilot scale using the runaway replication system[piet98]. Biotechnol Bioeng, 2000, 68(5): 557–562.

[16] Berríos-Rivera SJ, Bennett GN, San KY. Metabolic engineering of: increase of NADH availability by overexpressing an NAD+-dependent formate dehydrogenase. Metab Eng, 2002, 4(3): 217–229.

[17] Yu XF, Li Y, Wang XY. Molecular evolution of threonine dehydratase in bacteria. PLoS ONE, 2013, 8(12): e80750.

[18] Song W, Wang JH, Wu J, et al. Asymmetric assembly of high-value α-functionalized organic acids using a biocatalytic chiral-group-resetting process. Nat Commun, 2018, 9: 3818.

[19] Zhang C, Xing XH. Research progress in cofactor regeneration systems. Chin J Biotech, 2004, 20(6): 811–816 (in Chinese). 張翀, 邢新會(huì). 輔酶再生體系的研究進(jìn)展. 生物工程學(xué)報(bào), 2004, 20(6): 811–816.

[20] Zhao HM, van der Donk WA. Regeneration of cofactors for use in biocatalysis. Curr Opin Biotechnol, 2003, 14(6): 583?589.

[21] Hepworth LJ, France SP, Hussain S, et al. Enzyme cascades in whole cells for the synthesis of chiral cyclic amines. ACS Catal, 2017, 7(4): 2920–2925.

[22] Qian YY, Liu J, Song W, et al. Production of β-alanine from fumaric acid using a dual-enzyme cascade. ChemCatChem, 2018, 10(21): 4984–4991.

Production of L-2-aminobutyric acid from L-threonine using a trienzyme cascade

Yan Fu1,2, Junxuan Zhang1,2, Xuerong Fu1,2, Yuchen Xie1,2, Hongyu Ren1,2, Jia Liu1, Xiulai Chen1, and Liming Liu1,2,3

1State Key Laboratory of Food Science & Technology, Jiangnan University, Wuxi 214122, Jiangsu, China 2 School of Biotechnology, Jiangnan University, Wuxi 214122, Jiangsu, China 3 Key Laboratory of Industrial Biotechnology, Ministry of Education, Jiangnan University, Wuxi 214122, Jiangsu, China

L-2-aminobutyric acid (L-ABA) is an important chemical raw material and chiral pharmaceutical intermediate. The aim of this study was to develop an efficient method for L-ABA production from L-threonine using a trienzyme cascade route with Threonine deaminase (TD) from, Leucine dehydrogenase (LDH) fromand Formate dehydrogenase (FDH) from. In order to simplify the production process, the activity ratio of TD, LDH and FDH was 1:1:0.2 after combining different activity ratios in the system. The above ratio was achieved in the recombinant strain3FT+L. Moreover, the transformation conditions were optimized. Finally, we achieved L-ABA production of 68.5 g/L with a conversion rate of 99.0% for 12 h in a 30-L bioreactor by whole-cell catalyst. The environmentally safe and efficient process route represents a promising strategy for large-scale L-ABA production in the future.

L-2-aminobutyric acid,trienzyme cascade, co-expressed recombinant bacteria, whole-cell catalyst, L-threonine

June 14, 2019;

June 24, 2019

Supported by:The Key Technologies R & D Program of Jiangsu Province (No. BE2018623), The Key Field R & D Program of Guangdong Province (No. 2019B020218001), The National First-class Discipline Program of Light Industry Technology and Engineering (No. LITE2018-08).

江蘇省科技支撐計(jì)劃社會(huì)發(fā)展項(xiàng)目(No. BE2018623)，廣東省重點(diǎn)領(lǐng)域研發(fā)計(jì)劃(No. 2019B020218001)，國家輕工技術(shù)與工程一流學(xué)科自主課題 (No. LITE2018-08) 資助。

Liming Liu. Tel/Fax: +86-510-85197875; E-mail: mingll@jiangnan.edu.cn

10.13345/j.cjb.190256

付妍, 張君軒, 付雪蓉, 等. 三酶級(jí)聯(lián)催化L-蘇氨酸生產(chǎn)L-2-氨基丁酸. 生物工程學(xué)報(bào), 2020, 36(4): 782–791.

Fu Y, Zhang JX, Fu XR, et al. Production of L-2-aminobutyric acid from L-threonine using a trienzyme cascade. Chin J Biotech, 2020, 36(4): 782–791.

(本文責(zé)編 郝麗芳)