MiR-22重組腺病毒的構(gòu)建及對HepG2細(xì)胞葡萄糖攝取的影響

廖立紅，袁文彬，陳勇，梁繼超

·生物技術(shù)與方法·

MiR-22重組腺病毒的構(gòu)建及對HepG2細(xì)胞葡萄糖攝取的影響

廖立紅1，袁文彬2，陳勇2，梁繼超2

1 武漢大學(xué)中南醫(yī)院 兒科，湖北 武漢 430071 2 湖北大學(xué) 中藥生物技術(shù)湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室藥物高通量篩選技術(shù)國家地方聯(lián)合工程研究中心，湖北 武漢 430062

文中構(gòu)建了miR-22重組腺病毒Ad-miR-22，分析了其對HepG2細(xì)胞胰島素信號通路及葡萄糖攝取的抑制作用。通過PCR方法，擴(kuò)增了miR-22的前體及側(cè)翼序列，酶切后克隆至腺病毒穿梭載體pAdTrack-CMV中，構(gòu)建穿梭質(zhì)粒pAdT-22，經(jīng)PCR及測序鑒定。穿梭質(zhì)粒經(jīng)Ⅰ線性化后，直接轉(zhuǎn)化含有腺病毒骨架載體的感受態(tài)細(xì)胞BJ5183，產(chǎn)生重組腺病毒質(zhì)粒Ad-miR-22，最后經(jīng)Ⅰ線性化后轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞系293A。重組腺病毒經(jīng)過3輪擴(kuò)增后感染HepG2細(xì)胞，通過熒光定量PCR檢測miR-22表達(dá)水平。通過葡萄糖攝取實(shí)驗(yàn)觀察Ad-miR-22對HepG2細(xì)胞葡萄糖攝取的影響。采用Western blotting檢測Ad-miR-22對HepG2細(xì)胞SIRT1在蛋白質(zhì)水平的表達(dá)及GSK-3β磷酸化水平的影響。采用熒光定量PCR檢測miR-22對PEPCK及G6Pase等基因在mRNA水平表達(dá)的影響。結(jié)果表明，重組腺病毒Ad-miR-22感染顯著增加HepG2細(xì)胞miR-22表達(dá)水平。此外，Ad-miR-22顯著抑制胰島素誘導(dǎo)的HepG2葡萄糖攝取，并通過下調(diào)GSK-3β磷酸化抑制胰島素信號通路的激活。Ad-miR-22反轉(zhuǎn)胰島素對糖異生關(guān)鍵酶表達(dá)的抑制作用，并下調(diào)SIRT1基因在蛋白質(zhì)水平的表達(dá)。綜上所述，構(gòu)建了miR-22的重組腺病毒，發(fā)現(xiàn)其顯著增加糖異生，抑制HepG2細(xì)胞葡萄糖攝取，該作用可能與miR-22調(diào)節(jié)SIRT1在蛋白質(zhì)水平的表達(dá)有關(guān)。

miR-22，重組腺病毒，葡萄糖攝取，糖異生，基因治療，SIRT1

隨著我國生活水平的提高、生活習(xí)慣的改變，糖尿病患者有不斷增加的趨勢。其中，2型糖尿病患者占比超過了90%。2型糖尿病的發(fā)病機(jī)制非常復(fù)雜，至今尚未完全研究清楚。過度激活的肝糖異生是2型糖尿病的重要發(fā)病機(jī)制之一[1]。

SIRT1作為一個(gè)重要的去乙?；?，在胰島素抵抗和2型糖尿病發(fā)生發(fā)展過程中扮演了重要角色。研究表明，SIRT1可以直接去乙?；疨GC-1α[2]，激活其轉(zhuǎn)錄共激活子的活性，促進(jìn)其下游靶基因的表達(dá)，而PGC-1α可以在體外及體內(nèi)強(qiáng)烈激活糖異生關(guān)鍵酶PEPCK及G6Pase等的表達(dá)[3]。SIRT1的激活劑白藜蘆醇可以通過激活SIRT1的去乙?；富钚?，調(diào)節(jié)FOXO1的核轉(zhuǎn)位，從而增加肝糖異生及葡萄糖輸出[4]。然而，有研究表明，白藜蘆醇可以增加肝胰島素敏感性，降低肝糖異生并促進(jìn)葡萄糖動(dòng)態(tài)平衡[5]。此外，研究發(fā)現(xiàn)SIRT1可以去乙酰化CRTC2，促進(jìn)其泛素介導(dǎo)的蛋白質(zhì)降解，從而抑制肝糖異生基因的表達(dá)[6]。可見，SIRT1對肝糖異生及2型糖尿病的調(diào)節(jié)有雙重作用。

microRNA是一類18–25個(gè)核苷酸的微小非蛋白質(zhì)編碼RNA，研究表明，其在多種疾病包括2型糖尿病的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮了重要調(diào)節(jié)作用[7-14]。miR-22通過抑制PPARα表達(dá)促進(jìn)心衰及心肌肥大，表明其在心肌能量代謝調(diào)控方面有重要調(diào)節(jié)作用[15]。miR-22直接靶向AKT通路抑制因子PTEN，進(jìn)而影響FOXO1核定位，可能對FOXO1下游靶基因表達(dá)有影響。有趣的是，AKT的失活會(huì)降低miR-22啟動(dòng)子的活性，這樣miR-22與PTEN和AKT之間可能形成一種反饋調(diào)節(jié)機(jī)制[16]。在正常飲食條件下，miR-22基因敲除小鼠表現(xiàn)出正常的葡萄糖耐受與胰島素耐受，但是，在高脂飲食條件下，miR-22基因敲除小鼠體重和血脂水平均低于正常小鼠[17]。以上研究顯示，miR-22可能在葡萄糖代謝方面，特別是肝葡萄糖穩(wěn)態(tài)平衡調(diào)節(jié)方面發(fā)揮了重要作用。本研究構(gòu)建了miR-22過表達(dá)重組腺病毒，發(fā)現(xiàn)miR-22能抑制SIRT1激活，并抑制HepG2細(xì)胞葡萄糖 攝取。

1 材料與方法

1.1 材料及試劑

限制性內(nèi)切酶Ⅰ及Ⅰ購于NEB公司。λ DNA/dⅢ及DL2000分子量標(biāo)準(zhǔn)購于TaKaRa公司。Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑及TRizol試劑購于Invitrogen公司。凝膠回收試劑盒購于AXYGEN公司。熒光定量PCR試劑盒購于TOYOBO公司。DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基、胎牛血清購于GIBCO公司。RIPA裂解液、BCA試劑盒、ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒購于碧云天公司。蛋白酶及磷酸酶抑制劑購于Roche公司。抗人SIRT1單克隆抗體購于Cell Signaling Technology公司?？谷甩?actin、p-GSK3β及T-GSK3β多克隆抗體購于萬類生物公司。miRNA提取試劑盒購于Ambion。質(zhì)粒大量提取試劑盒購于天根生化科技(北京)有限公司。

引物設(shè)計(jì)：擴(kuò)增miR-22前體及側(cè)翼序列、 熒光定量PCR的引物見表1 (小寫字母為酶切 位點(diǎn))。

表1 本研究所用引物

1.2 質(zhì)粒、菌株及細(xì)胞

穿梭載體pAdTrack-CMV來源于Invitrogen公司，由本實(shí)驗(yàn)室保存。大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α由本實(shí)驗(yàn)室制備并保存，BJ5183感受態(tài)由本實(shí)驗(yàn)室制備并保存。293A及HepG2細(xì)胞來源于武漢大學(xué)細(xì)胞中心，由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.3 穿梭質(zhì)粒及重組腺病毒質(zhì)粒的構(gòu)建

經(jīng)PCR擴(kuò)增的miR-22片段首先連接至pGEM-T easy載體，測序正確后，再用Ⅰ和Ⅰ雙酶切后亞克隆至pAdTrack-CMV載體上，構(gòu)建重組穿梭質(zhì)粒pAdT-22。重組質(zhì)粒pAdT-22用Ⅰ酶切線性化，回收純化后電轉(zhuǎn)化含有pAdEasy-1質(zhì)粒的BJ5183感受態(tài)細(xì)胞，卡那霉素篩選平板培養(yǎng)18 h左右，挑取6–8個(gè)較小的單克隆，小量提取質(zhì)粒DNA，用Ⅰ酶切篩選陽性克隆，得到重組腺病毒質(zhì)粒pAd-miR-22。

1.4 重組腺病毒的包裝和擴(kuò)增

大量提取質(zhì)粒pAd-miR-22，并純化，取約4 μg質(zhì)粒用Ⅰ進(jìn)行酶切線性化，經(jīng)乙醇沉淀回收后，用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染293A細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)，直至出現(xiàn)擴(kuò)增斑。繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞至約50%的細(xì)胞變圓并飄起，離心收集細(xì)胞，經(jīng)4次反復(fù)凍融裂解細(xì)胞，離心收集上清即得第1代重組腺病毒。按照Invitrogen公司說明書，對重組腺病毒進(jìn)行擴(kuò)增，第3代擴(kuò)增的腺病毒可用于細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，病毒滴度為5×109PFU/mL。

1.5 熒光定量PCR

按照試劑盒說明書提取miRNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄后采用Taqman探針法分析miR-22表達(dá)水平。細(xì)胞總RNA經(jīng)TRIzol提取后反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，采用SYBR法定量分析基因表達(dá)水平，結(jié)果采用2-ΔΔCt表示。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.6 葡萄糖攝取檢測

HepG2細(xì)胞接種于6孔板，感染腺病毒24 h后更換無血清DMEM培養(yǎng)基饑餓3 h，用50 μmol/L 2-NBDG (美國Invitrogen公司) 及100 nmol/L胰島素處理細(xì)胞30 min，收集細(xì)胞，于485 nm/535 nm激發(fā)/發(fā)射波長測定熒光值。為了校正細(xì)胞接種量的差異對結(jié)果的影響，葡萄糖攝取結(jié)果用總蛋白質(zhì)進(jìn)行歸一化處理，即數(shù)據(jù)用熒光強(qiáng)度除以蛋白質(zhì)濃度來表示。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.7 細(xì)胞糖原含量檢測

HepG2細(xì)胞接種于6孔板，感染相應(yīng)腺病毒24 h，血清饑餓12 h后100 nmol/L胰島素處理24 h，取105個(gè)細(xì)胞按照糖原含量檢測試劑盒(北京Solarbio公司)說明書進(jìn)行糖原含量測定。即離心收集細(xì)胞，用試劑盒提供的提取液重懸后超聲(200 W，每次3 s) 30次，之后煮沸20 min，按說明書加入相關(guān)試劑和濃硫酸，沸水浴10 min，冷卻后620 nm波長測定吸光值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.8 Western blotting

接種HepG2細(xì)胞于6孔板，24 h后感染Ad-GFP或Ad-miR-22。24 h后收集細(xì)胞RIPA裂解，或者無血清DMEM處理3 h后用100 nmol/L胰島素處理細(xì)胞15 min，之后RIPA裂解細(xì)胞。用于裂解細(xì)胞的RIPA含有蛋白酶及磷酸酶抑制劑。經(jīng)BCA法測定蛋白質(zhì)濃度。加入上樣緩沖液并煮沸10 min后上樣50 μg總蛋白質(zhì)進(jìn)行電泳。電泳結(jié)束后將蛋白轉(zhuǎn)印到PVDF膜上，3% BSA封閉后用相應(yīng)一抗4 ℃孵育過夜。TBST漂洗 4次，HRP標(biāo)記二抗室溫孵育1 h，TBST漂洗 6次，加入ECL化學(xué)發(fā)光液之后成像分析。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 構(gòu)建重組穿梭質(zhì)粒pAdT-22

設(shè)計(jì)引物，PCR擴(kuò)增miR-21片段，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增結(jié)果，如圖1所示，擴(kuò)增產(chǎn)物長度與預(yù)計(jì)相同。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)切膠回收后連接到pGEM-T easy載體上，再用Ⅰ和Ⅰ進(jìn)行酶切，同時(shí)pAd-Track-CMV載體用相同的酶進(jìn)行雙酶切，5 h后凝膠電泳并切膠回收DNA片段。將載體與miR-22片段按照1∶7混合，用T4 DNA連接酶進(jìn)行連接過夜，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞并涂卡那霉素抗性平板過夜，挑取2–3個(gè)單克隆，小量制備質(zhì)粒，經(jīng)Ⅰ和Ⅰ雙酶切后凝膠電泳鑒定。如圖2所示，雙酶切2 h后電泳，泳道1和2均出現(xiàn)一條約480 bp的DNA片段，說明可能是重組質(zhì)粒，泳道3可能是載體自連的產(chǎn)物。將泳道1和2相應(yīng)陽性克隆進(jìn)行測序，結(jié)果表明PCR擴(kuò)增產(chǎn)物插入pAd-Track-CMV載體，插入序列無突變，插入方向正確。以上結(jié)果證明重組穿梭質(zhì)粒pAdT-22構(gòu)建成功，可以用于下一步實(shí)驗(yàn)。

圖1 miR-22基因片段的PCR擴(kuò)增

圖2 重組穿梭質(zhì)粒pAdT-22的雙酶切鑒定

2.2 構(gòu)建重組腺病毒過表達(dá)載體

大量制備重組穿梭質(zhì)粒pAdT-22并進(jìn)行純化，取3 μg重組質(zhì)粒用Ⅰ酶切，凝膠電泳分離后進(jìn)行DNA片段回收。線性化的重組穿梭質(zhì)粒與含有pAdEasy-1骨架質(zhì)粒的BJ5183感受態(tài)細(xì)胞混合，在2 500 V、200 Ohms、25 μF的條件下進(jìn)行電穿孔轉(zhuǎn)化。涂卡那霉素抗性平板培養(yǎng)過夜，挑取6–10個(gè)較小的單克隆，小量制備質(zhì)粒后用Ⅰ進(jìn)行酶切并凝膠電泳鑒定。如圖3所示，酶切產(chǎn)生3.5 kb或4 kb左右的條帶即為陽性克隆，證明重組腺病毒過表達(dá)載體構(gòu)建成功，命名為pAd-miR-22。將pAd-miR-22轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，大量提取質(zhì)粒并純化。

2.3 重組腺病毒顆粒的產(chǎn)生及大量擴(kuò)增

取4 μg純化的pAd-miR-22質(zhì)粒，用Ⅰ進(jìn)行酶切線性化，乙醇沉淀回收DNA后用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染對數(shù)生長期的293A細(xì)胞，48–72 h左右可以觀察到綠色熒光蛋白(GFP)的表達(dá)。5–7 d后觀察到所有細(xì)胞均有GFP的表達(dá)，并逐漸出現(xiàn)擴(kuò)增斑。如圖4所示，大約2周左右，50%的細(xì)胞變圓并漂起，收集細(xì)胞，液氮/ 37 ℃水浴反復(fù)凍融4次，離心收集上清，即重組miR-22過表達(dá)腺病毒。取少量含有重組腺病毒的細(xì)胞培養(yǎng)基上清，感染對數(shù)生長期的新鮮293A細(xì)胞，對腺病毒進(jìn)行擴(kuò)增。

圖3 重組腺病毒載體的PacⅠ酶切鑒定

圖4 重組腺病毒在293A細(xì)胞中的包裝及綠色熒光蛋白的表達(dá)

2.4 miR-22在HepG2細(xì)胞中的表達(dá)分析

培養(yǎng)HepG2細(xì)胞，分別感染Ad-GFP和Ad-miR-22腺病毒，24 h和48 h后分析miR-22表達(dá)水平。如圖5所示，與對照組相比，感染Ad-miR-22后，細(xì)胞內(nèi)miR-22表達(dá)水平顯著升高(<0.05)。

2.5 miR-22對肝細(xì)胞糖異生及葡萄糖攝取的抑制

進(jìn)一步分析了過表達(dá)miR-22對肝細(xì)胞糖異生及葡萄糖攝取的影響，HepG2細(xì)胞分別感染Ad-GFP和Ad-miR-22后熒光定量PCR分析糖異生關(guān)鍵基因表達(dá)，或血清饑餓3 h對細(xì)胞同步化，胰島素及2-NBDG處理細(xì)胞30 min，熒光酶標(biāo)儀檢測葡萄糖攝取。如圖6A所示，Ad-miR-22處理顯著誘導(dǎo)糖異生關(guān)鍵酶PEPCK和G6Pase基因mRNA表達(dá)。而過表達(dá)miR-22顯著抑制基礎(chǔ)及胰島素刺激的HepG2細(xì)胞葡萄糖攝取(圖6B)。此外，我們研究了過表達(dá)miR-22對正常肝細(xì)胞L02葡萄糖攝取的影響，得到了類似的結(jié)果，過表達(dá)miR-22顯著抑制了L02細(xì)胞葡萄糖的攝取(圖6C)。以上研究結(jié)果表明miR-22可能抑制肝細(xì)胞葡萄糖代謝。

圖5 熒光定量PCR分析miR-22表達(dá)水平

2.6 miR-22對肝細(xì)胞糖原合成的抑制

肝細(xì)胞在調(diào)節(jié)機(jī)體葡萄糖代謝過程中發(fā)揮了重要作用，進(jìn)食后胰島素會(huì)增加肝細(xì)胞糖原合成，從而維持正常血糖水平。本研究最后分析了過表達(dá)miR-22對肝細(xì)胞糖原合成的影響。如圖7A所示，過表達(dá)miR-22對基礎(chǔ)糖原合成沒有顯著影響，但對胰島素刺激的糖原合成有顯著抑制作用。同樣，我們在正常肝細(xì)胞L02中得到類似的結(jié)果，miR-22過表達(dá)顯著抑制胰島素誘導(dǎo)的糖原合成(圖7B)。

2.7 miR-22對GSK-3β磷酸化及SIRT1蛋白質(zhì)表達(dá)的抑制

如圖8所示，與對照組相比較，腺病毒介導(dǎo)的過表達(dá)miR-22顯著抑制胰島素刺激的GSK3β磷酸化，并降低SIRT1蛋白表達(dá)水平。

圖6 過表達(dá)miR-22抑制糖異生及葡萄糖吸收

圖7 過表達(dá)miR-22抑制胰島素誘導(dǎo)的糖原合成

圖8 過表達(dá)miR-22抑制GSK3β磷酸化及SIRT1蛋白表達(dá)

3 討論

在生理?xiàng)l件下，機(jī)體糖代謝的調(diào)節(jié)主要依靠肝臟、脂肪和肌肉三大代謝組織來完成[18]。進(jìn)食后，胰島素分泌增加，促進(jìn)肌肉和肝臟攝取葡萄糖，并轉(zhuǎn)化為肌糖原和肝糖原進(jìn)行儲存[19]。同時(shí)，脂肪細(xì)胞在胰島素的刺激下葡萄糖攝取增加，并最終轉(zhuǎn)變?yōu)橹具M(jìn)行存儲[20]。機(jī)體對葡萄糖的轉(zhuǎn)運(yùn)主要通過細(xì)胞膜上的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(GLUT1–4) 來完成[21]，其中肝臟主要由GLUT2負(fù)責(zé)葡萄糖的轉(zhuǎn)運(yùn)。對葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白結(jié)構(gòu)的解析以及對其表達(dá)調(diào)控的研究一直是糖代謝研究的熱點(diǎn)領(lǐng)域[22-26]，然而由于人GLUT2屬于膜蛋白，結(jié)構(gòu)特殊，解析其三維結(jié)構(gòu)極具挑戰(zhàn)性，導(dǎo)致人類對其三維結(jié)構(gòu)知之甚少。由于2型糖尿病發(fā)病機(jī)制非常復(fù)雜，目前尚未完全研究清楚。已經(jīng)上市的治療藥物較多，但基本難以完全治愈。2型糖尿病在我國的發(fā)病率正呈逐年增長趨勢，嚴(yán)重影響我國居民健康，進(jìn)一步揭示其發(fā)病機(jī)制，尋找新的治療靶點(diǎn)將為抗2型糖尿病新藥研發(fā)提供新的思路。

microRNAs是一類小分子量非蛋白質(zhì)編碼RNA，研究表明其在糖代謝過程中扮演了重要角色。最近有研究顯示，miR-22在db/db糖尿病模型小鼠肝臟表達(dá)水平顯著升高，提示miR-22可能參與了肝細(xì)胞葡萄糖代謝，并可能與肝細(xì)胞胰島素抵抗密切相關(guān)[27]。目前用于基因投遞的方式主要分為脂質(zhì)體、陽離子聚合物等介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染和病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染，前者轉(zhuǎn)染效率低且不穩(wěn)定，對細(xì)胞損傷較大，血清對轉(zhuǎn)染效率影響較大。而病毒載體如腺病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染不僅效率高，而且對細(xì)胞無損傷，血清對轉(zhuǎn)染效率影響較小，此外還可以在動(dòng)物水平進(jìn)行高效轉(zhuǎn)染。因此，我們設(shè)計(jì)構(gòu)建了新的miR-22腺病毒表達(dá)載體，希望通過腺病毒載體在肝細(xì)胞過表達(dá)miR-22，分析其對肝細(xì)胞糖異生、葡萄糖攝取及糖原合成的影響，揭示miR-22調(diào)節(jié)肝糖代謝的分子機(jī)制。同時(shí)，為動(dòng)物水平研究miR-22的功能提供了可靠的載體系統(tǒng)。在載體構(gòu)建過程中，如圖2所示，泳道1和2對應(yīng)的小分子量目標(biāo)條帶較弱，主要是因?yàn)檩d體的分子量大約為9 000 bp，而插入的小分子量目標(biāo)條帶只有480 bp，導(dǎo)致上下兩條帶的亮度差異較大。

本研究結(jié)果表明，過表達(dá)miR-22顯著抑制基礎(chǔ)及胰島素刺激的HepG2細(xì)胞葡萄糖攝取，但miR-22是否影響了葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)或膜定位還需要進(jìn)一步的研究。之前的研究顯示，miR-22能夠增加肝細(xì)胞糖異生，進(jìn)而影響其葡萄糖輸出，而過度激活的肝糖異生與2型糖尿病密切相關(guān)，這些研究結(jié)果與我們的數(shù)據(jù)相一致。

最近的研究顯示，miR-22參與了多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程[28-31]，體內(nèi)和體外研究均表明miR-22能調(diào)節(jié)這些腫瘤細(xì)胞的增殖與凋亡，但機(jī)制尚未研究清楚。腫瘤細(xì)胞與正常細(xì)胞的區(qū)別在于，其增殖失控，需要更多的糖來維持高代謝活性，miR-22可以調(diào)節(jié)細(xì)胞葡萄糖攝取，是否與其在腫瘤代謝調(diào)控中的重要角色有關(guān)，還需要進(jìn)一步的探索。

綜上所述，我們構(gòu)建了miR-22的過表達(dá)腺病毒，并發(fā)現(xiàn)上調(diào)miR-22的表達(dá)水平促進(jìn)糖異生基因的表達(dá)、抑制HepG2細(xì)胞葡萄糖攝取及糖原合成，該作用可能與其調(diào)節(jié)SIRT1蛋白表達(dá)水平有關(guān)。

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Effect of recombinant adenovirus Ad-mir-22 on glucose uptake in HepG2 cells

Lihong Liao1, Wenbin Yuan2, Yong Chen2, and Jichao Liang2

1Department of Pediatrics, Zhongnan Hospital of Wuhan University, Wuhan 430071, Hubei, China 2 Hubei Province Key Laboratory of Biotechnology of Chinese Traditional Medicine, National and Local Joint Engineering Research Center of High-throughput Drug Screening Technology, Hubei University, Wuhan 430062, Hubei, China

The recombinant adenoviruses expressing miR-22 (Ad-miR-22) was constructed and the effect of Ad-miR-22 on insulin signal pathway and glucose uptake in HepG2 cells was analyzed. MiR-22 gene was amplified by PCR from human hepatocytes and cloned into the pAdTrack-CMV vector to generate the shuttle plasmid pAdT-22. The positive colonies were confirmed by PCR and sequencing. The resultant shuttle plasmid was linearized withI, followed by co-transformation into competent BJ5183 cells containing an adenoviral backbone plasmid (pAdEasy-1) to create the recombinant plasmid pAd-miR-22. After digested withI, the linearized pAd-miR-22 was transfected into 293A packaging cell line to generate recombinant adenoviruses Ad-miR-22. HepG2 cells were infected with Ad-miR-22 or control Ad-GFP (adenoviruses expressing green fluorescent protein), and then the miR-22 expression levels were analyzed by qPCR. The result shows that adenovirus-mediated overexpression of miR-22 significantly decreased insulin-induced glucose uptake in HepG2 cells. Moreover, overexpression of miR-22 markedly decreased insulin-induced phosphorylation of GSK-3β. miR-22 also increased the mRNA levels of gluconeogenic genes in HepG2 cells. Furthermore, Western blotting results indicate that the protein expression of SIRT1 decreased in Ad-miR-22 infected HepG2 cells as compared with Ad-GFP infected HepG2 cells. In summary, overexpressing of miR-22 significantly increased gluconeogenesis while decreased glucose uptake in HepG2 cells. The effect of miR-22 on glucose metabolism may be mediated by SIRT1.

miR-22, recombinant adenoviruses, glucose uptake, gluconeogenesis, gene therapy, SIRT1

August 2, 2019;

December 16, 2019

Supported by: National Natural Science Foundation of China (Nos. 81400791, 81300555), the Fundamental Research Funds for the Central Universities (No. 2042018kf0082).

Jichao Liang. Tel/Fax: +86-27-88663882; E-mail: liang529114@163.com

國家自然科學(xué)基金 (Nos. 81400791，81300555)，中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金 (No. 2042018kf0082) 資助。

10.13345/j.cjb.190346

廖立紅, 袁文彬, 陳勇, 等. MiR-22重組腺病毒的構(gòu)建及對HepG2細(xì)胞葡萄糖攝取的影響. 生物工程學(xué)報(bào), 2020, 36(4): 763–771.

Liao LH, Yuan WB, Chen Y, et al. Effect of recombinant adenovirus Ad-mir-22 on glucose uptake in HepG2 cells. Chin J Biotech, 2020, 36(4): 763–771.

(本文責(zé)編 郝麗芳)